Name: Alta Analisi Screening contenuto di valutare gli effetti tossicologici di componenti nocivi e potenzialmente dannoso (HPHC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Scopri l'analisi di screening ad alto contenuto per valutare la tossicità di costituenti del fumo di sigaretta usando cellule epiteliali bronchiali umane. Questo metodo combina analisi impedenziometrica in tempo reale e imaging cellulare avanzato.

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Gli autori desiderano ringraziare Karsta Luettich e Grégory Vuillaume per la loro revisione del manoscritto.

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Tutti gli autori sono dipendenti di Philip Morris International. Philip Morris International è l&#39;unica fonte di finanziamento e sponsor di questo progetto.

Il fabbisogno di alternative alla sperimentazione animale e per i nuovi metodi di analisi ad alto rendimento sono stati ampiamente discussi nel corso degli ultimi anni. Questo ha portato gli scienziati e le autorità di regolamentazione per studiare metodi alternativi per i test di tossicità di serie, utilizzando saggi cellulari che simulano da vicino la fisiologia dei tessuti bersaglio. In questo studio, abbiamo dimostrato l&#39;applicabilità di combinare un analizzatore di cellule in tempo reale (RTCA) con una piattaforma alta schermatura contenuto (HCS) per valutare l&#39;impatto dell&#39;esposizione a singoli costituenti CS sulle cellule epiteliali del polmone umano. Questa configurazione potrebbe essere analogamente applicata per valutare la citotossicità indotta da vari altri inquinanti atmosferici, particelle sospese nell&#39;aria, e nanoparticelle. Inoltre, i risultati ottenuti possono essere abbinati con quelli di trascrittomica intero genoma e metodi di calcolo basati su reti biologiche causali. Come riportato in precedenza, questo approccio ci ha permesso di corroborare i dati sul percorso molecolareperturbazione in seguito all&#39;esposizione CS 5 con punti finali HCS, affrontare queste perturbazioni pathway anche fenotipicamente. Come un saggio di diagramma di flusso, analisi delle cellule in tempo reale fornisce informazioni relative redditività a cellule in una risoluzione dose e dipendente dal tempo, che permette di migliorare il processo decisionale che la dose e il punto di tempo di esposizione possono essere favorevoli per l&#39;analisi a valle 14. Il principio dell&#39;analizzatore si basa sulle variazioni di impedenza elettrica generata dalle celle come si attaccano e diffusione su una superficie di coltura ben coperto con un microelettrodo oro. L&#39;impedenza viene convertito in un parametro adimensionale chiamato cella-index, che può essere utilizzato per monitorare l&#39;adesione cellulare, diffusione, morfologia e infine vitalità cellulare. Sebbene questa tecnica non fornisce informazioni sui meccanismi citotossici, la sua sensibilità permette di rilevare cambiamenti morfologici cellulari anche a dosi molto basse in cui il HCS non è informativo (dati non mostrati). Sulla base di previesperimenti OU, abbiamo notato che la metodologia RTCA è in grado di rilevare i cambiamenti morfologici a dosi inferiori rispetto agli endpoint HCS. A seguito di screening iniziale con l&#39;analizzatore di cellule in tempo reale, una piattaforma HCS è stato utilizzato per ottenere informazioni più approfondite sul tipo di citotossicità suscitato da ogni HPHC. Il pannello di test HCS permesso al profilo HPHCs verso il loro potenziale impatto sulla compartimenti cellulari / organelli, nonché per identificare quelli scatenanti la genotossicità o stress ossidativo. L&#39;analisi ha rivelato i profili distinti per cui i HPHCs selezionati inducono citotossicità in cellule NHBE. In generale, tutti i composti, tranne fenolo, sono stati trovati per indurre necrosi alle dosi più alte testate. In accordo con un ruolo potenziale nello sviluppo del cancro 1-aminonaphtalene fosforilazione indotta di H2AX come marker per la genotossicità, però il pannello HCS anche l&#39;attività scoperta di questo HPHC nella lettura tossicità mitocondriale (massa aumentata e citocromo C ReleaSE) e lo stress ossidativo (GSH esaurimento). Allo stesso modo, come precedentemente descritto, fenolo è stato identificato per indurre disfunzione mitocondriale e causare danni al DNA e deplezione di GSH. Il cromo (VI), uno dei composti classificati come cancerogeni di gruppo I, e Crotonaldehyde sono stati anche identificati come sia genotossico, in particolare cromo (VI) l&#39;apoptosi indotta anche (attivazione a cascata caspasi) e Crotonaldehyde causato aumentata produzione di ROS. Infine arsenico (V), è stato trovato per indurre cJun fosforilazione, che è un marker di attivazione della via dello stress chinasi. In questo studio, abbiamo utilizzato le cellule NHBE come modello per le cellule epiteliali polmonari in vitro. Utilizzando queste cellule in un ambiente HCS è senza precedenti e ha permesso l&#39;indagine di una più ampia gamma di endpoint, inclusi gli indicatori di genotossicità e lo stress ossidativo. Sia cellule vive e approcci di colorazione delle cellule fissi sono stati descritti nei nostri protocolli, che dimostra la flessibilità della tecnica complessiva. in fatto, gli stessi protocolli può essere applicato ad un&#39;ampia gamma di obiettivi, che può essere affrontato mediante l&#39;uso di qualsiasi colorante fluorescente o anticorpi. Per il buon esito dei protocolli di colorazione vivi, è importante rispettare il tempo di incubazione, come alcuni dei coloranti hanno una limitata emivita e il segnale di fluorescenza può diminuire prima dell&#39;acquisizione dell&#39;immagine è completata. E &#39;anche importante considerare che se viene usato un tipo cella diversa, tutte le condizioni colorante deve essere rivalutati, come la concentrazione ottimale di colorante e il tempo di incubazione possono essere diverse. Nella carta corrente abbiamo descritto uno scenario in cui solo cinque composti in cui vagliati con la metodologia HCS. Considerando il layout di piastra precedentemente descritto, sono stati dosati oltre 2 diversi set piastre per un totale di 24 piastre (6 saggi e 2 punti temporali) .Il numero delle piastre potrebbe anche essere aumentata, consentendo per lo screening simultaneo di più composti o gli invesdell&#39;inchiesta di più endpoint. Prima di ciò, tuttavia, si dovrebbe prendere in considerazione che taluni punti finali (GSH e ROS) richiedono immediata acquisizione, e di conseguenza, il dosaggio delle piastre devono essere eseguite in maniera sfalsata per permettere l&#39;acquisizione del piatto precedente. D&#39;altra parte, utilizzando un protocollo di colorazione cellulare fissa rappresenta un vantaggio in quanto le piastre possono essere impilati, interrompendo il protocollo in qualsiasi fase dopo la fissazione, per il completamento della procedura di colorazione in una fase successiva. Questo approccio, per esempio, potrebbe fornire all&#39;operatore il tempo per completare tutte le piastre di marcatura cellulare vivi senza compromettere la qualità dei dati. Per ottimizzare ulteriormente il flusso di lavoro riducendo il numero di piastre, sarebbe anche possibile multiplare più endpoint insieme. Ad esempio in questo contesto danni del DNA e lo stress chinasi potrebbe essere indagato insieme semplicemente utilizzando due anticorpo secondario con fluorocromi che emettono in diversi channels. Il continuo sviluppo della piattaforma HCS, compresi semina completamente automatizzato cellule, diluizione composto, dosaggio e colorazione, così come l&#39;aggiunta di nuovi endpoint si espanderà ulteriormente la capacità della piattaforma HCS come un potente strumento di profilatura per HPHCs su epiteliale e altri tipi cellulari .

