Metodi elettrofisiologici per la registrazione Potenziali Synaptic dal NMJ Larve di Drosophila

Produrre registrazioni elettrofisiologiche stabili dalle giunzioni neuromuscolari della larva di Joof. Per prima cosa, sezionare una larva per esporre la parete del corpo, i muscoli e il sistema nervoso prima della registrazione. Gli assoni alla base del SNC sono tagliati posteriormente al ganglio ventrale.

Quindi un elettrodo di registrazione viene posizionato sul muscolo di interesse e un elettrodo stimolante viene posizionato vicino ai motoneuroni innervati. Gli assoni recisi dei motoneuroni vengono aspirati nella pipetta stimolante. I potenziali di giunzione eccitatori possono quindi essere registrati.

Ciao, sono Wendy MLA del McCabe Lab del Dipartimento di Fisiologia e Biofisica Cellulare della Columbia University. Oggi vi mostreremo una procedura per misurare la trasmissione dei tic alla giunzione neuromuscolare della lava GE. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la fisiologia sinaptica e la neurotrasmissione.

Quindi iniziamo. Per iniziare l'esperimento, seziona le larve della terza e della stella per esporre la parete del corpo. Questo protocollo viene modificato per esperimenti elettrofisiologici utilizzando perni di dissezione corti.

Questi sono lunghi da due a quattro millimetri e hanno meno probabilità di colpire l'obiettivo del microscopio negli elettrodi durante l'esperimento. Dopo aver esposto la parete del corpo, usa una pinza per tenere il SNC e sollevarlo leggermente. Quindi tagliare gli assoni motori dei nervi periferici e rimuovere il cervello.

Dopo aver rimosso il cervello, lavare la preparazione sezionata due volte con tampone HL 3.1 con un millimolare di calcio. Ora che la dissezione è completa, le registrazioni intracellulari possono essere effettuate dalle cellule muscolari larvali. Posizionare la piastra di dissezione sul microscopio elettrofisiologico e immergere la preparazione con tampone HL 3.1 più calcio.

Quindi fissare l'elettrodo del bagno in modo che sia a contatto con la soluzione. L'elettrodo di aspirazione viene utilizzato per stimolare i nervi periferici che innervano il muscolo. Posizionare prima l'elettrodo di aspirazione nel piatto per evitare vibrazioni quando l'elettrodo intracellulare viene posizionato sul muscolo.

Una volta che l'elettrodo è nel piatto, posizionalo vicino al motoneurone che innerva il muscolo sei. Nel terzo segmento addominale, aspirare delicatamente fino a quando il nervo tagliato non si trova all'interno della pipetta di vetro. Fare attenzione a non allungare i nervi quando si applica l'aspirazione.

Sollevare leggermente la pipetta in modo che non tocchi il muscolo. E poi posizionarlo in modo che non tiri le fibre nervose tagliate. Una volta posizionato l'elettrodo di aspirazione, posizionare l'elettrodo di registrazione per le registrazioni intracellulari.

Utilizzare un microelettrodo affilato riempito con cloruro di potassio a tre molari. Posizionare l'elettrodo di registrazione sopra il centro del muscolo sei. Regolare l'offset di input in modo che legga zero per la soluzione del bagno.

Abbassare lentamente l'elettrodo e avvicinarsi al muscolo con un ingrandimento ottico elevato fino a toccare la superficie muscolare. Per confermare che il muscolo è stato penetrato, osservare l'oscilloscopio. Il potenziale di membrana a riposo deve essere di almeno 60 millivolt negativi.

Il potenziale sporadico di nplate in miniatura dovrebbe ora essere visibile. Una volta posizionato l'elettrodo di registrazione, lasciare che le celle si stabilizzino per un minuto. Prima di iniziare le registrazioni, utilizzare un assone HS two, uno stadio di testa in un amplificatore B axle clamp two per rilevare le variazioni del potenziale di membrana.

Il morsetto dell'asse due B è l'interfaccia con un computer che esegue il software del morsetto P attraverso i dati numerici. 1322 A, che digitalizza il segnale. Registrare il potenziale di membrana su un PC. Con il software clamp X, applica stimoli all'assone motorio per generare potenziali eccitatori di membrana o ejs.

Una volta generati gli ejs, registra gli ejs in miniatura per un periodo di tre minuti senza sinapsi di stimoli. Il software di analisi soft mini può essere utilizzato per analizzare le tracce e determinare l'ampiezza e la frequenza del mini EJP. Per generare ejs.

Usa un generatore di impulsi master eight per stimolare fino all'estremità recisa di un programma di motoneuroni. Il generatore per erogare un programma di impulsi di tensione quadra di 0,3 millisecondi. Un intervallo di tempo di cinque secondi tra gli stimoli per consentire il recupero sinaptico.

Alla NMJ registrare almeno 10 potenziali evocati da ciascun muscolo e fare la media delle ampiezze. Questa figura mostra una tipica traccia registrata dal muscolo sei di una larva di sal wild type con risposte EJP evocate e mini EJ.PS Abbiamo appena mostrato come registrare i potenziali cy dalla giunzione neuromuscolare della lava di drosophila. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di completare la dissezione entro tre-10 minuti e di avviare immediatamente le registrazioni elettrofisiologiche quando le cellule sono ancora sane e reattive.

Se la dissezione richiede troppo tempo, il potenziale di membrana a riposo delle cellule muscolari sarà inferiore a meno 60 millivolt, che è troppo basso per essere registrato. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.