Isolamento del DNA genomico da Tails mouse

Quindi questo è un cucciolo di topo di 10 giorni e farò una biopsia della coda e poi estrarrò il DNA genomico dalla sua coda. Quindi quello che farò è tagliare un po' della sua coda, circa tre millimetri, e poi metterò il pezzo di coda in un tubo einor e metterò il tubo einor sul ghiaccio secco. Ora, per evitare contaminazioni da un mouse all'altro, di solito segno la lametta del rasoio nella parte in cui ho fatto l'ultimo taglio.

In questo modo per il prossimo topo, mi assicurerò di usare un pezzo di lama di rasoio pulito per eseguire la prossima biopsia della coda. Per distinguere tra i diversi topi della tua cucciolata, avrai bisogno di un modo per identificare i topi. Un modo per farlo è fare un buco nelle orecchie usando un perforatore per le orecchie che viene mostrato qui.

Prendi delicatamente il topo per la collottola in questo modo, giralo e pizzica la coda tra le dita. Prendi la puntura del foro dell'orecchio nell'altra mano e fai un rapido taglio nell'orecchio del topo lì. Vedi quanto è stato indolore?

Ok, ora potete vedere che ho dei pezzi di coda in questi tubi di einor e ora aggiungerò le soluzioni che li aiuteranno a digerire. Per prima cosa aggiungerò 720 microlitri di soluzione STE e poi aggiungerò 30 microlitri di proteine. Ace K.So ecco uno sguardo al pezzo di coda che abbiamo tagliato prima della digestione.

Ora posizionerò i pezzi di coda su un blocco riscaldante a 55 gradi. Molti protocolli richiedono un movimento continuo oscillando a 55 gradi, ma per i miei scopi questo non sarà necessario perché farò vorticare i pezzi di coda. Ora farò vorticare il pezzo di coda per due secondi.

Uno, due. Quindi, dopo il vortice, ecco uno sguardo a ciò che è rimasto all'interno del tubo einor qui, e potreste vedere che il pezzo di coda è stato completamente sciolto e attivare la proteinasi K a 70 gradi Celsius per cinque minuti. Spegnere con ghiaccio per cinque minuti.

Centrifugare i pezzi di coda in una microcentrifuga per 10 minuti alla massima velocità. In questa microcentrifuga, la velocità massima è di 13.000 giri/min. Mentre le code digestive girano verso il basso, etichettare alcuni tubi di einor riempire i tubi di einor con 750 microlitri di isopropanolo.

Dopo aver girato lungo le code digerite, i peli e il materiale non digerito formeranno una pallina sul fondo del travaso del tubo. La soluzione contenente il materiale digerito, STE e proteinasi K nella provetta contenente il DNA dell'isopropanolo inizierà a uscire dalla soluzione, apparirà simile a un fantasma e a una piuma, e proprio lì che nuota intorno a quella bolla c'è il DNA genomico che è stato isolato dalla coda del topo. Dopo aver mescolato l'isopropanolo e la soluzione STE, il DNA genomico uscirà dalla soluzione e apparirà come questa pallina proprio qui, far girare il DNA genomico precipitato per cinque minuti a piena velocità in una microcentrifuga.

Lì, in fondo al tubo, c'è uno sguardo al nostro DNA genomico pellettato. Ora aspirerò la soluzione all'interno della provetta, lasciando dietro di me solo il pellet di DNA genomico. Ogni volta che aspiro un altro tubo, cambio il tubo.

Punta per animali domestici sulla punta di questo aspiratore. Dopo aver aspirato via lo STE e l'isopropanolo, aggiungerò un millilitro di etanolo al 70% per lavare il pellet di DNA genomico. Poiché il pellet di DNA genomico di solito aderisce al lato di un tubo per microfughe ed è difficile da staccare per lavarlo a fondo con l'etanolo al 70%, dovrai rastrellarlo attraverso il rack per provette per microfughe che ho qui.

Puoi farlo in questo modo. Ecco uno sguardo al DNA genomico dopo che è stato pellettato e lavato con etanolo al 70%. Lo farò girare di nuovo a tutta velocità per cinque minuti e poi aspirerò via la centrifuga di etanolo al 70% lungo i pellet di DNA genomico dopo che sono stati lavati.

Il loro etanolo al 70% per cinque minuti a piena velocità, aspirando l'etanolo al 70% e lasciando asciugare il DNA per cinque minuti. C'è un'occhiata al pellet di DNA genomico sul fondo del tubo, ed è asciutto quanto si vuole ottenere. Così ho asciugato i granuli di DNA genomico dalle code dei topi, e ora aggiungerò un centinaio di microlitri di triss da 40 millimolari a pH otto.

Quindi ho il DNA genomico a 50 gradi Celsius, dove andrà in soluzione più rapidamente rispetto alla temperatura ambiente. Dopo circa un'ora a 50 gradi, lo congelerò o lo metterò a quattro gradi fino a quando non voglio eseguire le mie reazioni PCR per capire effettivamente quali topi sono positivi per il mio transgene.