Alta Analisi Screening contenuto di valutare gli effetti tossicologici di componenti nocivi e potenzialmente dannoso (HPHC)

L'obiettivo generale di questo approccio, che combina un analizzatore cellulare in tempo reale basato sull'impedenza e una piattaforma basata sullo screening ad alto contenuto, è quello di fornire informazioni sulle dosi efficaci, sulla tossicità e sugli effetti biologici, per ottenere il profilo tossicologico dei composti testati. Questo approccio può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tossicologia. Affrontando, ad esempio, la citotossicità, la genotossicità e le risposte allo stress cellulare.

Inoltre, non solo fornisce informazioni su più parametri biochimici e morfologici contemporaneamente, ma può anche essere applicato a una diversa gamma di tipi di cellule e modelli di colture cellulari. A causa della giurisdizione e delle limitazioni, l'intero approccio verrà eseguito valutando solo un breve pezzo di composto. Per lo stesso motivo, verrà mostrato un solo protocollo per dimostrare la valutazione di screening ad alto contenuto.

A dimostrare la procedura saranno Stefano Acali e Alexander Laurent, tecnici del mio laboratorio. Per vedere le cellule epiteliali bronchiali umane normali, o cellule NHBE, programmare lo strumento per definire il numero e la durata delle misurazioni dell'impedenza. In questo studio, i dati vengono registrati ogni 15 minuti, per 48 ore.

Misurare il fondo della piastra pipettando 50 microlitri di terreno preriscaldato in ciascun pozzetto di una piastra RTCA a 96 pozzetti. Questa fase rappresenta un requisito tecnico per lo strumento per calcolare la resistenza elettrica media da utilizzare come riferimento di base per i calcoli basati su celle. Quindi, aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare a una concentrazione di 144.000 cellule per millilitro al terreno già presente in ciascun pozzetto della piastra RTCA.

Una volta che la cella si è riscaldata, è molto importante lasciare la piastra a temperatura ambiente per 40 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi e ottenere una distribuzione omogenea delle cellule. Incubare le piastre RTCA nella culla dell'incubatore e iniziare a registrare i dati per le successive 24 ore, più o meno due, prima della somministrazione. Per il controllo positivo, diluire la soluzione madre di staurosporina da 10 millimolari, da uno a 10, in DMSO.

Aggiungere cinque microlitri di diluizione a 195 microlitri di terreno per ottenere una soluzione di lavoro 5x. Per i costituenti dannosi e potenzialmente dannosi, sciogliere ciascuno di essi nel veicolo per generare una soluzione madre monomolare. Quindi, diluire ciascuna soluzione madre della sostanza in esame, da uno a 10, in terreno per generare una soluzione da 100 millimolari.

Generare la piastra master composta aggiungendo prima il mezzo più il 10% del veicolo nei pozzetti da B a F e la soluzione da 100 millimolari nel pozzetto A.Eseguire una diluizione seriale in cinque fasi, da uno a 10, per ottenere le soluzioni di lavoro 5x. Per il dosaggio, mettere in pausa lo strumento RTCA, aprire la base per rimuovere la piastra di esposizione e posizionare la piastra nello strumento di temperatura RTCA per evitare il raffreddamento delle celle, che potrebbe influire sulla misurazione dell'impedenza. Aggiungere 25 microlitri di soluzione 5x dalla piastra master Compound alle cellule in triplicato, mantenendo lo stesso ordine di dosaggio della piastra master Compound.

Non rimuovere il terreno di coltura cellulare esistente. Quindi, aggiungere 25 microlitri di soluzione di controllo positivo 5x alle cellule nella metà destra della fila inferiore, senza rimuovere il terreno di coltura esistente. Allo stesso modo, aggiungi 25 microlitri di terreno alle celle nella metà sinistra della riga inferiore.

Dopo aver sigillato la piastra con il sigillante per piastre, riposizionare la piastra nella base RTCA e bloccarla. Riavviare la registrazione dei dati per il tempo di esposizione desiderato. Dopo la registrazione dei dati, analizzare i dati sulla vitalità delle cellule RTCA per determinare quale sostanza in esame utilizzare nell'analisi HCS.

In questo esperimento, l'1-amnonaftalene, l'arsenico, il cromo e la crotonaldeide sono selezionati per l'analisi HCS. Per vedere le cellule NHBE, aggiungere 100 microlitri di una sospensione cellulare a 120.000 cellule per millilitro a ciascun pozzetto di una piastra nera a 96 pozzetti. Dopo aver lasciato la piastra HCS a temperatura ambiente per 30 minuti, per consentire alle cellule di attaccarsi ai pozzetti, incubare a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 24, più o meno due ore, prima della somministrazione.

Per il controllo positivo, erogare 40 microlitri della soluzione madre di ciascun controllo positivo nella colonna due. Quindi, erogare 20 microlitri del veicolo nelle colonne tre e cinque. E 40 microlitri del veicolo nella colonna quattro.

Prelevare 12 microlitri dai pozzetti della colonna due, erogarli nei pozzetti della colonna tre e mescolare. Continuare fino ad ottenere una diluizione seriale finale con tre dosi e veicolo per ogni composto di controllo positivo. Per generare la piastra di controllo positiva, preparare una diluizione da uno a 40 in terreno delle tre dosi e del veicolo.

