Name: Modificato il mouse sulle cellule staminali Saggio base per quantificare lefficienza di induzione cardiogeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Impara a identificare le finestre temporali critiche per la cardiogenesi nelle cellule staminali embrionali di topo. Questo saggio standardizzato quantifica l'efficienza di induzione cardiogenica attraverso la formazione di corpi embrionali in piastra 96 pozzetti.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Veterans Affairs e sovvenzioni NIH 5U01HL100398 e 1R01HL104040.

1. Embrionale del corpo (EB) la formazione con basso 96-tondo e micropiastre <ol><li> Crescere cellule staminali embrionali del mouse in piastre di coltura cellulare 10 centimetri con il mezzo del mouse cellule ES integrato con LIF. </li><li> Quando le cellule ES sono pronti per l&#39;uso (in genere a 50-70 confluenza%), rimuovere i supporti ES e lavare le cellule una volta con 5 ml di PBS sterile. </li><li> Aggiungere 2 ml 0,05% tripsina / EDTA per ogni piastra e incubare le piastre a 37 ° C per 3 ~ 5 minuti, Quench tripsina EDTA con 3 ml mezzi ES. </li><li> Trasferimento alle cellule di tubi da 50 ml falco e far girare a 1000 giri per 3 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare con quantità desiderata di EB media. </li><li> Contare il numero di cellulare e diluire le celle a 5 x 10 3 cellule / ml in EB media. </li><li> Usa pipetta multicanale per aggiungere 100μl di EB supporti contenenti le cellule in ciascun pozzetto di 96 - turno piastre microtiter bene. </li><li> Posto 96 - turno micropiastre bene in un incubatore. </li></ol> 2. Identificazione delle finestre momento critico della via di segnalazione chiave (s) per cardiogenesis <ol><li> Aggiungi modulatori di specifiche vie di segnalazione e di controllo del veicolo in tutti i pozzetti di piastre a 96 pozzetti microtiter contenente cellule staminali embrionali in vari momenti, come giorno 0, giorno 1, giorno 2, giorno 3 e il 4 ° giorno, metà dei pozzi, ecc per ogni 96 -pozzetti (48 pozzi) sono utilizzati per ogni punto ora di inizio del trattamento. </li><li> Lavare i modulatori cambiando i media EB per ogni 48 pozzi in diversi punti di tempo di arresto. Ad esempio, per ottenere due trattamenti al giorno per le cellule staminali embrionali a partire dal giorno 0, lavare modulatori al giorno 2. Per qualsiasi prestazione per più di 48 ore, il cambiamento dei media EB integrato con modulatori fresca ogni due giorni fino a quando i punti di fermare il tempo desiderato. </li><li> Esaminare contrazione EB al microscopio dopo giorno 7. Punteggio ottenuto i pozzetti con contraenti EB come positivi per ottenere percentuali di contrarre l&#39;EBS per ogni diversi corsi tempo di trattamento. </li><li> I punti critici per tempo cardiogenesis ES sono i tempi in cui conteneva la più alta percentuale di contrarre EB trattate con modulatori di segnale rispetto al controllo del veicolo. </li></ol> 3. Verifica delle finestre temporali di segnalazione per cardiogenesis in EBS fatto da gocce appese <ol><li> Preparare Petri aggiungendo con 3-4 ml di PBS per evitare l&#39;evaporazione. </li><li> Seguire i punti da 1,1 ~ 1,5 per preparare le cellule ES a 2.5x10 4 cellule / ml densità cellulare finale. </li><li> Versare il composto nel piatto cellula batterica per un facile accesso. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 20 gocce microlitri (contenente circa 500 cellule) su coperchi invertita. Non lasciare che le goccioline individuale al tatto. Generalmente un coperchio può andare bene fino a 80 gocce. Capovolgere il coperchio sopra il piatto contenente PBS. Incubare per 24 ore o 48 ore per permettere la formazione EB in un incubatore. </li><li> Lavare EB formato da appendere gocce da ogni coperchio con 3 ml di media EB e piscina 2 coperchi di EBS per un nuovo piatto di Petri. Aggiungi mezzi EB ad un volume totale di 10 ml. </li><li> EB trasferimento in sospensione sul 0,2% di gelatina rivestito da 6 pozzetti al giorno 4. In generale 30 EBS sono trasferiti a ciascun pozzetto. Aggiungi EB mezzi per ottenere il volume finale di 2 ml per ogni bene. </li><li> Incubare segnalazione modulatori al periodo di tempo individuato da 96 pozzetti esperimenti piastra. </li><li> Osservare la contrazione EB al microscopio dopo giorno 7 e cardiogenesis può essere ulteriormente caratterizzato mediante RT-PCR, immunoistochimica e altri, se necessario. </li></ol>

