Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come implementare la microscopia di imaging a fluorescenza tempo-dipendente, o FLIM, in un flusso di lavoro automatizzato su piastre multipozzetto utilizzando software opensource e strumentazione di base. Questa metodologia può essere applicata a letture basate su FLIM in una serie di celle fisse o vive. Ed è particolarmente utile per leggere l'elaborazione del segnale cellulare o le interazioni proteiche.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che FLIM fornisce robuste letture quantitative e può fornire una frazione di popolazione di interazione in un'unica misurazione. L'applicazione di tecniche di analisi globale a migliaia di cellule su centinaia di campi visivi, ci consente di utilizzare il trasferimento di energia della resina promozionale, o letture FRET. E sfruttando, ad esempio, le modifiche della durata fino a circa 20 picosecondi.

A dimostrare la procedura con Frederik Görlitz saranno Sunil Kumar, il nostro ricercatore associato e Ian Munro, il nostro sviluppatore di software. Inizia avviando il micromanager e apri il plug-in openFLIM-HCA. Nella scheda di controllo FLIM, selezionare il file di calibrazione della casella di ritardo e aprire i file di calibrazione.

Selezionare il file di calibrazione per la combinazione specifica dell'unità del generatore di ritardo e del tasso di ripetizione laser di interesse. Nel menu file, selezionare imposta cartella di base e selezionare la cartella in cui verranno salvati i dati. Dopo aver confermato che tutti i parametri appropriati sono stati impostati, impostare manualmente una larghezza del gate di quattro nanosecondi sulla scatola di controllo dell'intensificatore ottico gated per l'intero esperimento.

Per acquisire i dati dell'immagine della funzione di risposta dello strumento, posizionare manualmente un blocco del raggio nella cassetta del cubo del filtro prima dell'obiettivo per evitare la fuoriuscita di qualsiasi luce laser e inclinare il blocco del raggio per ridurre al minimo qualsiasi riflessione nel telaio del microscopio. Nella scheda di controllo del percorso della luce, impostare i filtri di eccitazione, dicroico ed emissione nell'unità disco rotante, in modo tale che la frazione di luce di eccitazione diffusa dal disco di Nipkow rotante possa essere ripresa senza saturare il sistema per un tempo di integrazione della fotocamera minimo di 200 millisecondi. Nella scheda di controllo FLIM, utilizzare la funzione di ricerca del punto massimo sull'intera gamma di ritardi coperti dalla casella di ritardo rapido programmabile.

Quindi controllare la traccia di output visualizzata. E impostare i tempi di ritardo della rotta, in modo che il profilo completo della funzione di risposta dello strumento, rientri nell'intervallo di scansione della casella di ritardo veloce. Regolare i parametri di densità neutra e tempo di esposizione.

Così come l'accumulo di fotogrammi, in modo che la fotocamera non sia satura nel cancello temporale della luminosità e il tempo di integrazione effettivo non sia inferiore a 200 millisecondi. Nel menu di controllo FLIM, selezionare la casella di ritardo rapido e impostare passi di ritardo di 25 picosecondi sull'intero intervallo di ritardo. Quindi, selezionare Popola ritardi e fare clic su Scatta immagine FLIM per acquisire un'immagine della funzione di risposta dello strumento.

E attendi fino al completamento dell'acquisizione. Nel menu di controllo del percorso luminoso, selezionare la densità neutra e fare clic su bloccato per bloccare il laser. Aprire il menu di controllo FLIM e selezionare la casella di ritardo rapido per ridurre il numero di passi di ritardo aumentando il valore nella casella di incremento.

Quindi fare clic su Scatta immagine FLIM per acquisire un'immagine di sfondo della telecamera. Per acquisire i dati dello stampo di riferimento, vai alla scheda di controllo XYZ e inserisci il pozzetto H4 nella finestra di dialogo Vai al pozzo. Quindi, vai alla scheda di controllo del percorso luminoso e seleziona i filtri di eccitazione, dicroici e di emissione appropriati per l'imaging della proteina fluorescente turchese M utilizzando la funzione di ricerca del punto massimo sull'intera gamma della casella di ritardo rapido.

Quindi impostare i parametri appropriati per l'acquisizione dei dati di riferimento dello stampo e di un'immagine di sfondo corrispondente, come appena dimostrato. Per acquisire i dati FLIM da un campione di piastra a più pozzetti, accedere al menu di configurazione dell'acquisizione sequenziata HCA. Selezionare la scheda Posizioni XYZ e impostare i pozzetti da visualizzare e il numero di campi visivi da acquisire per ogni pozzetto.

