Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come implementare la microscopia a fluorescenza con imaging del tempo di decadimento, o FLIM, in un flusso di lavoro automatizzato su piastre multipozzetto utilizzando software open source e strumentazione di base. Questa metodologia può essere applicata a letture basate su FLIM in una serie di cellule fisse o vive. È particolarmente utile per analizzare l'elaborazione dei segnali cellulari o le interazioni tra proteine.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che la FLIM fornisce letture quantitative affidabili e può fornire la frazione della popolazione di interazioni in una singola misurazione. Applicando tecniche di analisi globale a migliaia di cellule su centinaia di campi visivi, possiamo utilizzare il trasferimento di energia per risonanza di Foster, o letture FRET. E sfruttando, ad esempio, variazioni di tempo di vita fino a circa 20 picosecondi.

A dimostrare la procedura insieme a Frederik Gorlitz saranno Sunil Kumar, il nostro ricercatore associato, e Ian Munro, il nostro sviluppatore software. Iniziare avviando Micromanager e aprendo il plugin openFLIM-HCA. Nella scheda di controllo FLIM, selezionare il file di calibrazione del delay box e aprire i file di calibrazione.

Selezionare il file di calibrazione per la specifica combinazione di unità generatrice di ritardo e frequenza di ripetizione del laser di interesse. Nel menu file, selezionare imposta cartella principale e scegliere la cartella in cui verranno salvati i dati. Dopo aver verificato che tutti i parametri appropriati siano stati impostati, impostare manualmente una larghezza di gate di quattro nanosecondi sul pannello di controllo dell'amplificatore ottico con gate per l'intero esperimento.

Per acquisire i dati dell'immagine della funzione di risposta dello strumento, posizionare manualmente un blocco del fascio nel cassetto del cubo di filtri prima dell'obiettivo per impedire la fuoriuscita di qualsiasi luce laser e orientare il blocco del fascio in modo da ridurre al minimo eventuali riflessi verso il telaio del microscopio. Nella scheda di controllo del percorso della luce, impostare i filtri di eccitazione, dicotomico ed emissione nell'unità a disco rotante, in modo che la frazione di luce di eccitazione dispersa dal disco di Nipkow rotante possa essere immaginata senza saturare il sistema per un tempo di integrazione della fotocamera minimo di 200 millisecondi. Nella scheda di controllo FLIM, utilizzare la funzione di ricerca del punto massimo sull'intero intervallo di ritardi coperti dal modulo di ritardo rapido programmabile.

Quindi verificare il tracciato del segnale visualizzato. Impostare i tempi di ritardo del corso in modo che l'intero profilo della funzione di risposta dello strumento rientri nel campo di scansione del dispositivo di ritardo rapido. Regolare i parametri del filtro neutro e del tempo di esposizione.

Oltre all'accumulo di fotogrammi, assicurarsi che la fotocamera non sia saturata nel tempo di apertura di luminosità e che il tempo di integrazione effettivo non sia inferiore a 200 millisecondi. Nel menu di controllo FLIM, selezionare la casella di ritardo rapido e impostare passi di ritardo di 25 picosecondi sull'intero intervallo di ritardo. Successivamente, selezionare riempi ritardi e fare clic su acquisisci immagine FLIM per ottenere un'immagine della funzione di risposta dello strumento.

Attendere fino al completamento dell'acquisizione. Nel menu di controllo del percorso luminoso, selezionare densità neutra e fare clic su bloccato per oscurare il laser. Aprire il menu di controllo FLIM e selezionare la casella di ritardo rapido per ridurre il numero di passi di ritardo aumentando il valore nella casella di incremento.

Quindi fare clic su "acquisisci immagine FLIM" per ottenere un'immagine di fondo della telecamera. Per acquisire i dati di riferimento del colorante, andare nella scheda di controllo XYZ e inserire la pozzetta H4 nella casella di dialogo "vai alla pozzetta". Successivamente, passare alla scheda di controllo del percorso della luce e selezionare i filtri di eccitazione, dicotico ed emissione appropriati per l'immagine della proteina fluorescente M turquoise utilizzando la funzione "trova punto massimo" sull'intero intervallo della casella di ritardo rapido.

Quindi impostare i parametri appropriati per acquisire i dati di riferimento del die e un'immagine di sfondo corrispondente, come appena illustrato. Per acquisire i dati FLIM da un campione su piastra multi-well, accedere al menu di acquisizione sequenziale HCA. Selezionare la scheda posizioni XYZ e impostare quali pozzetti devono essere immaginati e il numero di campi di vista da acquisire per pozzetto.