Valutazione del rischio tossicologico ha storicamente fatto affidamento su l&#39;uso di modelli animali che, pur fondamentale nelle scienze della vita, sono anche collegati con carenze come traducibilità incoerente per l&#39;uomo e costo elevato. Inoltre, vi è stato uno sforzo crescente per trovare alternative alla sperimentazione animale nello spirito di &quot;The 3R&quot; 2 (sostituzione, riduzione e affinamento). Questo sforzo è stato accelerato nel corso degli ultimi anni, non solo a causa dei recenti progressi, come le tecniche high-throughput e approcci biologia dei sistemi, ma anche a causa della legislazione limitare l&#39;impiego di sperimentazione animale, in particolare nell&#39;Unione europea. La complessità dei percorsi di segnalazione cellulare che regolano la risposta agli insulti tossici rende evidente che utilizzando singoli parametri tossicologici non sarà sufficiente a descrivere la base tossicologica di alcuni composti. Per questo, l&#39;interazione tra centinaia di interazione pdovranno anche essere presi in considerazione roteins che contribuiscono a una rete biologica. Per studiare l&#39;effetto dei tossici su tali reti, un approccio di sistema tossicologia combinato con medio fenotipici e saggi di screening ad elevata capacità è utile per inferire potenze e allo stesso tempo fornire ulteriori informazioni sul meccanismo di azione delle singole sostanze tossiche. In questo studio, abbiamo impiegato HCS come un potente strumento di screening, che si compone di un microscopio automatico e un&#39;applicazione software biologica, che può acquisire, elaborare e analizzare i dati di immagine ottenuti da specifiche analisi cellulari basate sulla fluorescenza. Questo permette di cambiamenti visivi all&#39;interno di una cella da quantificare, in una singola cella o livello subcellulare, e molti parametri da analizzare simultaneamente. 3, ad esempio, il DNA rotture del doppio filamento sono stati valutati utilizzando un documento d&#39;identità a base di anticorpi dell&#39;istone H2AX fosforilazione e specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) sono stati quantificati utilizzando una cella-permsuperossido eable colorante sensibile. Poiché le cellule epiteliali polmonari rappresentano la prima barriera biologica contro sostanze tossiche inalate, tra cui il fumo di sigaretta, abbiamo utilizzato cellule epiteliali bronchiali primarie come un modello in vitro al profilo l&#39;effetto di HPHCs pubblicati dagli Stati Uniti Food and Drug Administration. 4 Questo manoscritto è un follow -up su uno studio precedente 5 in cui abbiamo valutato l&#39;impatto biologico di un diverso sottoinsieme di HPHCs. Come parte del nostro flusso di lavoro per valutare la citotossicità in vitro, inizialmente abbiamo valutato le potenze di una selezione di 15 HPHC di, con un tempo reale analisi cellulare impedenza basato sul sistema (RTCA) che ci ha permesso di stabilire la dose-range, adatto per la successiva HCS analisi (Figura 1). Una valutazione tossicologica HCS è stata poi condotta utilizzando nove punti finali multi-parametriche di tossicità cellulare, ogni effettuato a due punti di tempo (4 e 24 ore). I marcatori utilizzati erano indicativi di tossicità mitocondriale, danno al DNA, stress chinasi, specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS), contenuto di glutatione (GSH), caspasi 3 - 7 attività, il rilascio del citocromo C e permeabilità della membrana cellulare, come descritto nella Tabella 1. Il nostro approccio abilitato identificazione e caratterizzazione dell&#39;effetto dei componenti del fumo di sigaretta attraverso campionamento dose e tempo dipendente. In definitiva, questo ha prodotto un profilo tossicologico in vitro per ogni HPHC. approcci multi-omiche possono anche essere utilizzati per integrare ulteriormente l&#39;analisi HCS. Ciò avrebbe finalmente anche fornire una più profonda comprensione degli effetti al segnalazione cellulare e / o livello trascrizionale.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td></td><td></td></tr> 05331625001 <tr><td>Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY counter TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Frame 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Strumento di temperatura cardio</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Sigillante per piastre breathseal</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Cellule epiteliali bronchiali umane normali (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>donatore maschio caucasico di 60 anni non fumante...</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Caldo a 37 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>ReagentPack Subculture Kit di reagenti</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Caldo a 37 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Easy Flask tappo filtro 75&nbsp; cm2</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per analisi a 96 pozzetti&nbsp; nera&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (per colorazione nucleare molto rossa)</td><td>Biostato</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Colorante mitocondriale: MitoTracker Rosso CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Colorante mitocondriale: MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>Colorante ROS: Diidroetidio</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>Colorante ROS: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>Colorante ROS: MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Colorante: Monochlorobimane</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>Colorante GSH tossico</td></tr><tr><td>: Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td>Colorante tossico</td></tr><tr><td>per la permeabilità della membrana: YO-PRO-1&nbsp;</td><td>Tecnologie di vita</td><td>Y3603</td><td>Irritante&nbsp;</td></tr><tr><td>Colorante di permeabilità della membrana: TO-PRO-1&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3602</td><td>Irritante&nbsp;</td></tr><tr><td>Colorante di permeabilità della membrana: TOTO-1&nbsp;</td><td>Tecnologie di vita</td><td>T3600</td><td>Irritante&nbsp;</td></tr><tr><td>Colorante alla caspasi: Cellevent Caspasi 3/7 green</td><td>Life technologies</td><td>C10423</td><td>Irritante&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-citocromo C (topo)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fosfo-c-Jun (topo)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fosfo-H2AX (topo)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG DyLight 650&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x tampone di permeabilizzazione</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4% Soluzione di formaldeide</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>Tossico</td></tr><tr><td>10x tampone bloccante</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hanks</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporina</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td>Valinomicina tossica</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Paraquat tossico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>36541</td><td>Anisocicina tossica</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>A9789</td><td></td></tr><tr><td>Acido etacrinico</td> tossico <td>Sigma</td><td>E4754</td><td>Tossico</td></tr><tr><td>1-Aminonaftalene</td><td>Sigma</td><td>34390</td><td>Tossico</td></tr><tr><td>2-Nitropropano</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td></td></tr><tr><td>Acetamide</td> tossico <td>Sigma</td><td>695122</td><td>Acetone tossico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide</td> tossico <td>Sigma</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>Arsenico tossico (V)</td><td>Sigma</td><td>A6756</td><td>Tossico</td></tr><tr><td>Benzene</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Cromo tossico</td></tr><tr><td>(VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td>Crotonaldeide tossica</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>262668</td><td></td></tr><tr><td>Metiletilchetone</td> tossico <td>Sigma</td><td>34861</td><td>Nichel tossico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>203866</td><td></td></tr><tr><td>Tossico Nitrobenzene</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>Tossico</td></tr><tr><td>Fenolo</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>Tossico</td></tr><tr><td>Quinolina</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>Tossico</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>Tossico</td></tr></tbody></table>

