Linear Amplificazione Mediata PCR - Localizzazione di Genetica Elementi e caratterizzazione di Unknown Aggirare DNA

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare le posizioni esatte dell'integrazione dei vettori virali nel genoma. Ciò si ottiene mediante una reazione iniziale di PCR lineare con primer biotinilati per arricchire per le sequenze di giunzione del genoma del vettore dal DNA genomico in fase solida in una serie di reazioni, viene generato DNA a doppio filamento con sequenze di DNA note su entrambe le estremità del prodotto, che consente l'amplificazione esponenziale delle giunzioni del genoma del vettore. Gli adattatori di sequenziamento successivi sono incorporati nei prodotti per la PCR dell'agnello.

Al fine di sequenziare e caratterizzare il DNA fiancheggiante sconosciuto con il sequenziamento profondo, questi frammenti rivelano le posizioni esatte delle integrazioni dei vettori. Il risultato è una diversità di giunzioni amplificate osservate dall'elettroforesi su gel. Questo metodo fornisce informazioni sulla distribuzione del sito di integrazione del vettore virale nei pazienti in terapia genica clinica.

Può anche essere applicato ad altri studi come l'inserzione, la mutagenesi, gli screening, l'infezione virale, il cancro e la clonalità delle cellule staminali o la diversità delle cellule T. La procedura sarà dimostrata da ina RA, un tecnico del mio laboratorio Per questa procedura, preparare prima le cassette linker mescolare 40 microlitri di ciascuno dei due Lego LCO con 110 microlitri di tris cloridrato e 10 microlitri di cloruro di magnesio in una provetta da microcentrifuga. Quindi, imposta la miscela in incubazione su un blocco di calore a 95 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffredda lentamente a temperatura ambiente durante la notte.

Il giorno successivo, aggiungere 300 microlitri di acqua al linker a doppio filamento preparato, DNA, e filtrarli su una provetta da microcentrifuga. Abbassa il filtro per raccogliere il DNA linker concentrato nell'ouit. Quindi, recupera l'ouit dal filtro.

Aggiungere 80 microlitri di acqua all'ouit e pipettare. Aliquote da 10 microlitri in provette PCR. Utilizzare la PCR per preamplificare le giunzioni del genoma vettore in provette di reazione da 50 microlitri per agnello.

Aggiungere tra un nanogrammo e un microgrammo di DNA campione per reazione da 50 microlitri. Per l'agnello NR, utilizzare almeno 100 nanogrammi di DNA. Non aggiungere più di 25 microlitri di eseguire la PCR secondo la tabella due nel testo.

E una volta completato, aggiungi altri 0,5 microlitri di tecnologia a ciascuna reazione ed esegui il programma PCR una seconda volta. Per prima cosa, prepara le perline magnetiche. Aggiungere 20 microlitri di perle magnetiche rivestite con ENC a un tubo da 1,5 millilitri e metterle sul separatore di microsfere magnetiche per un minuto a temperatura ambiente.

Quindi scartare l'aumento surnatante. Sospendi le perle in 40 microlitri di PBS con BSA e rimetti le perle sul separatore per un altro minuto. Sostituire il surnatante con un lavaggio da 20 microlitri di soluzione di cloruro di litio a tre molari.

E ancora, metti le perline sul separatore per un minuto. Terminare sostituendo il surnatante con 50 microlitri di soluzione di cloruro di litio a sei molari. Ora aggiungere la miscela di microsfere magnetiche al prodotto della reazione PCR e lasciare incubare questa miscela per due ore o tutta la notte a temperatura ambiente agitando delicatamente.

Il DNA biotinilato e la tava a strisce e le perle rivestite formeranno complessi che possono essere conservati a quattro gradi Celsius per un massimo di quattro giorni. Procedi con agnello o agnello NR per la sua elevata sensibilità. L-A-M-P-C-R è soggetto a contaminazione se eseguito con attenzione.

Questo è un ambiente di livello PCR. E un'attenzione particolare alla pulizia di fondamentale importanza. Per amplificare con successo il DNA fiancheggiante sconosciuto senza contaminare i campioni, esporre prima i complessi al separatore per un minuto e sospendere nuovamente le perle di DNA in 100 microlitri di acqua.

Quindi, esporre i complessi al separatore per un minuto. E questa volta risospendere i complessi di perline di DNA in una miscela con 8,25 microlitri di acqua. Un microlitro di tampone nucleotidico HEXA, un quarto di microlitro di D DN NTP e mezzo microlitro di cano polimerasi.

Incubare questa miscela a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi aggiungere 90 microlitri di acqua ed esporre la reazione al separatore per un altro minuto. Quindi risospendere i complessi di perline di DNA in un lavaggio di 100 microlitri di acqua.

Utilizzare il separatore per un altro minuto e preparare la reazione dell'enzima di restrizione. Dopo aver rimosso il surnatante. Aggiungere 8,5 microlitri di acqua, un microlitro di tampone enzimatico di restrizione e mezzo microlitro di enzima di restrizione.

