Name: Isolamento del DNA genomico da Tails mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Impara l'estrazione del DNA genomico da biopsie di coda di topi di 10 giorni. Questo metodo standard previene la contaminazione incrociata e include tecniche di identificazione individuale per la genetica murina.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol style="margin-top: 0in"><li> Tagliare i pezzi di coda (3 mm) e le orecchie marchio. </li><li> Aggiungere 720 m l STE e 30 m l proteinasi K (10 mg / ml di brodo). </li><li> Incubare a 55 ° C sul blocco di riscaldamento e vortice ogni ora per 3 ore alla massima velocità per 10 secondi. </li><li> Inattivare proteinasi K a 70 ° C per 5 minuti. </li><li> Quench in ghiaccio per 5 minuti. </li><li> Centrifuga DNA coda per 10 minuti a piena velocità. </li><li> Decantare in nuovo tubo contenente 720 m l Isopropanolo. &nbsp; </li><li> DNA precipitato, invertendo il tubo o vortex. </li><li> Spin down del DNA per 5 minuti alla massima velocità. Rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare pellet con etanolo al 70%. </li><li> Spin down DNA genomico 5 minuti a piena velocità. Rimuovere il surnatante. </li><li> Lasciare DNA asciugare per 1-2 minuti. </li><li> Risospendere DNA in 100-200 l m a seconda delle dimensioni del pellet. </li><li> Tubo posto a 55 ° C per 1 ora per facilitare la dissoluzione del DNA. &nbsp; </li></ol>

<table><tbody><tr><td>STE</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>100 mm Tris; pH 8.5 /5 mM EDTA /0.2% SDS /200 mM NaCl / in H2O</td></tr><tr><td>TE</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 5.0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

isolamento del dna genomico da tails mouse

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento del DNA genomico da Tails mouse

Questo è un topo di 10 giorni e preleverò un campione di biopsia dalla coda per estrarre il DNA genomico dal suo tessuto caudale. Procederò tagliando una piccola porzione della coda, di circa tre millimetri, quindi inserirò il frammento di coda in una provetta einor e posizionerò la provetta su ghiaccio secco. Per evitare contaminazioni da un topo all'altro, di solito segno la lama del rasoio nella zona in cui ho effettuato l'ultimo taglio.In questo modo, per il prossimo topo, mi assicurerò di utilizzare un pezzo pulito di lama di rasoio per prelevare il successivo frammento di coda. Per distinguere tra i diversi topi della vostra nidiata, avrete bisogno di un metodo per identificarli. Un modo per farlo è praticare un foro nelle loro orecchie utilizzando un perforatore auricolare, mostrato qui.Prendere delicatamente il topo per la nuca in questo modo, girarlo e pizzicare la coda tra le dita. Prendere il foro dell'orecchio con l'altra mano ed effettuare un rapido taglio nell'orecchio del topo in quel punto. Vedi quanto è stato indolore?Ok, ora potete vedere che ho alcuni pezzi di coda in queste provette e adesso aggiungerò le soluzioni che li aiuteranno a digerire. Per prima cosa aggiungerò 720 microlitri di soluzione STE e poi aggiungerò 30 microlitri di proteina Ace K. Ecco un'immagine del pezzo di coda che abbiamo tagliato prima della digestione.Ora posizionerò i frammenti di coda su un blocco riscaldante a 55 gradi. Molti protocolli prevedono un'agitazione continua a 55 gradi, ma ai fini del mio esperimento ciò non sarà necessario poiché agiterò i frammenti di coda con un vortex. Ora agiterò il frammento di coda per due secondi.Uno, due. Dopo la vortexazione, ecco come appare il contenuto rimasto all'interno del tubo einor; si può notare che il pezzo di coda è stato completamente disciolto. Attivare la proteinasi K a 70 gradi Celsius per cinque minuti. Raffreddare sul ghiaccio per cinque minuti.Centrifugare i frammenti di coda in una microcentrifuga per 10 minuti a velocità massima. In questa microcentrifuga, la velocità massima corrisponde a 13.000 giri al minuto. Mentre i frammenti in digestione vengono centrifugati, etichettare alcuni tubi Eppendorf e riempirli con 750 microlitri di isopropanolo.Dopo aver centrifugato le code digerite, i peli e il materiale non digerito formeranno un pellet sul fondo del tubo. La soluzione contenente il materiale digerito, STE e proteinasi K verrà versata nel tubo Eppendorf contenente l’isopropanolo; il DNA inizierà a precipitare, assumendo un aspetto traslucido e filamentoso, e proprio lì, intorno a questa bolla, si troverà il DNA genomico isolato dalla coda del topo. Dopo aver mescolato la soluzione di isopropanolo e STE, il DNA genomico precipiterà assumendo l’aspetto di una piccola sfera proprio qui; centrifugare il DNA genomico precipitato per cinque minuti a velocità massima in una microcentrifuga.Qui, sul fondo del tubo, si può osservare il nostro DNA genomico in pellet. Ora aspirerò la soluzione all'interno del tubo, lasciando soltanto il pellet di DNA genomico. Ogni volta che aspirerò un altro tubo, cambierò la pipetta.Suggerimento: posizionare il suggerimento del pipet sulla punta di questo aspiratore. Dopo aver aspirato lo STE e l'isopropanolo, aggiungerò un millilitro di etanolo al 70% per lavare il pellet di DNA genomico. Poiché il pellet di DNA genomico di solito aderisce alla parete del tubo da microcentrifuga ed è difficile staccarlo per lavarlo completamente nell'etanolo al 70%, dovrete trascinarlo lungo la griglia per tubi da microcentrifuga che ho qui.È possibile procedere in questo modo. Ecco un'occhiata al DNA genomico dopo che è stato centrifugato e lavato con etanolo al 70%. Procederò nuovamente con una centrifugazione a velocità massima per cinque minuti, quindi aspirerò l'etanolo al 70%, centrifugando nuovamente i pellet di DNA genomico dopo il lavaggio.Il loro 70% di etanolo per cinque minuti a velocità massima, quindi aspirare il 70% di etanolo e lasciare asciugare il DNA per cinque minuti. Osservare il pellet di DNA genomico sul fondo del tubo, che deve risultare all'incirca così secco. Ho quindi completato l'essiccazione dei pellet di DNA genomico ottenuti dalle code dei topi, e ora aggiungerò cento microlitri di tris 40 millimolare a pH otto.Ho il DNA genomico a 50 gradi Celsius, dove si scioglierà più rapidamente rispetto all'aggiunta a temperatura ambiente. Dopo circa un'ora a 50 gradi, lo congelerò o lo metterò a quattro gradi fino a quando non vorrò eseguire le mie reazioni di PCR per determinare effettivamente quali topi sono positivi per il mio transgene.

