Name: Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dellintestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T12:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Impara un protocollo genetico per analizzare il contenuto intestinale di macroinvertebrati acquatici e valutare le interazioni trofiche. Questo metodo migliora gli studi ecologici sui reti alimentari e l'impatto delle specie invasive.

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Ringraziamo Silke Classen dall'Istituto di ricerca per l'ecosistema analisi e valutazione (gaiac), RWTH Aquisgrana per la sua assistenza nella creazione dei set di primer gruppo-specifici utilizzati nel presente protocollo. Ringraziamo anche Peter Martin e Laura Schynawa l'Università di Kiel per la cooperazione negli esperimenti degli acari di acqua. Ringraziamo anche gli assistenti di laboratorio tecnico per mantenere il laboratorio senza intoppi e la preparazione del registro delle imprese e numeri di catalogo. Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; progetto GE 2219/3-1).

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, presentiamo un metodo facile e conveniente per determinazione PCR-basata di interazioni predatore-preda da campioni di campo tramite gruppo-specifici primers per regioni di rDNA, che possono essere combinate con altre analisi non-molecolare dei campioni stessi. Tuttavia, ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo. In primo luogo, assicurare la specificità dei primer utilizzati è essenziale. In secondo luogo, è fondamentale evitare la contaminazione e la perdita di materiale contenuto intestinale dur...