alta analisi screening contenuto di valutare gli effetti tossicologici di componenti nocivi e potenzialmente dannoso (hphc)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

Il fumo di sigaretta (CS) è un importante fattore di rischio per malattie cardiovascolari e polmonari. Perché CS è un aerosol complesso contenente più di 7.000 sostanze chimiche 1 è impegnativo per valutare i contributi delle singole componenti della sua tossicità generale. Profili tossicologici dei singoli costituenti, nonché le miscele possono essere comunque stabilita in vitro, mediante l&#39;applicazione di alto through-put strumenti di screening, che consentono la profilatura di componenti nocivi e potenzialmente dannoso (HPHCs) del fumo di tabacco, così come definito dalla Food and Drug statunitense Administration (FDA). 2 Per una valutazione iniziale, uno strumento impedenza-based è stato utilizzato per un tempo reale, la valutazione priva di etichetta di tossicità del composto. La lettura dello strumento si basa su adesione cellulare, la vitalità e la morfologia che tutti insieme forniscono una panoramica dello stato della cella. Un parametro adimensionale, chiamato index cella, viene utilizzato per la quantificazione. Un insieme di difprotocolli di colorazione di- stato sviluppato per un&#39;indagine basata su imaging di fluorescenza e una piattaforma di HCS è stato utilizzato per ottenere informazioni più approfondite sul tipo di citotossicità suscitato da ogni HPHC. Dei 15 componenti testati, sono stati selezionati solo cinque per l&#39;analisi HCS-based come hanno registrato una LD calcolabile 50 (&lt;20 mm). Questi hanno incluso 1-aminonaphtalene, arsenico (V), cromo (VI), Crotonaldehyde e fenolo. Sulla base del loro effetto nel HCS, 1-aminonaphtalene e fenolo potrebbero essere identificati per indurre disfunzione mitocondriale, e, insieme con cromo (VI) come genotossico sulla base della maggiore fosforilazione dell&#39;istone H2AX. Crotonaldehyde è stato identificato come un induttore di stress ossidativo e arsenico come un percorso attivatore di stress chinasi. Questo studio dimostra che una combinazione di tecnologie impedenza-based e HCS fornisce uno strumento robusto per la valutazione in vitro dei componenti CS.