<ol><li>Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+a+source+of+regenerative+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes.</a> Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).</li>
<li>Foley, A. C., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+induction+by+Wnt+antagonists+depends+on+the+homeodomain+transcription+factor+Hex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex.</a> Genes Dev. 19, 387-396 (2005).</li>
<li>Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+biphasic+roles+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+cardiomyogenesis+and+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).</li>
<li>Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling%2C+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo goccia pendente è stato il metodo convenzionale utilizzato per la formazione EB e differenziamento in vitro. Tuttavia, è laborioso e limita la flessibilità di sperimentazione a causa di problemi logistici. Per lo stesso motivo, i risultati sono anche più difficili da convalidare come l&#39;abilità dello sperimentatore è cruciale per la formazione di EB successo e manipolazione come gocce. Un metodo più semplice è quello di formare EBS in un pallone a fondo piatto 96-così come un singolo passo del processo. Questo formato consente di differenziamento in vitro di essere standardizzati e possono ospitare più condizioni sperimentali a causa della facilità di formazione di EB e la manipolazione a valle (modulatore ad esempio aggiunta o la rimozione). Inoltre, il formato a 96 pozzetti piastra può essere ottimizzato per essere un efficiente strumento di screening in cellule di topo ES.

<ul><li> Topo CGR8 cellule sono principalmente utilizzati. </li><li> ES media: media GMEM supplementato con 10% di siero FBS, 2 mM L-glutamina, 0,05 mm 2-mercaptoetanolo, e 200 U / ml murini LIF. </li><li> EB medio: Preparare i media IMDM con il 20% di siero FBS, 1,6 mM di L-glutamina, 0,08 mm 2-mercaptoetanolo, e 1X MEM non essenziali soluzione di amminoacidi. </li></ul>

modificato il mouse sulle cellule staminali saggio base per quantificare l&#39;efficienza di induzione cardiogeno

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti è strettamente controllato dalla regolamentazione temporale e spaziale di molteplici vie principali di segnalazione. Uno degli ostacoli alla sua comprensione è stata la modalità diverse nel correlare i cambiamenti dei principali eventi di segnalazione per l&#39;efficienza differenziazione. Descriviamo qui l&#39;uso di un topo staminali embrionali (ES) saggio cellula base per identificare le finestre momento critico per Wnt / β-catenina e il segnale di attivazione BMP durante l&#39;induzione cardiogeno. Segnando per il contratto corpi embrionali (EBS) in un formato piatto a 96 pozzetti, a breve potremo quantificare l&#39;efficienza cardiogeno e identificare le finestre momento cruciale per Wnt / β-catenina e segnale di attivazione BMP in un corso di tempo dopo trattamenti modulatore specifico. Il principale qui delineato non si limita alla sola induzione cardiaca, e può essere applicata verso lo studio di molte altre linee cellulari. Inoltre, il formato a 96 pozzetti ha il potenziale per essere ulteriormente sviluppato come un throughput elevato, test automatizzati per consentire la sperimentazione di ipotesi più sofisticate sperimentale.

Descriviamo l&#39;uso di un test delle cellule del mouse ES base per identificare le finestre momento critico per Wnt / β-catenina e il segnale di attivazione BMP durante l&#39;induzione cardiogeno. Il metodo fornisce una piattaforma standardizzata che quantifica l&#39;efficienza cardiogeno affidabile, ed è applicabile allo studio di altre linee cellulari.

Modificato il mouse sulle cellule staminali Saggio base per quantificare l&#39;efficienza di induzione cardiogeno

