Name: Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Impara ad amplificare e sequenziare siti di integrazione retrovirali da DNA genomico di cellule HEK293T. Questo metodo bioinformatico consente di mappare con precisione le posizioni virali nel genoma ospite.

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Siamo grati ai nostri colleghi Stephen Hughes e Henry Levin per un consiglio che è stato fondamentale per stabilire il protocollo di NGS per retrovirale sito di integrazione sequenziamento in laboratorio Engelman. Questo lavoro è stato sostenuto da Stati Uniti National Institutes of Health concede AI039394 e AI052014 (a ANE) e AI060354 (Harvard University Center for AIDS Research).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un protocollo per l&#39;analisi dei siti di integrazione retrovirali, dalla fase virus iniziale fino mappatura dei modelli di distribuzione genomici, è descritto. Questo protocollo è applicabile a qualsiasi retrovirus e qualsiasi tipo di cellula infettabili. Inoltre, la conduttura dosaggio è molto sensibile, con la possibilità di recuperare un numero soddisfacente di integrazione siti unici da diluizioni seriali di DNA genomico equivalente a quella di una infezione avviato con una MOI di 6,4 x 10 -5. Questa s...

L&#39;integrazione del DNA virale (vDNA) nel genoma della cellula ospite è un passo essenziale nel ciclo di vita retrovirale. L&#39;integrazione viene eseguita l&#39;integrasi virale (IN), che svolge due processi catalitici distinti che portano alla creazione del provirus stabilmente inserita 1. IN subunità impegnare le estremità della vDNA lineare che viene generato attraverso trascrizione inversa, formando la intasome ordine superiore con vDNA estremità tenuto insieme da un multimero IN 2-4. IN unirà &#39;estremità del vDNA valle invarianti 5&#39;-CA-3&#39; del 3 sequenze in un processo noto come 3&#39;-processing, lasciando incasso 3 &#39;termina con gruppi ossidrile reattivi ad ogni vDNA capolinea 5-8. Il intasome viene successivamente importato nel nucleo come parte di una grande assemblea di host e proteine ​​virali conosciuti come il complesso preintegrazione (PIC) 9-11. Dopo aver incontrato bersaglio cellulare del DNA (tDNA), IN utilizza il vDNA 3&#39;-idrossile group per fendere l&#39;alto tDNA e fili di fondo in modo sfalsato e, contemporaneamente, si unisce la vDNA di tDNA 5 &#39;gruppi fosfato attraverso il processo di trasferimento strand 12,13. preferenze del sito di integrazione mostra retrovirus sulle scale locale e globale. Localmente, siti di integrazione consenso consistono debolmente conservati sequenze palindromi tDNA che si estendono da circa 9:55 bp a monte ed a valle dei siti di inserzione vDNA 14,15. A livello globale, i retrovirus bersaglio specifiche annotazioni della cromatina 16. Ci sono sette diversi generi retrovirale - alpha attraverso epsilon, lenti, e spuma. I lentivirus, che comprendono l&#39;HIV-1, favoriscono l&#39;integrazione in seno agli organi di geni attivamente trascritti 17, mentre i gammaretroviruses preferenzialmente si integrano all&#39;interno di siti o di trascrizione di inizio (Tsss) e regioni enhancer attivi 18-20. In netto contrasto, spumavirus è fortemente sbilanciata verso heterochromregioni ATIC, come ad esempio i domini lamina associata gene-poveri 21. Preferenze di base tDNA locali sono in gran parte dettato da specifiche reti di contatti nucleoproteici tra IN e tDNA 13,22,23. Per i lentivirus e gammaretroviruses, l&#39;integrazione relativa alle annotazioni genomiche è in gran parte governato da interazioni tra IN e fattori cellulari affini 24-27. Alterare le specifiche di interazione di rete IN-tDNA 13,22,23,28 e interrompere o re-engineering IN-host interazioni tra fattori 25-27,29-32 hanno dimostrato strategie per retarget l&#39;integrazione a livello locale e globale, rispettivamente. Il potere delle procedure di sequenziamento del DNA utilizzate per catalogare i siti di integrazione retrovirali è aumentata enormemente negli ultimi decenni. Siti di integrazione sono stati recuperati in un lavoro pionieristico con la purificazione laborioso e tecniche di clonazione manuali per produrre solo una manciata di siti unici al 33,34 studio.La combinazione di LM-PCR amplificazione del DNA giunzioni LTR-ospite con