RTCA Poiché gli endpoint HCS non sarà informativo quando non viene rilevato alcun effetto tossico, quei composti non mostrano diminuita vitalità cellulare fino alla più alta concentrazione nella RCTA non sono testati da HCS (Figura 3b, c, d, g, k, l, m , p). Composti mostravano un calo della vitalità cellulare al solo la più alta concentrazione (figura 3e, o) sono anche deselezionata per HCS. Infine, solo i componenti con LD computabile 50 (&lt;20 mM) sono selezionati per ulteriore analisi HCS (figura 3a, f, h, j, n). HPHCs che soddisfano i criteri di cui sopra sono: 1-aminonaphtalene, arsenico (V), cromo (VI), Crotonaldehyde e fenolo. HCS Come un controllo di qualità (QC), controlli positivi sono fiprima analizzato per assicurare che procedura di colorazione in modo corretto. Quadri rappresentativi di cellule di controllo trattate positivi sono mostrati in Figura 6. I valori di dati sono normalizzati a veicolo come descritto in precedenza. Nessun curve dose-risposta sono riportati in grafico solo tre dosi sono testati e non tutte le tre dosi sono considerate in ogni time-point. dosi dei controlli positivi sono selezionati (sulla base di esperimenti precedenti, dati non mostrati) in modo che le risposte adeguate sono osservati per ciascun endpoint sia a 4 ore e 24 ore. In particolare dosi 1 e 2 sono utilizzati per valutare l&#39;effetto a 4 ore mentre dosi 2 e 3 vengono utilizzati per valutare l&#39;effetto a 24 ore. Le piastre sono scartati se nessuna risposta si osserva per le dosi di controllo positivo. Si noti che per tutti gli endpoint, ad eccezione di potenziale di membrana mitocondriale e contenuto di GSH, si prevede un aumento della intensità del segnale. Tutti i composti, ad eccezione di fenolo, ha indotto un fenotipo necrotico<html> tipo, basata su una maggiore permeabilità della membrana cellulare (Figura 7a, f, h, l). 1-aminonaphtalene, cromo (VI), Crotonaldehyde e fenolo sono stati identificati come essere genotossico sulla base di una maggiore fosforilazione della H2AX istone (Figura 7e, j, n, p). Fenolo e 1-aminonaphtalene sono stati trovati a causare una grave disfunzione mitocondriale (Figura 7b, o) che, con 1-aminonaphtalene, ha portato ad un aumento del rilascio di citocromo C (Figura 7c). Rilevamento di una maggiore attività delle caspasi 3/7 fornito la prova di evento apoptotico in seguito all&#39;esposizione al cromo. Ossidativo induzione dello stress (ROS o GSH) è stata anche rilevata in seguito al trattamento con 1-aminonaphtalene, Crotonaldehyde e fenolo (Figura 7d, m, q). Infine, Arsenico induce lo stress cellulare come dimostrato dalla maggiore fosforilazione del fattore di trascrizione cJun (figura 7g). carico / 53.987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Composto Tox-Profiler flusso di lavoro. A) Schema del flusso di lavoro ha seguito in questo studio. In primo luogo, un risultato dose gamma è stata effettuata utilizzando la piattaforma RTCA per selezionare dosi appropriate per la successiva HCS per caratterizzare i profili di tossicità specifici composti. B) progettazione sperimentale dello studio. 24 ore dopo la semina, le cellule sono state dosate e valori di impedenza costantemente monitorata nel corso dei seguenti 24 ore, mentre gli endpoint HCS sono stati studiati 4 e 24 ore dopo la somministrazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> Figura 2. RTCA Piastra di esposizione. Piatto principale composto in primo luogo è generato eseguendo un cinque fasi diluizione 1:10 di serie. Ogni composto,incluso il controllo del veicolo (dose 0) viene aggiunto in triplice copia alla piastra di esposizione insieme medio e staurosporina come controlli. Si noti che le dosi sequenza è mantenuta al momento del trasferimento, le dosi più alte sono in numero di riga 1 mentre comandi del veicolo sono in numero di riga 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> Figura 3. Rappresentante RTCA della vitalità cellulare risultati. A) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropano, c) Acetamide, d) Acetone, e) acrilamide, f) Arsenico (V), g) Benzene, h) Cromo (VI) , j) Crotonaldehyde, k) Metiletilchetone, l) Nickel (II), m) nitrobenzene, n) fenolo, o) chinolina, p) Toluene. A 24 ore dopo la somministrazione, l&#39;area sotto la curva (AUC) è stata calcolata per ogni dose (incluso il controllo positivo e veicolo) e normalizzati in una gamma da 0 a -100 attività% (asse y), dove 0 riflette l&#39;attività di il veicolo e -100 del controllo positivo. I valori sono stati poi tracciati e montate con una equazione Hill quattro parametri e, quando possibile, DL 50 è stato calcolato. Le concentrazioni sono espresse su una scala logaritmica (asse x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> Figura 4. Schema di diluizione per il controllo positivo Composti per HCS Assays. A) Aggiunta di controlli positivi e vevei- alla diluizione di serie targa. b) la diluizione seriale dei controlli positivi. c) 200X controlli positivi dosi. de) diluizione dei controlli 200X dosi positivi nel medio (01:40) per generare la piastra di controllo positivo contenente le dosi 5x. Si noti che ogni dose viene diluito in triplicato per riflettere il layout finale nella piastra di esposizione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> Figura 5. HCS Piastra di esposizione. Piatto principale composto in primo luogo è generato effettuando una diluizione in cinque fasi. Ogni composto, compreso il controllo del veicolo (dose 0) viene aggiunto in triplice copia alla piastra di esposizione ei controlli positivi. Si noti che l&#39;ordine dosi viene mantenuto al momento del trasferimento,dosi più alte sono in numero di riga 1 mentre comandi del veicolo sono in numero di riga 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> Figura 6. Rappresentante fluorescenti Foto di anticorpi o di Dye-macchiati Cells a) Parametri nucleari - colorante nucleare: un colorante. Permeabili, che si lega al DNA in cellule vive o fissi. Questa macchia è utilizzato per identificare le cellule singole etichettatura regione nucleare b) Necrosi - colorante permeabilità della membrana cellulare. Rilevamento Dye a base di integrità della membrana cellulare. Il reagente è intrinsecamente impermeabili alla membrana cellulare. Durante necrosi, la membrana diventa permeabile e il colorante entra nella cellula e si lega al DNA producendo una forte fluorescenza s. ignal c) L&#39;apoptosi - citocromo C: Individuazione di anticorpi a base del rilascio di citocromo C, un marchio di garanzia ben noto di apoptosi precoce. Su induzione di