Quando si seleziona l'enzima di restrizione, assicurarsi che non abbia siti all'interno o a valle del sito di legame primario utilizzato nella reazione di amplificazione preem. Dopo aver lasciato reagire gli enzimi per un'ora alla temperatura ideale, aggiungere 90 microlitri di acqua. Utilizzare un separatore per un minuto e risospendere i complessi BDNA in un lavaggio di 100 microlitri di acqua.

Ripetere la separazione e preparare la reazione di legatura. Aggiungere alle perline cinque microlitri di acqua, un microlitro di 10 x tampone a collegamento rapido. Un microlitro di TP, un microlitro di DNA ligasi a collegamento rapido e un microlitro della cassetta linker realizzata all'inizio della procedura.

Lasciare che questa reazione funzioni per cinque minuti a temperatura ambiente. Terminare la reazione aggiungendo 90 microlitri di acqua e separando le perle, seguito da un lavaggio in 100 microlitri di acqua. E poi un'altra separazione per denaturare il DNA sintetizzato, risospendere le perle in cinque microlitri di idrossido di sodio normale 0,1 e lasciare agitare la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi separare i complessi per un minuto e raccogliere la natina SUP, che contiene la giunzione del genoma del vettore amplificato preem. Procedere immediatamente con l'amplificazione esponenziale o conservare a meno 20 gradi Celsius. Inizia esponendo i complessi al separatore per un minuto.

E resus sospendendo le perle di DNA in 100 microlitri di acqua. Separali di nuovo e rimuovi il surnatante. Per la reazione di legatura, aggiungere 6,5 microlitri di acqua, un microlitro di circ ligasi, 10 tamponi di reazione.

Mezzo microlitro di cloruro di magnesio, mezzo microlitro di TP, un microlitro di oligo linker SS e mezzo microlitro di cirligasi. Dopo un'ora a 60 gradi Celsius, terminare la reazione con 90 microlitri di acqua utilizzando il separatore di microsfere Resus sospendendo le perle in altri 100 microlitri di una, utilizzando nuovamente il separatore e raccogliendo i complessi di lavaggio in 10 microlitri di acqua. Iniziare preparando una master mix PCR come descritto nella tabella tre del testo.

Aggiungere 48 microlitri di master mix a due microlitri di prodotti di agnello o agnello NR in provette PCR da 200 microlitri ed eseguire la PCR come descritto nel testo come prima, preparare altre perle strette e risospenderle in sei molari di cloruro di litio. Utilizzare 20 microlitri per l'agnello o 50 microlitri per l'agnello NR. Quindi aggiungere le perle allo stesso volume di prodotti di reazione PCR e incubarle su uno shaker a 300 RPM per due ore o una notte a temperatura ambiente, raccogliere il complesso di perline di DNA e lavarlo con 100 microlitri di acqua come precedentemente dimostrato.

Ora, sospendere il complesso in idrossido di sodio normale 0,1 e incubare le perle per 10 minuti a temperatura ambiente su uno shaker. Quindi esporre le perle al separatore per un minuto e raccogliere il surnatante contenente il DNA amplificato in una nuova provetta. Utilizzando il DNA amplificato come modello, utilizzare due microlitri di esso per eseguire una PCR come descritto nella tabella quattro del testo.

Visualizza i prodotti mediante elettroforesi su gel per purificare i prodotti. Mescola 40 microlitri di essi con 44 microlitri di perle magnetiche XP pure a temperatura ambiente e incubale per cinque minuti. Quindi separare le perline per due minuti sul magnete.

Dopo aver rimosso il surnatante, lavare le perle due volte utilizzando 200 microlitri di etanolo al 70%, quindi risospendere le perle e 30 microlitri di acqua utilizzando 40 nanogrammi di primer per fusione DNAA. La PCR può essere utilizzata per aggiungere adattatori specifici per il sequenziamento. I dettagli sono riportati nella tabella cinque.

Controlla i prodotti su un gel. La visualizzazione dei risultati della PCR dell'agnello mediante elettroforesi su gel ad alta risoluzione è la scelta migliore per l'analisi diagnostica in confronto. Sebbene anche il 2%aros funzioni, non funziona altrettanto bene.

La clonalità dei prodotti NR LAMB, PCR non può essere diagnosticata visivamente. Un gel al 2% di agros è comunque perfettamente sufficiente per determinare il successo del protocollo. Dopo il sequenziamento dei prodotti della PCR, la posizione dei vettori può essere trovata nel genoma ospite.

Da questi dati, è possibile registrare le posizioni dei siti di inserimento nelle regioni di codifica e vicino ai siti di inizio della trascrizione dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia genica per esplorare la biosicurezza dei vettori di trasferimento genico sia nei modelli preclinici che negli studi clinici di terapia genica.