Selezionare un campo visivo rappresentativo contenente il campione da acquisire e impostare il filtro a densità neutra ottimale nel tempo di integrazione della telecamera per raggiungere il 75% della gamma dinamica della telecamera di lettura. Nella scheda di controllo XYZ, selezionare il controllo di ritorno della messa a fuoco nella finestra di dialogo della messa a fuoco automatica e mettere a fuoco manualmente il microscopio sulle cellule o sulle strutture di interesse. Impostare l'intervallo di ricerca della messa a fuoco automatica su 2000 micrometri e premere invio.

Quindi fare clic su AF ora per avviare la procedura di messa a fuoco automatica. Verrà visualizzato un valore di offset sul campo di messa a fuoco automatica dell'offset di messa a fuoco. Immettere questo valore di offset nella finestra Offset AF e fare clic su AF ora due volte per ripetere la procedura di messa a fuoco automatica.

I valori di offset dovrebbero ora essere impostati su zero, indicando un corretto funzionamento del sistema di messa a fuoco automatica. Successivamente, nella scheda di controllo FLIM, selezionare la funzione di autogating per garantire un campionamento logaritmico dei punti di ritardo. Impostare accumulate frames su un valore che produca il tempo totale di acquisizione dati desiderato.

Quindi, nella finestra di dialogo di acquisizione FLIM, fare clic sul pulsante di avvio della sequenza HCA per eseguire l'acquisizione della piastra multipozzetto FLIM e acquisire un'immagine di sfondo della telecamera come appena dimostrato. Qui viene mostrato un saggio di fret FLIM rappresentativo utilizzando il sistema di fret del modello espresso in cocelle e una piastra multipozzetto, con esempi delle immagini del tempo di fluorescenza acquisite automaticamente dei campi di vista tipici evidenti in ciascun pozzetto. In questo esperimento i pozzetti di controllo negativo hanno presentato la durata di vita più lunga e la durata di vita del donatore ha mostrato i costrutti di tasti più bassi con le lunghezze di linker più corte.

Nel complesso, la durata media di tutti i campi visivi in ciascun pozzetto variava tra le piastre multipozzetto. La media del profilo di decadimento dell'intensità della fluorescenza del donatore su tutte le cellule visualizzate nel pozzetto A1, insieme all'adattamento a un modello di decadimento esponenziale mono e alla funzione di risposta dello strumento, dimostra che il modello di adattamento è valido. Un'ulteriore analisi della durata media della fluorescenza per ciascuna colonna della piastra multipozzetto, ottenuta da un adattamento monoesponenziale pixel wise, dimostra le diminuzioni della durata nei costrutti di tasti con lunghezze di linker più corte, simulando un esperimento con diverse efficienze di fret.

In questo esperimento, i dati FLIM di un saggio fret dell'azione di diversi inibitori sull'oligomerizzazione delle proteine sono stati adattati con un singolo modello di decadimento esponenziale. La mappa della piastra con durata della fluorescenza illustra la durata media per pozzetto su otto campi visivi. Un piccolo set, l'imaging di quattro campi visivi per pozzetto, mentre il nostro test FLIM può essere completato in circa due ore e mezza, compreso il tempo necessario per acquisire la funzione di risposta dello strumento, i dati del die di riferimento e per eseguire l'analisi in FLIM fit.

Quando si esegue un test FLIM, è importante ricordare di acquisire la funzione di risposta dello strumento e i dati del die di riferimento insieme alle loro immagini di sfondo, in modo da avere tutte le informazioni necessarie per analizzare i dati FLIM. Utilizzando il nostro software opensource, FLIM fit, è anche possibile inserire questi dati in modelli di decadimento più complessi. Ad esempio, consentendo la determinazione della frazione di popolazione dei tasti.

La nostra tecnologia FLIM HCA sta aiutando i ricercatori della comunità della scoperta di farmaci a effettuare misurazioni affidabili del fret. In futuro speriamo che questa tecnologia consenta di misurare le costanti di dissociazione in saggi basati su cellule. Speriamo che questo video articolo, anche le informazioni contenute nel nostro Wiki, aiutino altri ricercatori a costruire la propria strumentazione FLIM HCA e ad applicarla ai tasti e ad altri saggi.

Non dimenticare che lavorare con i laser può essere pericoloso e che quando si utilizza tale strumentazione è necessario prendere sempre precauzioni come racchiudere tutti i raggi laser.