Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di amplificare con la PCR i siti di integrazione retrovirale dal DNA genomico di massa e sequenziare la libreria di DNA risultante, in modo tale da poter mappare posizioni di integrazione precise su un genoma di riferimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in retrovirologia di base e clinica analizzando la distribuzione dei siti di integrazione in un genoma ospite. Il vantaggio principale di questa tecnica è la profondità di sequenziamento del DNA e il fatto che molti campioni possono essere multiplexati in un'unica corsa di sequenziamento.

Un giorno prima della trasfezione, la piastra 3,3 volte 10-HEK293T 6 cellule in 10 millilitri di Dulbecco's Modified Eagle's Medium integrato in ciascuna delle cinque piastre da 100 millimetri. Il giorno successivo, utilizzare reagenti di trasfezione disponibili in commercio o fosfato di calcio per trasfettare le cellule con 10 microgrammi di cloni molecolari retrovirali a lunghezza intera trasportatori di plasmidi o nove microgrammi di vettori rotondi singoli elisi avvolti più un microgrammo di un costrutto di espressione VSV-G. Aggiungere il composto al terreno di coltura nel senso gocciolato.

Dopo la trasfezione, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari umidificato con il 5% di anidride carbonica. Dopo circa 48 ore, raccogliere il terreno cellulare contenente il virus utilizzando una pipetta volumetrica e farlo passare attraverso un filtro da 0,45 micron mediante flusso per gravità. Successivamente, concentrare il virus mediante ultracentrifugazione a 200.000 Gs per un'ora a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante fino a quando rimangono circa 500 microlitri di DMEM FPS e risospendere il pellet virale. Aggiungere 20 unità di DNasi e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Determinare la concentrazione di p24 utilizzando un kit di cattura dell'antigene HIV-1 p24 secondo le istruzioni del produttore.

Il giorno prima dell'infezione, la piastra 3,0 volte 10-5 HEK293T cellule in 2,5 millilitri di DMEM FPS per pozzetto in una piastra a sei pozzetti e incubare per una notte in un incubatore per colture tissutali. Infettare le cellule con una concentrazione virale finale di p24 di 500 nanogrammi per millilitro in 500 microlitri di DMEM FPS fresco. Incubare per due ore in un incubatore per colture tissutali.

Dopo due ore, aggiungere due millilitri di DMEM FPS preriscaldato a 37 gradi Celsius in ciascun pozzetto e rimettere la piastra nell'incubatore. 48 ore dopo l'infezione, rimuovere il terreno e lavare le cellule con due millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Raccogliere le cellule aggiungendo 0,5 millilitri di tripsina-EDTA preriscaldato a 37 gradi Celsius e, dopo alcuni secondi, ispezionare visivamente i pozzetti per verificare la presenza di dislocazione cellulare.

Successivamente, aggiungere due millilitri di DMEM FPS preriscaldato e risospendere le cellule pipettando delicatamente su e giù 10 volte con una pipetta volumetrica. Trasferire la soluzione in un pallone di coltura tissutale da 75 centimetri quadrati contenente 18 millilitri di DMEM FPS preriscaldato e rimetterla nell'incubatore per colture tissutali. Almeno cinque giorni dopo l'infezione, raccogliere le cellule come prima e risospendere in cinque millilitri di DMEM FPS preriscaldato mediante pipettaggio.

Centrifugare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente a 2.500 Gs, quindi aspirare ed eliminare il surnatante. Infine, estrarre il DNA genomico dal pellet cellulare utilizzando un kit disponibile in commercio. Eluire il DNA dalla colonna a scambio ionico in dotazione con 200 microlitri di Tris-HCL millimolare a pH 8,5.

Dopo la sonicazione del DNA genomico, purificare il DNA sonicato utilizzando un kit di purificazione PCR. Quindi, ripara il DNA utilizzando un kit di riparazione finale. Dopo la purificazione del DNA come prima, A coda il DNA utilizzando l'enzima Klenow Exo-Minus.

In alternativa, per la frammentazione mediante digestione endonucleasica di restrizione, tagliare il DNA genomico con un cocktail di enzimi che generano sporgenze di 5'TA, nonché un enzima incompatibile come il BglII che si sfalda a valle dell'LTR virale a monte. Tagliare 10 microgrammi di DNA genomico in un volume finale di 100 microlitri. Incubare per una notte a 37 gradi Celsius.

Assicurarsi che il DNA finale venga ripulito utilizzando il kit di purificazione PCR. Il linker da utilizzare con il DNA sonicato deve contenere una sporgenza T 3' compatibile, mentre il linker per il DNA digerito MseI deve contenere una sporgenza compatibile 5'TA. Iniziare ricuocendo 10 micromolari dei filamenti di linker corti e lunghi in 35 microlitri di tampone Tris-HCL EDTA riscaldando a 90 gradi Celsius e raffreddando lentamente a temperatura ambiente con incrementi di un grado Celsius al minuto.

Successivamente, preparare almeno quattro reazioni di legatura parallele per campione di DNA genomico contenente 1,5 linker legati micromolari, un microgrammo di DNA frammentato e 800 unità di DNA ligasi T4 in un volume finale di 50 microlitri. Ligate durante la notte a 12 gradi Celsius. Per i campioni preparati mediante sonicazione, digerire la reazione di legatura purificata con un enzima di restrizione che si scinde a valle dell'LTR a monte.

Utilizzare 100 unità dell'enzima appropriato nelle condizioni raccomandate dal produttore durante la notte. Assicurarsi che i prodotti finali siano purificati utilizzando un kit di purificazione PCR. Preparare il primo ciclo di PCR utilizzando i reagenti mostrati qui.

Eseguire il primo ciclo di PCR utilizzando i seguenti parametri: 94 gradi Celsius per due minuti, seguiti da 30 cicli di 94 gradi Celsius per 15 secondi, 55 gradi Celsius per 30 secondi, 68 gradi Celsius per 45 secondi. Terminare con 68 gradi Celsius per 10 minuti. Raggruppa le reazioni del primo round e purifica il DNA come prima.

Quindi preparare il secondo ciclo di PCR contenente i reagenti mostrati qui. Utilizzare gli stessi parametri ciclici del primo ciclo di PCR. Dopo aver raggruppato e purificato il DNA dalla reazione del secondo round, eseguire il controllo di qualità e il sequenziamento di nuova generazione e analizzare i siti di integrazione utilizzando le istruzioni dettagliate nella parte scritta del protocollo.

I siti di integrazione delle librerie preparate mediante digestione con enzimi di restrizione, come mostrato a sinistra, o sonicazione, come mostrato a destra, sono stati allineati utilizzando il software del logo web. Ogni diluizione nella serie di titolazione è raffigurata, dal DNA pulito nella parte superiore della figura, alla diluizione massima da uno a 15, 625 nella parte inferiore. Il grado di certezza diminuisce con l'aumentare della diluizione del DNA delle cellule infette.

Questa immagine mostra il logo della sequenza per il controllo casuale abbinato di 50.000 siti genomici unici. Si noti che i siti casuali allineati dal set di dati MRC, al contrario, non sono riusciti a generare livelli apprezzabili di preferenze di base. Una volta padroneggiate, le librerie del sito di integrazione possono essere preparate dal DNA genomico in tre giorni.

La mappatura del sito di integrazione, dall'infezione iniziale alla bioinformatica completata, può quindi essere completata in circa due settimane. Seguendo questa procedura, è possibile catalogare migliaia o addirittura milioni di siti di integrazione retrovirale unici e condurre diverse analisi per quantificare le associazioni tra i siti di inserimento e le annotazioni genomiche.