apoptosi, citocromo c viene rilasciato dai mitocondri e diffonde nel nucleo d) danno del DNA - pH2AX:.. Individuazione di anticorpi a base di fosforilazione dell&#39;istone H2AX, un marchio di garanzia ben noto di doppie rotture del DNA e) Lo stress chinasi - cJun:. individuazione di anticorpi a base di fosforilazione in Ser-73 di cJun, un marchio di garanzia ben noto di stress cellulare f) lo stress ossidativo - DHE: rilevazione Dye a base di radicali superossido. Dihydroethidium stessa fluorescente blu nel citoplasma mentre la forma ossidata etidio reagisce in rosso su DNA intercalazione g) GSH - mBcl:. Rilevamento basata Dye di molecole libere GSH. mBcl reagisce con GSH agenerare un prodotto altamente fluorescente h) apoptosi - caspasi 3/7 di attivazione:. rilevamento Dye a base di caspasi 3/7 attività. Il reagente è non fluorescente con un peptide di quattro amminico che inibisce il legame del DNA. Dopo l&#39;attivazione della caspasi-3/7, il peptide viene scisso consentire al colorante di legarsi a DNA e produrre un luminoso risposta fluorogenica. Pannelli BH mostrano cellule di controllo trattate positivi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> Figura 7. Rappresentante HCS Risultati. 1-aminonaphtalene (ae), arsenico (V) (F e G), cromo (VI) (HK), Crotonaldehyde (ln) e fenolo (OQ). 4 ore (linea blu) e24 hr segnali (linea arancione) sono stati calcolati per ogni dosi e normalizzati all&#39;attività veicolo (0%). I valori che non sono inclusi in curva calcoli di montaggio sono mostrati in grigio. Le concentrazioni sono espresse su una scala logaritmica (asse x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> saggio </td><td> Endpoint # </td><td> endpoint biologica </td><td> compartimento cellulare </td><td> funzione di uscita </td></tr><tr><td rowspan="4"> citotossicità </td><td> 1 </td><td> Massa mitocondriale 6 </td><td> Citoplasma </td><td> superficie media Spot </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Potenziale di membrana mitocondriale 6 </td><td> Citoplasma </td><td> intensità media Spot </td></tr><tr><td> 3 </td><td> rilascio del citocromo C <sup&gt; 7 </td><td> Nucleo </td><td> intensità media </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Permeabilità della membrana cellulare 8 </td><td> Nucleo </td><td> intensità media </td></tr><tr><td> I danni del DNA </td><td> 5 </td><td> fosfo-H2AX 9 </td><td> Nucleo </td><td> intensità media </td></tr><tr><td> Lo stress chinasi </td><td> 6 </td><td> fosfo-cJun 10 </td><td> Nucleo </td><td> intensità media </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 7 </td><td> ROS 11 </td><td> Nucleo </td><td> intensità media </td></tr><tr><td> contenuto di GSH </td><td> 8 </td><td> GSH 12 </td><td> Citoplasma </td><td> intensità media Spot </td></tr><tr><td> L&#39;apoptosi </td><td> 9 </td><td> Caspasi 3 13 </td><td> Citoplasma </td><td> intensità media Spot </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Elenco delle HCS unssays ed endpoint. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> Veicolo </td><td colspan="6" rowspan="2"> dosi RTCA (micron) </td><td rowspan="2"> LD 50 </td><td colspan="5"> dosi HCS </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> La vitalità cellulare-selezionati (micron) </td><td> 3R4F (nm) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1-Aminonaphtalene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 280 micron </td><td> 2.000 </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 150 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2-nitropropano </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> acetamide </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Acetone </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> L&#39;acrilamide </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Arsenico (V) </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 160 micron </td><td> 200 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 25 </td> &lt;td&gt; 0,17 </td></tr><tr><td colspan="2"> Benzene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Il cromo (VI) </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 20 micron </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td colspan="2"> Crotonaldehyde </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 200 pM </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2.000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Metil etil chetone </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt;20 mm </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Nichel </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> nitrobenzene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Fenolo </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 2.300 micron </td><td> 5.000 </td><td> 2.000 </td><td> 1.000 </td><td> 500 </td><td> 240 </td></tr><tr><td colspan="2"> chinolina </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td&gt; <td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> toluene </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2. Elenco dei composti HPHC testati con LD relativa 50 a 24 ore di trattamento. I composti selezionati per l&#39;analisi HCS sono evidenziate in arancio e dosi testate sono anche dato. La dose 3R4F è equivalente alla quantità di componente presente nel fumo di uno stick dalla 3R4F sigarette riferimento. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> saggio </td><td> Composto </td><td> Soluzione madre </td><td> Solvente </td&gt; <td colspan="3"> Dose (s) (micron) </td></tr><tr><td> La vitalità cellulare </td><td> staurosporine </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> 50 </td></tr><tr><td> citotossicità </td><td> valinomicina </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> I danni del DNA </td><td> Il paraquat </td><td> 100 mM </td><td> DMSO </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Lo stress chinasi </td><td> anisomycin </td><td> 2 mm </td><td> DMSO </td><td> 10 </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> rotenone </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1.000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> contenuto di GSH </td><td> acido etacrinico </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1.000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L&#39;apoptosi </td><td> staurosporine </td><td> 40 mM </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ Td&gt; <td> 50 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Elenco dei controlli positivi e le concentrazioni usate per ogni test.