Selezionare un campo visivo rappresentativo contenente il campione da acquisire e impostare il filtro neutro ottimale nel tempo di integrazione della fotocamera per raggiungere il 75% della gamma dinamica della fotocamera di lettura. Nella scheda di controllo XYZ, selezionare il controllo del fuoco di ritorno nella finestra di dialogo dell'autofocus e mettere manualmente a fuoco il microscopio sulle cellule o sulle strutture di interesse. Impostare l'intervallo di ricerca dell'autofocus a 2000 micrometri e premere invio.

Quindi fare clic su AF ora per avviare la procedura di messa a fuoco automatica. Un valore di offset verrà visualizzato nel campo di messa a fuoco automatica dell'offset del fuoco. Immettere questo valore di offset nella finestra AF offset e fare clic su AF ora due volte per ripetere la procedura di messa a fuoco automatica.

I valori di offset dovrebbero ora essere impostati a zero, indicando un corretto funzionamento del sistema di messa a fuoco automatica. Successivamente, nella scheda di controllo FLIM, selezionare la funzione di autogating per garantire un campionamento logaritmico dei punti di ritardo. Impostare il numero di frame accumulati su un valore che produca il tempo totale desiderato di acquisizione dati.

Quindi, nella finestra di dialogo di acquisizione FLIM, fare clic sul pulsante avvia sequenza HCA per eseguire l'acquisizione della piastra multi-well in FLIM e acquisire un'immagine di fondo della telecamera, come appena dimostrato. Qui viene mostrato un saggio FLIM FRET rappresentativo che utilizza il sistema modello FRET espresso in cocelle e in una piastra multi-well, con esempi di immagini di decadimento della fluorescenza acquisite automaticamente di campi tipici visibili in ciascun pozzetto. In questo esperimento, i pozzetti di controllo negativo hanno mostrato i tempi di vita più lunghi, mentre i tempi di vita del donatore hanno mostrato i costrutti FRET più bassi con le lunghezze di linker più corte.

Nel complesso, la vita media calcolata su tutti i campi visivi di ciascun pozzetto ha mostrato variazioni tra le diverse piastre a multi pozzetto. Facendo la media del profilo di decadimento dell'intensità della fluorescenza del donatore su tutte le cellule immaginate nel pozzetto A1, insieme all'adattamento a un modello di decadimento mono-esponenziale e alla funzione di risposta dello strumento, si osserva che il modello di adattamento è valido. Un'ulteriore analisi della vita media media della fluorescenza per ogni colonna della piastra a multi pozzetto, ottenuta da un adattamento mono-esponenziale pixel per pixel, dimostra che la vita media diminuisce nei costrutti FRET con lunghezze di linker più corte, simulando un esperimento con diverse efficienze FRET.

In questo esperimento, i dati FLIM di un saggio FRET sull'azione di diversi inibitori sull'oligomerizzazione proteica sono stati adattati a un modello di decadimento esponenziale singolo. La mappa della piastra del tempo di vita della fluorescenza illustra il tempo di vita medio per pozzetto, calcolato come media su otto campi di osservazione. Un piccolo set, che prevede l'acquisizione di quattro campi di osservazione per pozzetto, mentre il nostro saggio FLIM può essere completato in circa due ore e mezza, inclusi il tempo necessario per acquisire la funzione di risposta dello strumento, i dati di riferimento del colorante e l'esecuzione dell'analisi con FLIM fit.

Quando si esegue un saggio FLIM, è importante ricordare di acquisire la funzione di risposta dello strumento e i dati di riferimento insieme alle rispettive immagini di fondo, in modo da disporre di tutte le informazioni necessarie per analizzare i dati FLIM. Utilizzando il nostro software open source, FLIM fit, è inoltre possibile adattare questi dati a modelli di decadimento più complessi. Ad esempio, consentendo la determinazione della frazione di popolazione FRET.

La nostra tecnologia FLIM HCA sta aiutando i ricercatori nel settore della scoperta di farmaci a effettuare misurazioni robuste del trasferimento di energia di risonanza (fret). In futuro, speriamo che questa tecnologia consenta di misurare le costanti di dissociazione in saggi cellulari. Speriamo inoltre che questo articolo video e le informazioni presenti nel nostro Wiki possano aiutare altri ricercatori a costruire autonomamente la propria strumentazione FLIM HCA e ad applicarla al fret e ad altri saggi.

Non dimenticare che lavorare con i laser può essere pericoloso e che precauzioni come racchiudere tutti i fasci laser devono sempre essere adottate quando si utilizza tale strumentazione.