la possibilità di mappare singoli siti di integrazione a genomi progetti topo umani e trasformate campo, con il numero di siti recuperati da infezioni cellule di coltura tissutale esogeno aumentando a diverse centinaia di migliaia 17 , 18. La recente fusione di più di LM-PCR con metodologia NGS ha inviato profondità biblioteca alle stelle. In particolare, pyrosequencing ha dato l&#39;ordine di decine di migliaia di siti di integrazione unici 30,35-38, mentre le librerie in sequenza attraverso l&#39;uso di cluster DNA può produrre milioni di sequenze uniche 19-21,39. Qui si descrive un protocollo ottimizzato LM-PCR per amplificare e sequenziare siti di integrazione retrovirali che utilizzano NGS di clustering DNA. Il metodo incorpora richiesto sequenze di adattamento nei primer PCR e, quindi, direttamente nelle molecole di DNA amplificati, precludendo in tal modo la necessità di un passaggio adattatore legatura aggiuntivo prima Sequencing 40. L&#39;analisi bioinformatica gasdotto, dalla analisi dei dati di sequenziamento prime per LTR-ospite DNA giunzioni alla mappatura dei siti di integrazione uniche osservazione a caratteristiche genomiche, è anche generalmente descritto. In conformità con la priorità stabilita da precedenti protocolli metodologici in questo campo 36,38,41-43, script personalizzati possono essere sviluppati che contribuisca alla realizzazione di interventi specifici in cantiere bioinformatica. L&#39;utilità e la sensibilità del protocollo è illustrato con dati rappresentativi amplificando, sequenziamento, e mappatura HIV-1 siti di integrazione da colture cellulari infettate alla molteplicità approssimativa di infezione (MOI) di 1,0, nonché una serie di titolazione di questo DNA diluita attraverso DNA cellulare non infetta in 5 volte procedura a una diluizione di 1: 15,625 per dare il approssimativa equivalente MOI di 6,4 x 10 -5.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>Terreno di coltura cellulare standard, compatibile con cellule HEK293T</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>Potrebbe essere necessario effettuare un pre-screening di diversi lotti di siero per una produzione virale ottimale</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Antibiotici da aggiungere alla</td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato</td> DMEM <td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>Utilizzato per lavare le cellule</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td>Utilizzato per staccare le cellule aderenti dalle piastre di coltura tissutale</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td>Reagente di trasfezione del DNA</td></tr><tr><td>0,45 &; m Filtri</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>Utilizzato per filtrare terreni di coltura cellulare contenenti particelle virali</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>Utilizzato per degradare il DNA plasmidico di carryover da stock virali</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Antigen Capture Assay</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>Utilizzato per quantificare la resa della produzione virale</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit di tessuti</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Utilizzato per purificare il DNA genomico dalle cellule</td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>Con questo modello di sonicatore si eseguono due cicli di ciclo di lavoro, 5%; intensità, 3; cicli per raffica, 200; tempo, 80 sec</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td> Si <td>consiglia di utilizzare l'acqua disponibile in commercio per ridurre la possibilità di contaminazione incrociata del campione</td></tr><tr><td>Purificazione QIAQuick PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Utilizzato per purificare il DNA durante la costruzione della libreria</td></tr><tr><td>End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Epicentre</td><td>ER81050</td><td>Utilizzato per riparare le estremità del DNA di campioni di DNA sonicati</td></tr><tr><td>Frammento di Klenow (3'-5' exo&ndash;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0212S</td><td>Utilizzato con dATP a frammenti di DNA riparati con coda A</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0141</td><td>Deossiadenosina