Modificato il mouse sulle cellule staminali Saggio base per quantificare l'efficienza di induzione cardiogeno

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di identificare la regolazione temporale cruciale necessaria per il differenziamento dei cardiomiociti nelle cellule staminali embrionali di topo. Ciò si ottiene formando prima i corpi embrionali in una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti per standardizzare la formazione di EB come secondo passo. I modulatori proteici o chimici vengono aggiunti all'EBS in un corso temporale predeterminato, che consentirà il controllo temporale delle vie in esame.

Successivamente, gli EBS di battitura vengono quantificati manualmente per determinare l'efficienza di induzione di vari schemi di modulazione del segnale. Si ottengono risultati che mostrano i requisiti temporali delle vie di segnalazione essenziali per il differenziamento dei cardiomiociti in base alla percentuale di EBS battente formata e alla conferma con il metodo della goccia sospesa. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le gocce sospese, è che standardizza e semplifica una procedura ad alta intensità di lavoro e consente una lettura semplice per la quantificazione.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule staminali, come l'identificazione della coagulazione di segnalazione essenziale che dirige la differenziazione verso il tipo di cellula desiderato Per iniziare questa procedura. Cellule staminali embrionali di topo Gro in piastre di coltura cellulare di 10 centimetri con terreno di cellule ES di topo integrato con fattore inibitorio della leucemia. Quando le celle ES sono al 50-70% di confluenza, sono pronte per l'uso.

Rimuovere il terreno ES e sciacquare le cellule una volta con cinque millilitri di PBS sterile. Aggiungere due millilitri di tripsin EDTA allo 0,05% a ciascuna piastra e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Quindi, spegnere i viaggi in EDTA con tre millilitri di terreno ES per piastra e trasferire le celle in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Gira a 1000 rotazioni al minuto per tre minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il supinato e risospendere il pellet della cella con la quantità desiderata di terreno EB. Contare il numero di cellule e poi diluire le cellule a cinque volte 10 per tre cellule per millilitro.

Nei terreni EB utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di terreni EB contenenti cellule in ciascun pozzetto di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti rotondi. Il numero di piastre da 96 pozzetti richieste dipenderà dal numero di condizioni e dai punti temporali dell'esperimento. Posizionare le 96 piastre di microtitolazione a fondo tondo in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per identificare le finestre temporali critiche delle principali vie di segnalazione per la cardiogenesi

Alle cellule ES vengono aggiunti modulatori di specifiche vie di segnalazione. Nelle 96 piastre rotonde del pozzetto inferiore aggiungere il modulatore di segnalazione, che viene diluito in media in ciascun pozzetto in vari punti temporali. La metà dei pozzetti di ogni piastra da 96 pozzetti viene utilizzata per ogni punto di inizio del trattamento.

Un controllo del veicolo viene aggiunto agli altri 48 pozzetti per ogni punto temporale In diversi punti di arresto, laveremo i modulatori di segnalazione da ciascun pozzetto cambiando i media e quando lo facciamo dobbiamo prestare molta attenzione per evitare di interrompere i corpi embrionali in diversi punti di arresto dell'ora. Lavare i modulatori sostituendo il mezzo EB per i pozzetti. Inclinare la piastra a 96 pozzetti di circa 10 gradi e rimuovere delicatamente il fluido dal pozzetto con una pipetta multicanale.

Quindi aggiungere nuovamente il terreno EB senza modulatore a ciascun pozzetto per qualsiasi trattamento di durata superiore a 48 ore. Sostituire il fluido EB integrato con nuovi modulatori ogni due giorni fino all'ora di arresto desiderata. I punti sette giorni dopo l'indotta dell'EBS mediante il trasferimento di cellule ES in piastre a 96 pozzetti esaminano la contrazione dell'EB al microscopio.

Assegna un punteggio positivo ai pozzetti con EBS in contrazione per ottenere percentuali di contrazione di EBS per ogni diverso corso di trattamento. Le finestre temporali di segnalazione per la genesi cardio identificate dagli esperimenti su piastra a 96 pozzetti possono essere verificate in EBS costituito da goccioline sospese per creare goccioline EB sospese. Per prima cosa preparare le piastre di Petri aggiungendo da tre a quattro millilitri di PBS per prevenire l'aberrazione delle goccioline in seguito.

Successivamente, una sospensione di cellule ES preparata a una densità finale di 2,5 volte 10 per quattro cellule per millilitro viene versata in un piatto batterico per un facile accesso. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 20 gocce da microlitro di cellule ES sui coperchi capovolti delle piastre di Petri. Non lasciare che le singole goccioline si tocchino l'una con l'altra.

Generalmente, un coperchio può contenere fino a 80 gocce. Quindi capovolgere il coperchio sulla piastra di Petri contenente PBS, incubare per 48 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per consentire la formazione di EB. Dopo 48 ore, lavare l'EBS formato dalle goccioline pendenti da ciascun coperchio con tre millilitri di terreno EB.

Tirare due coperchi di EBS in una nuova capsula di Petri. Incubare la capsula di Petri per quattro giorni in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica al quarto giorno, trasferire EBS in sospensione su piastre a sei pozzetti rivestite di gelatina allo 0,2% in generale. 30 EBS vengono trasferiti a ciascun modulatore di segnalazione in incubazione a pozzetti nel periodo di tempo identificato dagli esperimenti su piastra a 96 pozzetti, sette giorni dopo la produzione delle goccioline sospese.

Osservare l'EBS al microscopio per la contrazione dell'EB: le cellule ES coltivate nei pozzetti del fondo rotondo di una piastra a 96 pozzetti formeranno EBS, come mostrato in questa immagine rappresentativa di un EB formato al quarto giorno. I punti temporali critici per la genesi cardio ES sono le finestre temporali che contengono la più alta percentuale di contrazione di EBS trattata dai modulatori di segnalazione rispetto al controllo del veicolo. Qui è mostrato un fuoco che si contrae spontaneamente di cardiomiociti formati da cellule ES trattate con morfina dorsale al giorno 10 di differenziazione su una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare in modo efficiente la regolazione temporale critica, le finestre delle vie di segnalazione chiave nella genesi cardio ES.