L'obiettivo dello studio era valutare l'impatto biologico di 15 costituenti del fumo di sigaretta utilizzando una combinazione di un analizzatore cellulare in tempo reale basato sull'impedenza e una piattaforma basata sullo screening ad alto contenuto (HCS) per la valutazione tossicologica in vitro. Questo studio fornisce informazioni sulle dosi efficaci, sulla tossicità e sulle modalità d'azione dei composti testati.

Alta Analisi Screening contenuto di valutare gli effetti tossicologici di componenti nocivi e potenzialmente dannoso (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

L'obiettivo generale di questo approccio, che combina un analizzatore cellulare in tempo reale basato sull'impedenza e una piattaforma basata sullo screening ad alto contenuto, è quello di fornire informazioni sulle dosi efficaci, sulla tossicità e sugli effetti biologici, per ottenere il profilo tossicologico dei composti testati. Questo approccio può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tossicologia. Affrontando, ad esempio, la citotossicità, la genotossicità e le risposte allo stress cellulare.Inoltre, non solo fornisce informazioni su più parametri biochimici e morfologici contemporaneamente, ma può anche essere applicato a una diversa gamma di tipi di cellule e modelli di colture cellulari. A causa della giurisdizione e delle limitazioni, l'intero approccio verrà eseguito valutando solo un breve pezzo di composto. Per lo stesso motivo, verrà mostrato un solo protocollo per dimostrare la valutazione di screening ad alto contenuto.A dimostrare la procedura saranno Stefano Acali e Alexander Laurent, tecnici del mio laboratorio. Per vedere le cellule epiteliali bronchiali umane normali, o cellule NHBE, programmare lo strumento per definire il numero e la durata delle misurazioni dell'impedenza. In questo studio, i dati vengono registrati ogni 15 minuti, per 48 ore.Misurare il fondo della piastra pipettando 50 microlitri di terreno preriscaldato in ciascun pozzetto di una piastra RTCA a 96 pozzetti. Questa fase rappresenta un requisito tecnico per lo strumento per calcolare la resistenza elettrica media da utilizzare come riferimento di base per i calcoli basati su celle. Quindi, aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare a una concentrazione di 144.000 cellule per millilitro al terreno già presente in ciascun pozzetto della piastra RTCA.Una volta che la cella si è riscaldata, è molto importante lasciare la piastra a temperatura ambiente per 40 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi e ottenere una distribuzione omogenea delle cellule. Incubare le piastre RTCA nella culla dell'incubatore e iniziare a registrare i dati per le successive 24 ore, più o meno due, prima della somministrazione. Per il controllo positivo, diluire la soluzione madre di staurosporina da 10 millimolari, da uno a 10, in DMSO.Aggiungere cinque microlitri di diluizione a 195 microlitri di terreno per ottenere una soluzione di lavoro 5x. Per i costituenti dannosi e potenzialmente dannosi, sciogliere ciascuno di essi nel veicolo per generare una soluzione madre monomolare. Quindi, diluire ciascuna soluzione madre della sostanza in esame, da uno a 10, in terreno per generare una soluzione da 100 millimolari.Generare la piastra master composta aggiungendo prima il mezzo più il 10% del veicolo nei pozzetti da B a F e la soluzione da 100 millimolari nel pozzetto A.Eseguire una diluizione seriale in cinque fasi, da uno a 10, per ottenere le soluzioni di lavoro 5x. Per il dosaggio, mettere in pausa lo strumento RTCA, aprire la base per rimuovere la piastra di esposizione e posizionare la piastra nello strumento di temperatura RTCA per evitare il raffreddamento delle celle, che potrebbe influire sulla misurazione dell'impedenza. Aggiungere 25 microlitri di soluzione 5x dalla piastra master Compound alle cellule in triplicato, mantenendo lo stesso ordine di dosaggio della piastra master Compound.Non rimuovere il terreno di coltura cellulare esistente. Quindi, aggiungere 25 microlitri di soluzione di controllo positivo 5x alle cellule nella metà destra della fila inferiore, senza rimuovere il terreno di coltura esistente. Allo stesso modo, aggiungi 25 microlitri di terreno alle celle nella metà sinistra della riga inferiore.Dopo aver sigillato la piastra con il sigillante per piastre, riposizionare la piastra nella base RTCA e bloccarla. Riavviare la registrazione dei dati per il tempo di esposizione desiderato. Dopo la registrazione dei dati, analizzare i dati sulla vitalità delle cellule RTCA per determinare quale sostanza in esame utilizzare nell'analisi HCS.In questo esperimento, l'1-amnonaftalene, l'arsenico, il cromo e la crotonaldeide sono selezionati per l'analisi HCS. Per vedere le cellule NHBE, aggiungere 100 microlitri di una sospensione cellulare a 120.000 cellule per millilitro a ciascun pozzetto di una piastra nera a 96 pozzetti. Dopo aver lasciato la piastra HCS a temperatura ambiente per 30 minuti, per consentire alle cellule di attaccarsi ai pozzetti, incubare a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 24, più o meno due ore, prima della somministrazione.Per il controllo positivo, erogare 40 microlitri della soluzione madre di ciascun controllo positivo nella colonna due. Quindi, erogare 20 microlitri del veicolo nelle colonne tre e cinque. E 40 microlitri del veicolo nella colonna quattro.Prelevare 12 microlitri dai pozzetti della colonna due, erogarli nei pozzetti della colonna tre e mescolare. Continuare fino ad ottenere una diluizione seriale finale con tre dosi e veicolo per ogni composto di controllo positivo. Per generare la piastra di controllo positiva, preparare una diluizione da uno a 