trifosfato</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>Endonucleasi di restrizione per la scissione genomica del DNA</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>Endonucleasi di restrizione per sopprimere l'amplificazione della sequenza HIV-1 U5 a monte T4</td></tr><tr><td>DNA Ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>Enzima per l'unione covalente di estremità di DNA compatibili</td></tr><tr><td>Oligonucleotidi di DNA Tecnologie</td><td>di DNA integrate</td><td>su misura</td><td>Chiedi all'azienda di purificare gli oligo. La purificazione HPLC è sufficiente per i DNA < 30 nucleotidi; PAGE purifica i DNA più a lungo&nbsp;</td></tr><tr><td>Advantage 2 Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639202</td><td>Miscela commerciale contenente DNA polimerasi per PCR</td></tr><tr><td>dNTP (soluzioni da 100 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td>Diluire le quattro sostanze chimiche su ghiaccio con acqua sterile per raggiungere le concentrazioni intermedie di 2,5 mM ciascuna dNTP</td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>per la determinazione della concentrazione</td></tr> <tr><td>di DNAFluorimetro Qubit Life</td><td>Technologies</td> Fluorimetro <td>Qubit&reg; 3.0</td><td>utilizzato per confermare la concentrazione di DNA nella libreria del sito</td></tr><tr><td>di integrazione 2200 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>Saggio basato su nastro per confermare la distribuzione dimensionale del DNA della libreria del sito di integrazione</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>Utilizzato per NGS</td></tr></tbody></table>

amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e dna genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

preferenze di integrazione firma retrovirus presentano su entrambi i scala locale e globale. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per (1) generazione di diverse librerie di siti di integrazione retrovirali che utilizzano amplificazione PCR legatura-mediata (LM-PCR) e di sequenziamento di prossima generazione (NGS), (2) la mappatura della posizione genomica di ogni virus- ospitare giunzione con BEDTools, e (3) analizzare i dati per rilevanza statistica. Il DNA genomico estratto da cellule infette è frammentata mediante digestione con enzimi di restrizione o mediante ultrasuoni. Dopo adatto DNA finale di riparazione, linker a doppio filamento sono legatura sul conclude il DNA, e semi-nested PCR è condotta utilizzando primer complementari sia per il long terminal repeat (LTR) fine del virus e il DNA linker legatura. I primer PCR portano sequenze necessarie per il clustering DNA durante NGS, negando la necessità di legatura adattatore separato. Il controllo di qualità (QC) è condotto per valutare il DNA di distribuzione dimensione del frammento e adattarsier l&#39;incorporazione del DNA prima di NGS. file di output di sequenza vengono filtrati per LTR contenenti legge, e le sequenze che definiscono il LTR e il linker sono tagliate via. sequenze di cellule ospitanti rasata vengono mappati a un genoma di riferimento utilizzando BLAT e sono filtrati per minimo 97% di identità di un unico punto di riferimento nel genoma. siti di integrazione unici sono esaminati per adiacenti nucleotidi (nt) sequenza e di distribuzione relativi a varie caratteristiche genomiche. Usando questo protocollo, le biblioteche sito di integrazione di elevata complessità possono essere costruiti da DNA genomico in tre giorni. L&#39;intero protocollo che comprende infezione virale esogena di cellule di coltura tissutale suscettibili di analisi sito di integrazione può quindi essere condotta in circa una o due settimane. Recenti applicazioni di questa tecnologia riguardano analisi longitudinale dei siti di integrazione da pazienti affetti da HIV.

Tabella 4 elenca i risultati di un esperimento rappresentativo per illustrare la sensibilità di NGS per il recupero di siti di integrazione da una coltura di cellule infette. DNA cellulare non infetti è stata utilizzata per diluire serialmente DNA genomico da una infezione, in cui ogni cellula in media conteneva un integrazione 40. Le diluizioni sono stati preparati a passi di cinque a una diluizione massima di 1: 15.625. DNA genomico della serie titolazione è...

