Valutazione dell'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari muscolari longitudinali dorsali in Drosophila

Iniziare con i torace di Drosophila wild-type e transgenici fissati chimicamente in un tampone.

Nei toracei transgenici, le giunzioni neuromuscolari dei muscoli longitudinali dorsali contengono neuroni che esprimono una proteina mutante che induce la neurodegenerazione.

Rimuovere il tampone e congelare rapidamente i toracei per evitare danni ai tessuti durante la bisezione.

Aggiungere un tampone fresco e trasferire i torali nelle piastre di dissezione.

Posiziona un torace con il lato ventrale rivolto verso l'alto e rimuovi i gruppi di cellule nervose per esporre la linea mediana.

Dividere in due lungo la linea mediana per ottenere emitorace.

Rimuovere il tessuto in eccesso.

Incubare gli emitoracei in un tampone bloccante per permeabilizzare le membrane e prevenire il legame di anticorpi non specifici.

Aggiungere anticorpi coniugati con fluorofori che hanno come bersaglio una glicoproteina espressa nei neuroni NMJ e nei filamenti di actina muscolare.

Rimuovere gli anticorpi non legati.

Disporre gli emitoraces su un vetrino a ponte, aggiungere il supporto di montaggio e montare i tessuti.

Visualizza al microscopio.

Rispetto al wild-type, i mutanti mostrano una ridotta colorazione neu