40 in terreno delle tre dosi e del veicolo.Per realizzare la piastra madre del composto, risospendere e diluire ciascuna soluzione madre della sostanza in esame, da uno a 10 in terreno per una concentrazione di 100 millimolari. Eseguire le diluizioni utilizzando un terreno con il 10% di veicolo per ottenere le dosi 5x selezionate per ciascuna sostanza in esame. Sia i controlli positivi che la lastra composta sono ora pronti per essere dosati sulla lastra di esposizione.Quindi, aggiungere 25 microlitri di soluzioni 5x dalla piastra master Compound alle celle in triplicato, mantenendo lo stesso ordine di dosaggio della piastra master Compound. Non rimuovere il terreno di coltura cellulare esistente. Quindi, aggiungere 25 microlitri della soluzione 5x dalla piastra di controllo positivo alle cellule nella fila inferiore, mantenendo lo stesso ordine di dosaggio della piastra di controllo positivo.Preparare un volume sufficiente della soluzione di colorazione delle cellule vive come descritto nel protocollo di testo. Quindi, diluire sia il colorante mitocondriale che il colorante di permeabilità della membrana nella soluzione di colorazione delle cellule vive, secondo le istruzioni del fornitore. Aggiungere 50 microlitri della soluzione di colorazione su cellule vive a ciascun pozzetto della piastra denominata Saggio di citotossicità.Non rimuovere il terreno di coltura cellulare e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius, 5% di CO2. Aspirare delicatamente il terreno e la soluzione colorante e aggiungere 100 microlitri di soluzione di fissazione a ciascun pozzetto. Quindi, incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente, al buio.Dopo l'incubazione, aspirare delicatamente la soluzione di fissazione e lavare una volta con 100 microlitri per pozzetto di tampone di lavaggio. Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100 microlitri per pozzetto di tampone di permeabilizzazione 1x a ciascun pozzetto, prima di incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, al buio. Aspirare il tampone di permeabilizzazione e lavare la piastra due volte con 100 microlitri, per pozzetto, di tampone di lavaggio.Quindi, aspirare il tampone di lavaggio e aggiungere 100 microlitri di 1x tampone bloccante a ciascun pozzetto. Quindi, incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, al buio. Diluire l'anticorpo anti-citocromo C, da uno a 250, in una soluzione di anticorpi primari.Successivamente, aspirare il tampone bloccante e aggiungere 50 microlitri, per pozzetto, di soluzione di anticorpi primari a ciascun pozzetto, prima di incubare per 60 minuti a temperatura ambiente, al buio. Diluire l'anticorpo anti-topo, da uno a 500, in anticorpo secondario e soluzione nucleare. Inoltre, diluire il colorante nucleare, da uno a 1.000, in anticorpi secondari e soluzione nucleare.Dopo aver aspirato la Soluzione di Anticorpi Primari, lavare la piastra tre volte con 100 microlitri, per pozzetto, di tampone di lavaggio, utilizzando il lavapiastre. Aspirare il tampone di lavaggio e aggiungere 50 microlitri, per pozzetto, di anticorpo secondario e soluzione nucleare a ciascun pozzetto della piastra. Ora, incubare la piastra per 60 minuti a temperatura ambiente, al buio.Dopo l'aspirazione dell'anticorpo secondario e della soluzione nucleare, lavare la piastra tre volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio per pozzetto utilizzando il lavapiastre. Quindi, aggiungere 100 microlitri, per pozzetto, di tampone di lavaggio. La piastra è ora pronta per essere valutata sullo strumento HCS e l'acquisizione è iniziata.Vengono mostrati i risultati rappresentativi della vitalità delle cellule RTCA del trattamento con la sostanza in esame. Un effetto tossico dose-dipendente si ottiene nell'arco di 24 ore di esposizione solo con 1-amnonaftalene, arsenico, cromo e crotonaldeide, poiché tutti hanno mostrato una LD50 calcolata inferiore a 20 millimolari. Nessun effetto tossico è stato ottenuto con gli altri composti.Qui sono mostrati i risultati rappresentativi dell'HCS solo per il trattamento con 1-amminononaftalene. L'effetto tossico dell'1-amnonaftalene induce un grave danno della membrana cellulare, che porta ad un aumento della permeabilità della membrana cellulare in modo dose-dipendente, dopo quattro ore di esposizione. Il composto colpisce anche i mitocondri, inducendo un aumento di massa dopo quattro ore di esposizione, insieme al rilascio di citocromo C, che è poi rilevabile nei nuclei dopo quattro e 24 ore di esposizione.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro due o tre giorni, poiché la maggior parte di esse richiede circa un'ora al giorno di tempo pratico per l'impostazione e il dosaggio. A seconda del protocollo selezionato, lo screening ad alto contenuto richiede un massimo di tre ore e 1/2 per l'esecuzione dell'intera procedura di colorazione. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, tenere presente che, sebbene la selezione di una gamma più ampia di endpoint aggiunga complessità al flusso di lavoro, non aumenterà sostanzialmente il tempo.Con un flusso di lavoro ottimale, infatti, è possibile valutare più lastre in parallelo. Il continuo sviluppo della piattaforma di screening ad alto contenuto, compreso l'impostazione completamente automatizzata delle cellule, la diluizione dei composti, il dosaggio e la colorazione e l'aggiunta di nuovi endpoint, amplierà ulteriormente la capacità della piattaforma di screening ad alto contenuto come potente strumento per la profilazione tossicologica. Inoltre, la combinazione di più e singoli endpoint tossicologici in un rendimento così elevato ci porterà un passo avanti nel nostro sforzo di ridurre i test chimici sugli animali.