Descriviamo un protocollo per amplificare i siti di integrazione retrovirale dal DNA genomico delle cellule infette, sequenziare le giunzioni virus-ospite amplificate e quindi mappare queste sequenze su un genoma di riferimento. Descriviamo anche le tecniche per quantificare la distribuzione dei siti di integrazione rispetto a varie annotazioni genomiche utilizzando BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è amplificare tramite PCR i siti di integrazione retrovirali da DNA genomico totale e sequenziare la libreria di DNA risultante, in modo da poter mappare con precisione le posizioni di integrazione su un genoma di riferimento. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella retrovirologia di base e clinica analizzando la distribuzione dei siti di integrazione all'interno del genoma dell'ospite. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella profondità del sequenziamento del DNA e nel fatto che numerosi campioni possono essere multiplexati in un'unica corsa di sequenziamento.Un giorno prima della trasfezione, seminare 3,3 × 10⁶ cellule HEK293T in 10 millilitri di mezzo di Dulbecco modificato con aggiunte (DMEM) in ciascuna di cinque piastre da 100 millimetri. Il giorno successivo, utilizzare reagenti di trasfezione disponibili in commercio o fosfato di calcio per trasfettare le cellule con 10 microgrammi di plasmide contenente cloni molecolari retrovirali a lunghezza intera oppure con 9 microgrammi di vettori singolo ciclo con involucro elisi più 1 microgrammo di un costrutto esprimente VSV-G. Aggiungere la miscela al mezzo cellulare goccia a goccia.Dopo la trasfezione, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari umidificato con il 5% di anidride carbonica. Dopo circa 48 ore, raccogliere il mezzo cellulare contenente il virus utilizzando una pipetta volumetrica e farlo passare attraverso un filtro da 0,45 micron mediante flusso per gravità. Successivamente, concentrare il virus mediante ultracentrifugazione a 200.000 G per un'ora a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante fino a quando rimangono circa 500 microlitri di DMEM FPS e risospendere il pellet virale. Aggiungere 20 unità di DNasi e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Determinare la concentrazione di p24 utilizzando un kit di cattura dell'antigene p24 dell'HIV-1 seguendo le istruzioni del produttore.Il giorno prima dell'infezione, seminare 3,0 × 10⁵ cellule HEK293T in 2,5 mL di DMEM FPS per pozzetto in una piastra a sei pozzetti e incubare tutta la notte in un incubatore per colture cellulari. Infettare le cellule con una concentrazione finale di p24 virale di 500 ng/mL in 500 µL di DMEM FPS fresco. Incubare per due ore in un incubatore per colture cellulari.Dopo due ore, aggiungere due millilitri di DMEM FPS preriscaldato a 37 gradi Celsius in ogni pozzetto e reinserire la piastra nell'incubatore. A 48 ore dall'infezione, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con due millilitri di soluzione salina fosfato tamponata. Raccogliere le cellule aggiungendo 0,5 millilitri di tripsina-EDTA preriscaldato a 37 gradi Celsius e, dopo alcuni secondi, ispezionare visivamente i pozzetti per verificare il distacco cellulare.Aggiungere successivamente due millilitri di DMEM FPS preriscaldito e risospendere le cellule pipettando delicatamente su e gi&ugrave; 10 volte con una pipetta volumetrica. Trasferire la soluzione in un'ampolla per colture cellulari da 75 centimetri quadrati contenente 18 millilitri di DMEM FPS preriscaldito e reinserire nell'incubatore per colture cellulari. Almeno cinque giorni dopo l'infezione, raccogliere le cellule come in precedenza e risospendere in cinque millilitri di DMEM FPS preriscaldato mediante pipettaggio.Centrifugare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente a 2.500 G, quindi aspirare e scartare il soprannatante. Infine, estrarre il DNA genomico dal pellet cellulare utilizzando un kit disponibile in commercio. Eluire il DNA dalla colonna di scambio ionico fornita con 200 microlitri di Tris-HCl millimolare a pH 8,5.Dopo la sonificazione del DNA genomico, purificare