La differenziazione delle cellule staminali pluripotenti è strettamente controllata dalla regolazione temporale e spaziale di molteplici vie di segnalazione chiave. Uno degli ostacoli...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare la regolazione temporale cruciale necessaria per la differenziazione dei cardiomiociti nelle cellule staminali embrionali murine. Questo viene ottenuto innanzitutto formando corpi embrionali in una piastra da 96 pozzetti con fondo rotondo per standardizzare la formazione dei corpi embrionali come secondo passaggio. Modulatori proteici o chimici vengono aggiunti ai corpi embrionali seguendo un corso temporale predeterminato, che consentirà un controllo temporale dei percorsi in esame.Successivamente, gli EBS contrattili vengono quantificati manualmente per determinare l'efficienza di induzione di diverse modalità di modulazione del segnale. I risultati ottenuti mostrano i requisiti temporali delle vie di segnalazione essenziali per la differenziazione dei cardiomiociti, basati sulla percentuale di EBS contrattili formati e confermati mediante il metodo della goccia sospesa. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la goccia sospesa, è che standardizza e semplifica una procedura laboriosa e consente una lettura diretta per la quantificazione.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia delle cellule staminali, ad esempio identificando la coagulazione dei segnali essenziali che indirizza la differenziazione verso il tipo cellulare desiderato. Per iniziare questa procedura, coltivare cellule staminali embrionali di topo in piastre da coltura cellulare da 10 centimetri con mezzo per cellule staminali embrionali di topo integrato con fattore inibitore della leucemia. Quando le cellule staminali embrionali raggiungono una confluenza del 50-70%, sono pronte per l'uso.Rimuovere il mezzo ES e lavare le cellule una volta con cinque millilitri di PBS sterile. Aggiungere due millilitri di tripsina 0,05% EDTA per ogni piastra e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Successivamente, neutralizzare la tripsina con EDTA aggiungendo tre millilitri di mezzo ES per ogni piastra e trasferire le cellule in un tubo da centrifuga da 50 millilitri.Centrifugare a 1000 giri al minuto per tre minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il sopranatante e risospendere il pellet cellulare con la quantità desiderata di mezzo EB. Contare il numero di cellule, quindi diluire le cellule a cinque per 10 alla tre cellule per millilitro.Nel mezzo EB, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri di mezzo EB contenente cellule in ogni pozzetto di una piastra microtitolatrice da 96 pozzetti a fondo rotondo. Il numero di piastre da 96 pozzetti necessarie dipenderà dal numero di condizioni e di punti temporali dell'esperimento. Posizionare le piastre microtitolatrici da 96 pozzetti a fondo rotondo in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per identificare le finestre temporali critiche delle principali vie di segnalazione per la cardiogenesi.Vengono aggiunti alle cellule ES modulatori di specifiche vie di segnalazione. Nelle piastre a 96 pozzetti rotondi, aggiungere il modulatore di segnalazione, diluito nel mezzo, in ciascun pozzetto in diversi punti temporali. Metà dei pozzetti di ciascuna piastra a 96 pozzetti viene utilizzata per ciascun punto temporale iniziale del trattamento.Un controllo con veicolo viene aggiunto alle altre 48 pozzette per ciascun punto temporale. In diversi momenti di arresto, si procederà a rimuovere i modulatori del segnale da ciascuna pozzetta sostituendo il mezzo, prestando grande attenzione durante questa operazione per evitare di disturbare gli aggregati embrionali in diversi punti temporali di arresto. Rimuovere i modulatori sostituendo il mezzo degli aggregati embrionali per le pozzette. Inclinare la piastra a 96 pozzette di circa 10 gradi e rimuovere delicatamente il mezzo dalle pozzette utilizzando una pipetta multicanale.Quindi aggiungere nuovamente il mezzo EB senza modulatore in ogni pozzetto per qualsiasi trattamento superiore a 48 ore. Cambiare il mezzo EB integrato con modulatori freschi ogni due giorni fino al tempo di arresto desiderato. Sette giorni dopo l'induzione degli EB mediante il trasferimento delle cellule ES in piastre a 96 pozzetti, esaminare la contrazione degli EB al microscopio.Valutare i pozzetti con EBS che contraggono come positivi per ottenere le percentuali di EBS contrattili per ciascun diverso tempo di trattamento. Le finestre temporali di segnalazione per la cardiogenesi identificate negli esperimenti con piastre a 96 pozzetti possono essere verificate in EBS ottenuti da gocce sospese, preparando gocce di EB sospese. Preparare innanzitutto le piastre di Petri aggiungendo tre o quattro millilitri di PBS per prevenire successivamente l'aberrazione delle gocce.Successivamente, una sospensione di cellule staminali embrionali preparata a una densità finale di 2,5 × 10⁴ cellule per millilitro viene versata in una piastra batteriologica per agevolarne l'accesso. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere gocce da 20 microlitri di cellule staminali embrionali sui coperchi capovolti delle piastre di Petri. Assicurarsi che le singole gocce non entrino in contatto tra loro.Generalmente, un coperchio può contenere fino a 80 gocce. Successivamente, capovolgere il coperchio sopra la piastra di Petri contenente il PBS e incubare per 48 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire la formazione di corpi embrioidi (EB). Dopo 48 ore, lavare i corpi embrioidi formati dalle gocce sospese di ciascun coperchio con tre millilitri di mezzo EB.Estrarre due coperchi di EBS e posizionarli in una nuova piastra di Petri. Incubare la piastra di Petri per quattro giorni in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica; al quarto giorno, trasferire gli EBS in sospensione su piastre da sei pozzetti rivestite con gelatina allo 0,2%, in generale. Trasferire 30 EBS in ogni pozzetto e incubare con modulatori del segnale nel periodo di tempo identificato negli esperimenti effettuati in piastre a 96 pozzetti, sette giorni dopo la formazione delle gocce sospese.Osservare l'EBS al microscopio per la contrazione degli EB. Le cellule ES coltivate nei pozzetti rotondi di una piastra a 96 pozzetti formeranno corpi embrioidi (EBS), come mostrato in questa immagine rappresentativa di un EB formato al quarto giorno. I punti temporali critici per la cardio-genesi delle cellule ES sono le finestre temporali che contengono la percentuale più alta di EBS contrattili trattati con modulatori del segnale, rispetto al controllo con veicolo. Qui è mostrato un focolaio di contrazione spontanea di cardiomiociti derivati da cellule ES trattate con morfina dorsale al decimo giorno di differenziamento su una piastra microtitolata a 96 pozzetti.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare in modo efficiente la regolazione temporale critica e le finestre temporali dei principali percorsi di segnalazione nella cardio-genesi delle cellule staminali.

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