isolation-of-genomic-dna-from-mouse-tails

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

La genotipizzazione completa di un campione coda di topo, tra cui la digestione dei tessuti e la lettura della PCR, è fatto in un'ora e mezza con Sigma SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue kit.

Genotipizzazione rapida del tessuto mouse utilizzando Sigma Extract-N-Amp PCR Tissue Kit

Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l'insorgenza di tessuto-specifica dell'espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l'attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Vi presentiamo un approccio non invasivo di campionamento per raccogliere campioni di capelli in modo efficiente da sfuggente piccoli mammiferi, come mostrato per il pika americano. Abbiamo dimostrato l'utilità di questo metodo di estrazione del DNA da capelli campionati e amplificare diversi tipi di marcatori molecolari comunemente utilizzati negli studi di ecologia e conservazione della fauna selvatica.

Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi

In questo video, dimostriamo una procedura di taglio della coda in un modello murino per raccogliere sangue periferico. Il sangue raccolto viene successivamente sottoposto a centrifugazione per separare il plasma, che può essere utilizzato per ulteriori esperimenti.

Una procedura di taglio della coda di topo per la raccolta del sangue periferico e l'isolamento del plasma

Descriviamo una procedura sperimentale semplice e rapido per la generazione di fibroblasti primari dalle orecchie e le code di topi. La procedura non richiede addestramento speciale animali e può essere utilizzato per la generazione di colture di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni.

Generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo

La microinezione di ovociti del mouse è comunemente utilizzata sia per il transgenesi classico ( cioè l'integrazione casuale dei transgeni) sia per il targeting del gene mediato da CRISPR. Questo protocollo riesamina gli ultimi sviluppi della microinjection, con particolare attenzione alle strategie di controllo della qualità e genotipizzazione.

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

Descriviamo un protocollo dettagliato per l'analisi di mutazione di Lambda selezionare cII in cellule coltivate di roditori transgenici o corrispondenti animali trattati con un agente chimico/fisiche di interesse. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero.

La Lambda selezionare cII , sistema di rilevazione di mutazione

Qui, presentiamo un protocollo per isolare rapidamente i nuclei di alta qualità dal tessuto fresco o congelato per sequenziamento di RNA massicciamente parallelo a valle. Includiamo opzioni lisi delle cellule e la rottura detergente-meccanica e ipotonico-meccanica del tessuto, entrambi dei quali possono essere utilizzati per l'isolamento dei nuclei.

Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA

Il presente protocollo descrive una singola mutazione M213L in Gja1 che mantiene la generazione di Connexin43 a lunghezza intera ma impedisce la traduzione della più piccola isoforma GJA1-20k tradotta internamente.

Rimozione di un sito di partenza traslazionale interno dall'mRNA pur mantenendo l'espressione della proteina a lunghezza intera

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico per l'analisi delle alterazioni del microbiota intestinale murino durante lo sviluppo della malattia autoimmune.

Analisi della dinamica del microbiota fecale in topi inclini al lupus utilizzando un metodo di isolamento del DNA semplice ed economico

Abbiamo sviluppato un approccio oncogenomico comparativo cross-species utilizzando analisi genomiche e screening genomici funzionali per identificare e confrontare bersagli terapeutici nei tumori che insorgono in modelli murini geneticamente modificati e il corrispondente tipo di tumore umano.

Profilazione genetica e screening dell'abbandono su scala genomica per identificare bersagli terapeutici in modelli murini di tumore maligno della guaina nervosa periferica

Impara l'estrazione del DNA genomico da biopsie di coda di topi di 10 giorni. Questo metodo standard previene la contaminazione incrociata e include tecniche di identificazione individuale per la genetica murina.

Isolamento del DNA genomico da Tails mouse

Esplora altri video