il DNA sonificato utilizzando un kit di purificazione PCR. Successivamente, riparare il DNA utilizzando un kit di riparazione delle estremità. Dopo la purificazione del DNA come in precedenza, aggiungere una coda A al DNA utilizzando l'enzima Klenow Exo-Minus.In alternativa, per la frammentazione mediante digestione con endonucleasi di restrizione, digerire il DNA genomico con un cocktail di enzimi che generano estremità sporgenti 5'TA, insieme a un enzima incompatibile come BglII che taglia a valle del LTR virale upstream. Digerire 10 microgrammi di DNA genomico in un volume finale di 100 microlitri. Incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius.Assicurarsi che il DNA finale venga purificato utilizzando il kit di purificazione PCR. Il linker da utilizzare con il DNA sonificato deve contenere un'estremità 3' T compatibile, mentre il linker per il DNA digerito con MseI deve contenere un'estremità 5' TA compatibile. Procedere innanzitutto all'annealing di 10 micromolar delle catene di linker corte e lunghe in 35 microlitri di tampone Tris-HCL EDTA, riscaldando a 90 gradi Celsius e raffreddando lentamente fino alla temperatura ambiente in passi di un grado Celsius al minuto.Successivamente, preparare almeno quattro reazioni di ligazione parallele per ogni campione di DNA genomico, contenenti 1,5 micromolare di linker legato, un microgrammo di DNA frammentato e 800 unità di ligasi T4 del DNA in un volume finale di 50 microlitri. Eseguire la ligazione per tutta la notte a 12 gradi Celsius. Per i campioni preparati mediante sonificazione, digerire la reazione di ligazione purificata con un enzima di restrizione che taglia a valle del LTR upstream.Utilizzare 100 unità dell'enzima appropriato nelle condizioni raccomandate dal produttore per tutta la notte. Assicurarsi che i prodotti finali siano purificati utilizzando un kit di purificazione PCR. Preparare le PCR del primo ciclo utilizzando i reagenti mostrati qui.Eseguire la PCR del primo round utilizzando i seguenti parametri: 94 gradi Celsius per due minuti, seguiti da 30 cicli di 94 gradi Celsius per 15 secondi, 55 gradi Celsius per 30 secondi, 68 gradi Celsius per 45 secondi. Concludere con 68 gradi Celsius per 10 minuti. Raccogliere le reazioni del primo round e purificare il DNA come in precedenza.Quindi preparare le PCR del secondo ciclo contenenti i reagenti mostrati qui. Utilizzare gli stessi parametri di ciclizzazione della PCR del primo ciclo. Dopo l'accumulo e la purificazione del DNA dalla reazione del secondo ciclo, eseguire il controllo di qualità e il sequenziamento di nuova generazione, quindi analizzare i siti di integrazione seguendo le istruzioni dettagliate nella parte scritta del protocollo.I siti di integrazione provenienti da librerie preparate mediante digestione con enzimi di restrizione, come mostrato a sinistra, o mediante sonificazione, come mostrato a destra, sono stati allineati utilizzando un software per la creazione di web logo. Ogni diluizione nella serie di titolazione è rappresentata, dal DNA non diluito nella parte superiore della figura fino alla diluizione massima di uno a 15 625 nella parte inferiore. Il grado di certezza diminuisce all'aumentare della diluizione del DNA delle cellule infette.Questa immagine mostra il logo della sequenza per il controllo casuale abbinato di 50.000 siti genomici unici. Si noti che i siti casuali allineati dal set di dati MRC, al contrario, non sono riusciti a generare livelli apprezzabili di preferenze di basi. Una volta acquisita padronanza della tecnica, le librerie di siti di integrazione possono essere preparate a partire da DNA genomico in tre giorni.La mappatura dei siti di integrazione, dall'infezione iniziale al completamento della bioinformatica, può quindi essere portata a termine in circa due settimane. Seguendo questa procedura, è possibile catalogare migliaia o persino milioni di siti unici di integrazione retrovirale ed eseguire analisi diversificate per quantificare le associazioni tra i siti di inserzione e le annotazioni genomiche.

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