Per realizzare la piastra madre del composto, risospendere e diluire ciascuna soluzione madre della sostanza in esame, da uno a 10 in terreno per una concentrazione di 100 millimolari. Eseguire le diluizioni utilizzando un terreno con il 10% di veicolo per ottenere le dosi 5x selezionate per ciascuna sostanza in esame. Sia i controlli positivi che la lastra composta sono ora pronti per essere dosati sulla lastra di esposizione.

Quindi, aggiungere 25 microlitri di soluzioni 5x dalla piastra master Compound alle celle in triplicato, mantenendo lo stesso ordine di dosaggio della piastra master Compound. Non rimuovere il terreno di coltura cellulare esistente. Quindi, aggiungere 25 microlitri della soluzione 5x dalla piastra di controllo positivo alle cellule nella fila inferiore, mantenendo lo stesso ordine di dosaggio della piastra di controllo positivo.

Preparare un volume sufficiente della soluzione di colorazione delle cellule vive come descritto nel protocollo di testo. Quindi, diluire sia il colorante mitocondriale che il colorante di permeabilità della membrana nella soluzione di colorazione delle cellule vive, secondo le istruzioni del fornitore. Aggiungere 50 microlitri della soluzione di colorazione su cellule vive a ciascun pozzetto della piastra denominata Saggio di citotossicità.

Non rimuovere il terreno di coltura cellulare e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius, 5% di CO2. Aspirare delicatamente il terreno e la soluzione colorante e aggiungere 100 microlitri di soluzione di fissazione a ciascun pozzetto. Quindi, incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente, al buio.

Dopo l'incubazione, aspirare delicatamente la soluzione di fissazione e lavare una volta con 100 microlitri per pozzetto di tampone di lavaggio. Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100 microlitri per pozzetto di tampone di permeabilizzazione 1x a ciascun pozzetto, prima di incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, al buio. Aspirare il tampone di permeabilizzazione e lavare la piastra due volte con 100 microlitri, per pozzetto, di tampone di lavaggio.

Quindi, aspirare il tampone di lavaggio e aggiungere 100 microlitri di 1x tampone bloccante a ciascun pozzetto. Quindi, incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, al buio. Diluire l'anticorpo anti-citocromo C, da uno a 250, in una soluzione di anticorpi primari.

Successivamente, aspirare il tampone bloccante e aggiungere 50 microlitri, per pozzetto, di soluzione di anticorpi primari a ciascun pozzetto, prima di incubare per 60 minuti a temperatura ambiente, al buio. Diluire l'anticorpo anti-topo, da uno a 500, in anticorpo secondario e soluzione nucleare. Inoltre, diluire il colorante nucleare, da uno a 1.000, in anticorpi secondari e soluzione nucleare.

Dopo aver aspirato la Soluzione di Anticorpi Primari, lavare la piastra tre volte con 100 microlitri, per pozzetto, di tampone di lavaggio, utilizzando il lavapiastre. Aspirare il tampone di lavaggio e aggiungere 50 microlitri, per pozzetto, di anticorpo secondario e soluzione nucleare a ciascun pozzetto della piastra. Ora, incubare la piastra per 60 minuti a temperatura ambiente, al buio.

Dopo l'aspirazione dell'anticorpo secondario e della soluzione nucleare, lavare la piastra tre volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio per pozzetto utilizzando il lavapiastre. Quindi, aggiungere 100 microlitri, per pozzetto, di tampone di lavaggio. La piastra è ora pronta per essere valutata sullo strumento HCS e l'acquisizione è iniziata.

Vengono mostrati i risultati rappresentativi della vitalità delle cellule RTCA del trattamento con la sostanza in esame. Un effetto tossico dose-dipendente si ottiene nell'arco di 24 ore di esposizione solo con 1-amnonaftalene, arsenico, cromo e crotonaldeide, poiché tutti hanno mostrato una LD50 calcolata inferiore a 20 millimolari. Nessun effetto tossico è stato ottenuto con gli altri composti.

Qui sono mostrati i risultati rappresentativi dell'HCS solo per il trattamento con 1-amminononaftalene. L'effetto tossico dell'1-amnonaftalene induce un grave danno della membrana cellulare, che porta ad un aumento della permeabilità della membrana cellulare in modo dose-dipendente, dopo quattro ore di esposizione. Il composto colpisce anche i mitocondri, inducendo un aumento di massa dopo quattro ore di esposizione, insieme al rilascio di citocromo C, che è poi rilevabile nei nuclei dopo quattro e 24 ore di esposizione.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro due o tre giorni, poiché la maggior parte di esse richiede circa un'ora al giorno di tempo pratico per l'impostazione e il dosaggio. A seconda del protocollo selezionato, lo screening ad alto contenuto richiede un massimo di tre ore e 1/2 per l'esecuzione dell'intera procedura di colorazione. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, tenere presente che, sebbene la selezione di una gamma più ampia di endpoint aggiunga complessità al flusso di lavoro, non aumenterà sostanzialmente il tempo.

Con un flusso di lavoro ottimale, infatti, è possibile valutare più lastre in parallelo. Il continuo sviluppo della piattaforma di screening ad alto contenuto, compreso l'impostazione completamente automatizzata delle cellule, la diluizione dei composti, il dosaggio e la colorazione e l'aggiunta di nuovi endpoint, amplierà ulteriormente la capacità della piattaforma di screening ad alto contenuto come potente strumento per la profilazione tossicologica. Inoltre, la combinazione di più e singoli endpoint tossicologici in un rendimento così elevato ci porterà un passo avanti nel nostro sforzo di ridurre i test chimici sugli animali.