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Screening RNA inibitorio piccolo su vasta scala è uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. Qui, presentiamo lo sviluppo e la convalida dei modelli di esposizione e dei metodi per lo screening di elevato throughput di indotta da acido fluoridrico e cloropicrina lesioni epiteliali cornea.

High Throughput Screening SiRNA per lesione delle cellule epiteliali cloropicrina e Cornea indotta da acido fluoridrico

Un metodo quantitativo è stato sviluppato per identificare e prevedere la tossicità acuta dei prodotti chimici analizzando automaticamente l'analisi fenotipica dei Caenorhabditis elegans. Questo protocollo descrive come trattare vermi con prodotti chimici in una piastra 384 pozzetti, catturare video e quantificare tossicologici fenotipi correlati.

Un saggio di High-throughput per la previsione di tossicità chimica di Automated fenotipica profilatura di Caenorhabditis elegans

Questo protocollo presenta una tecnica automatizzata ad alto rendimento basata su immagini per identificare i composti che modulano l'uccisione delle cellule di cancro al seno mediate da cellule natural killer in presenza di un anticorpo terapeutico anti-HER-2.

Test di screening ad alto contenuto per l'identificazione di composti modificanti la citotossicità cellulare anticorpo-dipendenti

Dimostrazione di quantificazione del dsDNA utilizzando sonde molecolari PicoGreen colorante e Hitachi F-7000 Spettrofotometro a fluorescenza dotato di un accessorio lettore di micropiastre.

Quantificazione di dsDNA con il F-7000 Hitachi Fluorescenza spettrofotometro e PicoGreen Dye

Un alto contenuto di metodo di screening per l'identificazione di nuovi recettori transmembrana competenti segnalazione è descritto. Questo metodo è suscettibile di larga scala di automazione e consente previsioni...

Un alto contenuto di flusso di lavoro di imaging per studiare GRB2 Centri di segnalazione di espressione clonazione

Viene sviluppato un protocollo per esaminare gli effetti di un farmaco epigenetico DZNep sullo sviluppo, la fecondità e la sopravvivenza delle zanzare.  Qui descriviamo le procedure per l'esposizione acquosa di DZNep a zanzare immature e un'esposizione ematica di DZNep a zanzare adulte, oltre a misurare l'inibizione dell'idrolasi SAH.

Saggi tossicologici per gli effetti di prova di un epigenetica droga sullo sviluppo, Fecondità e Sopravvivenza di malaria zanzare

Scopri l'analisi di screening ad alto contenuto per valutare la tossicità di costituenti del fumo di sigaretta usando cellule epiteliali bronchiali umane. Questo metodo combina analisi impedenziometrica in tempo reale e imaging cellulare avanzato.

Alta Analisi Screening contenuto di valutare gli effetti tossicologici di componenti nocivi e potenzialmente dannoso (HPHC)

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