Valutazione dell'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari muscolari longitudinali dorsali in Drosophila

Iniziare con i torace di Drosophila wild-type e transgenici fissati chimicamente in un tampone.

Nei toracei transgenici, le giunzioni neuromuscolari dei muscoli longitudinali dorsali contengono neuroni che esprimono una proteina mutante che induce la neurodegenerazione.

Rimuovere il tampone e congelare rapidamente i toracei per evitare danni ai tessuti durante la bisezione.

Aggiungere un tampone fresco e trasferire i torali nelle piastre di dissezione.

Posiziona un torace con il lato ventrale rivolto verso l'alto e rimuovi i gruppi di cellule nervose per esporre la linea mediana.

Dividere in due lungo la linea mediana per ottenere emitorace.

Rimuovere il tessuto in eccesso.

Incubare gli emitoracei in un tampone bloccante per permeabilizzare le membrane e prevenire il legame di anticorpi non specifici.

Aggiungere anticorpi coniugati con fluorofori che hanno come bersaglio una glicoproteina espressa nei neuroni NMJ e nei filamenti di actina muscolare.

Rimuovere gli anticorpi non legati.

Disporre gli emitoraces su un vetrino a ponte, aggiungere il supporto di montaggio e montare i tessuti.

Visualizza al microscopio.

Rispetto al wild-type, i mutanti mostrano una ridotta colorazione neuronale, indice di neurodegenerazione, mentre i muscoli mostrano una fluorescenza intatta.

Prima di iniziare le bisezioni, indossare guanti crioprotettivi e occhiali di sicurezza e riempire una fiaschetta Dewar con azoto liquido. Usa un rompilama per afferrare una lama di piuma ad angolo e piega la lama per rompere un piccolo pezzo. Utilizzare il rompilama per bloccare la lama in posizione e utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per rimuovere tutto il PBS dalle provette del campione.

Utilizzare una pinzetta criogenica per immergere i tubi nel pallone di azoto liquido. Dopo 10 secondi, utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere circa 300 microlitri di PBS ghiacciato a ciascuna provetta su ghiaccio e posizionare un torace con il lato ventrale rivolto verso l'alto in una capsula di dissezione rivestita in elastomero siliconico di 10 centimetri contenente PBS ghiacciato. Usa un paio di pinze smussate per posizionare il torace e un paio di pinze sottili per rimuovere parte dei gangli toracici per esporre la linea mediana del torace.

Usando la linea mediana del torace come guida, usa la lama per eseguire un taglio poco profondo attraverso un terzo del torace e usa la pinza smussata per posizionare il torace con un angolo di 45 gradi. Utilizzare la lama per tagliare dritto lungo la linea mediana del torace per ottenere due emotorace e per eseguire con cura uno o due tagli per rimuovere il tessuto in eccesso senza danneggiare i muscoli longitudinali dorsali. Quindi, posizionare i campioni di tessuto muscolare in una provetta di PBS adeguatamente etichettata.

Quando tutti i campioni di torace sono stati divisi in due, permeabilizzare i tessuti nel tampone bloccante per almeno un'ora a 4 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, agitare la soluzione di colorante strutturale appena preparata e aggiungere 150 microlitri di colorante a ciascun campione per un'incubazione di due ore su un rotatore a temperatura ambiente al buio. Dopo la colorazione, lavare i campioni in PBST e posizionare cinque etichette di rinforzo impilate e tagliate a metà, a 15 millilitri di distanza, su un vetrino da microscopio.

Utilizzare una punta per micropipetta modificata per trasferire i torace su ciascun vetrino e utilizzare una salvietta da laboratorio per rimuovere l'eccesso di PBST. Utilizzare una pinza per disporre i campioni in modo che i torace siano rivolti verso il muscolo rivolto verso l'alto. Quando i campioni sono orientati correttamente, utilizzare un puntale per pipetta da 200 microlitri per applicare 70 microlitri di terreno di montaggio su ciascun vetrino e coprire ogni vetrino con un vetrino coprioggetti. Quindi, usa lo smalto per rivestire generosamente i bordi esterni dei vetrini coprioggetti per ottenere una tenuta completa attorno a ciascun fazzoletto.