Linear Amplificazione Mediata PCR - Localizzazione di Genetica Elementi e caratterizzazione di Unknown Aggirare DNA

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare le posizioni esatte di integrazione dei vettori virali nel genoma. Questo viene ottenuto mediante una reazione iniziale di PCR lineare con primer biotinilati per arricchire le sequenze di giunzione tra vettore e genoma dal DNA genomico in fase solida attraverso una serie di reazioni; vengono così generate molecole di DNA a doppio filamento con sequenze di DNA note su entrambe le estremità del prodotto, consentendo l'amplificazione esponenziale delle giunzioni tra vettore e genoma. Successivamente, adattatori per il sequenziamento vengono incorporati nei prodotti di PCR lamb.

Al fine di sequenziare e caratterizzare il DNA flanking sconosciuto mediante sequenziamento profondo, questi frammenti rivelano le posizioni esatte di integrazione del vettore. Il risultato è una diversità di giunzioni amplificate osservabili mediante elettroforesi su gel. Questo metodo fornisce informazioni sulla distribuzione dei siti di integrazione del vettore virale in pazienti sottoposti a terapia genica clinica.

È possibile applicarlo anche ad altri studi, come inserzioni, mutagenesi, schermate, infezioni virali, cancro e clonalità delle cellule staminali o diversità delle cellule T. La procedura verrà dimostrata da Ina RA, una tecnica del mio laboratorio. Per questa procedura, preparare innanzitutto la miscela dei cassetti linker mescolando 40 microlitri di ciascuno dei due LCO Legos con 110 microlitri di cloridrato di tris e 10 microlitri di cloruro di magnesio in un tubo da microcentrifuga. Successivamente, incubare la miscela su un blocco termico a 95 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffreddare lentamente fino alla temperatura ambiente durante la notte.

Il giorno successivo, aggiungere 300 microlitri di acqua al linker a doppio filamento preparato, al DNA e filtrarli attraverso una provetta per microcentrifuga. Centrifugare il filtro per raccogliere il DNA linker concentrato nell'ouit. Successivamente, recuperare l'ouit dal filtro.

Aggiungere 80 microlitri di acqua al campione e pipettare aliquote da 10 microlitri in provette PCR. Utilizzare la PCR per preamplificare le giunzioni del genoma vettoriale in provette per reazione da 50 microlitri per il campione di agnello.

Aggiungere da un nanogrammo a un microgrammo di DNA del campione per ogni reazione da 50 microlitri. Per l'agnello NR, utilizzare almeno 100 nanogrammi di DNA. Non aggiungere più di 25 microlitri ed eseguire la PCR secondo la tabella due nel testo.

E al termine, aggiungere ulteriori 0,5 microlitri di tech a ogni reazione ed eseguire nuovamente il programma di PCR. Per prima cosa, preparare le microsfere magnetiche. Aggiungere 20 microlitri di microsfere magnetiche rivestite con strept ENC in una provetta da 1,5 millilitro e posizionarle sul separatore di microsfere magnetiche per un minuto a temperatura ambiente.

Quindi eliminare il sopranatante. Sospendere le perle in 40 microlitri di PBS con BSA e riposizionare le perle sul separatore per un altro minuto. Sostituire il sopranatante con un lavaggio di 20 microlitri di soluzione di cloruro di litio tre molare.

E ancora, posizionare le perle sul separatore per un minuto. Completare sostituendo il soprannatante con 50 microlitri di soluzione di cloruro di litio sei molare. Aggiungere ora la miscela di perle magnetiche al prodotto della reazione PCR e lasciare incubare questa miscela da due ore a tutta la notte a temperatura ambiente con agitazione delicata.

Il DNA biotinilato e le strisce e le perle rivestite formeranno complessi che possono essere conservati a quattro gradi Celsius per un massimo di quattro giorni. Procedere con LAMP o NR-LAMP a causa della sua elevata sensibilità. La reazione LAMP è soggetta a contaminazione se eseguita senza attenzione.

Questo è un ambiente di qualità PCR. È fondamentale prestare particolare attenzione alla pulizia. Per amplificare con successo il DNA flanking sconosciuto senza contaminare i campioni, esporre innanzitutto i complessi al separatore per un minuto e risospendere le perle di DNA in 100 microlitri di acqua.

Successivamente, esporre i complessi al separatore per un minuto. Questa volta risospendere i complessi di perle di DNA in una miscela contenente 8,25 microlitri di acqua, un microlitro di tampone nucleotidico HEXA, un quarto di microlitro di dNTPs e mezzo microlitro di cano polimerasi.

Incubare questa miscela a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, aggiungere 90 microlitri di acqua ed esporre la reazione al separatore per un altro minuto. Quindi, risospendere i complessi di perle di DNA in un lavaggio di 100 microlitri di acqua.

Utilizzare il separatore per un altro minuto e preparare la reazione con l'enzima di restrizione. Dopo aver rimosso il soprannatante, aggiungere 8,5 microlitri di acqua, un microlitro di buffer per l'enzima di restrizione e mezzo microlitro dell'enzima di restrizione.

Quando si sceglie l'enzima di restrizione, assicurarsi che non presenti siti all'interno o a valle del sito di legame del primer utilizzato nella reazione di preamplificazione. Dopo aver lasciato reagire gli enzimi per un'ora alla temperatura ideale, aggiungere 90 microlitri di acqua. Usare un separatore per un minuto e risospendere i complessi BDNA in un lavaggio con 100 microlitri di acqua.

Ripetere la separazione e preparare la reazione di ligazione. Aggiungere alle perle cinque microlitri di acqua, un microlitro di buffer 10x fast link, un microlitro di TP, un microlitro di DNA ligasi fast link e un microlitro del cassetta di collegamento preparata all'inizio della procedura.

Lasciare avvenire questa reazione per cinque minuti a temperatura ambiente. Terminare la reazione aggiungendo 90 microlitri di acqua e separando le perle, seguito da un lavaggio con 100 microlitri di acqua. Successivamente, dopo un’ulteriore separazione, denaturare il DNA sintetizzato risospendendo le perle in cinque microlitri di idrossido di sodio 0,1 N e lasciare agitare la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi separare i complessi per un minuto e raccogliere il SUP natin, che contiene il giunzione del genoma virale preamplificato. Procedere immediatamente con l'amplificazione esponenziale oppure conservare a meno 20 gradi Celsius. Iniziare esponendo i complessi al separatore per un minuto.

E risospendere i microsfera di DNA in 100 microlitri di acqua. Separarli nuovamente e rimuovere il soprannatante. Per la reazione di ligazione, aggiungere 6,5 microlitri di acqua, un microlitro di circ Ligase e tampone di reazione 10 x.

Mezzo microlitro di cloruro di magnesio, mezzo microlitro di TP, un microlitro di oligonucleotidi linker SS e mezzo microlitro di circoligasi. Dopo un'ora a 60 gradi Celsius, terminare la reazione aggiungendo 90 microlitri di acqua, utilizzando il separatore di perline per sospendere le perline in altri 100 microlitri di soluzione, usando nuovamente il separatore e raccogliendo i complessi di lavaggio in 10 microlitri di acqua. Iniziare preparando una miscela maestra per PCR come descritto nella tabella tre del testo.

Aggiungere 48 microlitri di mix master a 2 microlitri di prodotti di agnello o di agnello NR in provette PCR da 200 microlitri ed eseguire la PCR come descritto nel testo in precedenza; preparare ulteriore strept nelle perle e risospendere queste ultime in cloruro di litio 6 M. Utilizzare 20 microlitri per l'agnello o 50 microlitri per l'agnello NR. Quindi aggiungere le perle allo stesso volume dei prodotti della reazione PCR e incubare su agitatore a 300 giri/min per due ore fino a tutta la notte a temperatura ambiente, raccogliere il complesso DNA-perle e lavarlo con 100 microlitri di acqua come precedentemente dimostrato.

Ora, sospendere il complesso in idrossido di sodio 0,1 N e incubare le perle per 10 minuti a temperatura ambiente su un agitatore. Successivamente, esporre le perle al separatore per un minuto e raccogliere il soprannatante contenente il DNA amplificato in un nuovo tubo. Utilizzando il DNA amplificato come stampo, impiegare due microlitri di questo per eseguire una PCR come descritto nella tabella quattro del testo.

Visualizzare i prodotti mediante elettroforesi su gel per purificare i prodotti. Mescolare 40 microlitri di essi con 44 microlitri di perle magnetiche AMPure XP a temperatura ambiente e incubare per cinque minuti. Successivamente, separare le perle per due minuti sul magnete.

Dopo aver rimosso il surnatante, lavare le perle due volte utilizzando 200 microlitri di etanolo al 70%, quindi risospendere le perle in 30 microlitri di acqua usando 40 nanogrammi di primer di fusione per DNA. La PCR può essere utilizzata per aggiungere adattatori specifici per il sequenziamento. I dettagli sono riportati nella tabella cinque.

Verificare i prodotti su un gel. La visualizzazione dei risultati della PCR per il gene lamb mediante elettroforesi su gel ad alta risoluzione rappresenta la scelta migliore per l'analisi diagnostica, a confronto. Anche un gel all'2% di agarosio funziona, ma è meno efficace.

La clonalità di NR LAMB, i prodotti PCR non possono essere diagnosticati visivamente. Un gel di agarosio al 2% è tuttavia perfettamente sufficiente per determinare il successo del protocollo. Dopo il sequenziamento dei prodotti PCR, la posizione dei vettori può essere individuata nel genoma dell'ospite.

Da questi dati, è possibile registrare le posizioni dei siti di inserzione nelle regioni codificanti e nelle vicinanze dei siti di inizio della trascrizione dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia genica per esplorare la sicurezza biologica dei vettori di trasferimento genico sia in modelli preclinici che in studi clinici di terapia genica.