Predatore-preda interazioni, che costituiscono la maggior parte delle interazioni trofiche e dinamiche web di cibo, sono aspetti fondamentali per caratterizzare i flussi di materia ed energia in tutto reti alimentari all'interno e tra gli ecosistemi, che è uno degli obiettivi principali dell'ecologia 1. la determinazione dell'origine e il flusso di carbonio e sostanze nutrienti è promuovere la comprensione della connettività ecologica tra ecosistemi2. Tuttavia, gli ecosistemi, come fiumi e loro bacini imbriferi, non sono solo legati da flussi di materia organica e nutrienti, ma anche dai movimenti di organismi3. Pertanto, alterazioni habitat interrompendo il flusso di risorse che collegano tali sistemi possono fortemente alterare le reti alimentari di entrambi gli ecosistemi, non solo direttamente ma anche indirettamente cambiando la rispettiva composizione delle Comunità di predatore-preda. Per esempio, cambiamenti di reti alimentari sono stati indicati per essere collegati ai movimenti del predator singola specie (ad es., trota iridea)4. Tali modifiche potenzialmente minacciano la biodiversità e il funzionamento degli ecosistemi acquatici. Di conseguenza, analizzando le interazioni predatore-preda nel campo è essenziale per determinare l'impatto dei cambiamenti ambientali indotti dall'uomo, quali le pratiche di gestione dell'acqua, sulla biodiversità degli ecosistemi acquatici nativa.
Poiché tracciamento dei collegamenti trofici è difficile in sistemi complessi, sono stati istituiti diversi approcci che ne consentono la valutazione delle interazioni di alimentazione nel campo5. Tradizionalmente, le indagini di interazioni nel campo di alimentazione sono basate sulla identificazione visiva della preda rimane nelle viscere dissecate e richiedono una conoscenza approfondita circa la diversità morfologica preda. Analisi del contenuto visivo dell'intestino hanno fornito le comprensioni nell'uso delle risorse di diversi gruppi di consumatori (ad es., variazione stagionale nella dieta di aragosta pesce e6 7,8 o alimentazione preferenze di copepodi). Tuttavia, il processo fisico di digestione complica l'analisi del contenuto intestinale visual e solitamente non trova morbido corposo preda-organismi9. Per l'alimentazione di specie dall'ingestione di liquido o per alcuni consumatori di invertebrati marini che sminuzzano intensivamente loro cibo prima dell'ingestione, come anfipodi, identificazione visiva delle prede nel contenuto dell'intestino è Impossibile10. A causa di queste limitazioni, l'analisi molecolare fornisce un'alternativa promettente.
Le analisi molecolari sono ormai diventati uno strumento comune che permettono la rilevazione rapida e precisa preda nel contenuto intestinale. La gamma di tali tecniche è varia: strategie basate su anticorpi monoclonali o reazioni a catena della polimerasi (PCR) sono usate spesso, a causa della loro alta specificità e sensibilità11. Lo sviluppo di nuovi anticorpi monoclonali è ad alta intensità di tempo e di costo, di conseguenza, l'applicazione di altre tecniche molecolari è più utile quando gli anticorpi non sono già presenti11. Un altro approccio comune è l'amplificazione delle regioni di acido desossiribonucleico (DNA), come i geni ribosomiali acido ribonucleico (RNA) presenti nella maggior parte delle specie, utilizzando primer universale imposta12,13. Quando si utilizza questa tecnica, spesso non è possibile identificare l'intera gamma di prede organismi all'interno di origini miste di DNA14. Un approccio efficace per evitare un tale inconveniente è utilizzare primer specifico del gruppo imposta per analisi del contenuto genetico dell'intestino. Progettato per amplificare solo le regioni di DNA di particolari gruppi destinatari ed escludere tutte le altre specie15,16, gruppo-specifici primer consentire l'identificazione di organismi di preda al livello tassonomico dei gruppi specificati senza analisi secondarie di tempo e costo elevato. Tuttavia, come tutti budello analisi dei contenuti, tali analisi forniscono solo un'istantanea del comportamento alimentare. Di conseguenza, combinando analisi del contenuto intestinale molecolare con analisi di tempo-integrazione traccianti naturali (ad es., isotopi stabili) è considerato benefico1,2.
Qui, descriviamo un metodo dettagliato per le indagini di PCR-basata di interazioni predatore-preda usando set di primer gruppo-specifici per regioni di DNA (rDNA) ribosomale nucleare per essere combinato con analisi degli isotopi stabili del campione stesso. Descriviamo la rilevazione del DNA del singolo preda gruppi tramite l'elettroforesi del gel dell'agarosi. Inoltre, presentiamo un'opportunità per ulteriori analisi di a valle dei prodotti di PCR di tale gruppo-specifici primers applicabile ogni volta che una risoluzione tassonomica superiore specificità dei primer è richiesta. Perché i frammenti di DNA a singola elica (ssDNA) conformazioni terziario di forma che sono determinate dalla loro sequenza primaria17, piccole variazioni nei frammenti amplificati da tale gruppo specifico primer portano a cambiamenti conformazionali. Tali cambiamenti possono essere rilevati dalle analisi di polimorfismo (SSCP) conformazione singolo filamento con gel di poliacrilammide17,18, consentendo una più precisa identificazione di organismi di preda (fino al livello di specie).
Mentre l'elettroforesi del gel dell'agarosi è uno strumento comune e poco costoso per visualizzare i frammenti di DNA e determinare la loro lunghezza approssimativa19, la risoluzione dipende dalla quantità di DNA e la macchiatura tintura usato20. Di solito, la visualizzazione è dritto in avanti quando si lavora con campioni di DNA puri, ma potenzialmente basse quantità di prede DNA nel contenuto dell'intestino dei consumatori può complicare le marcature di risultati di elettroforesi su gel di agarosio. Ancora, questo metodo di rilevamento è fattibile allo schermo un basso numero di esemplari dei consumatori dal campo per uno o alcuni gruppi in preda, ma complicazione nel punteggio che rende la proiezione di un elevato numero di campioni per più preda taxa tempo estremamente intensivo e così impraticabile. Un metodo di rilevazione più sensibile è l'analisi automatizzata di frammenti tramite elettroforesi capillare, che inoltre permette di determinare l'esatta lunghezza di frammenti21. Parecchi del microsatellite basato su studi hanno dimostrato che utilizzando tinture fluorescenti differenti come etichette, è possibile rilevare e determinare diversi frammenti di lunghezza paragonabile di frammento automatizzato analisi22,23, 24. Pertanto, vi presentiamo anche un protocollo dettagliato per la rivelazione in parallelo di DNA da una preda più gruppi usando la PCR con primer di gruppo-specifici con etichetta set e rilevamento tramite l'analisi del frammento automatizzato con un sequenziatore automatizzato. Inoltre, presentiamo i risultati di un caso di studio che dimostra che la rilevazione di DNA di preda tramite l'analisi del frammento automatizzato è un approccio che permette anche una quantificazione relativa delle prede ingerite.

<table><tbody><tr><td>azoto liquido</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per il trasporto di campioni di campo di macroinvertebrati al laboratorio.</td></tr><tr><td>Provette di reazione da 1,5 ml - Safelock</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Per la raccolta di campioni di consumo sul campo e la successiva conservazione in azoto liquido, le provette di reazione non devono necessariamente essere pulite con PCR. Per evitare l'esplosione dei tubi, il coperchio dei tubi deve essere forato con un ago.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Assicurarsi che l'ingrandimento sia adatto a preparare il tratto gastro-intestinale della dimensione del consumatore di interesse.</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per sezionare il tratto gastrointestinale di campioni di consumo sotto lo stereomicroscopio.</td></tr><tr><td>Foceps in acciaio inossidabile: Pinza Dumont n. 7</td><td>Bioform</td><td>B40d</td><td>Questa pinza curva in acciaio inossidabile a volte può essere molto utile per tenere il campione fissato tra la parte curva senza perforare il tratto gastrointestinale.</td></tr><tr><td>Foceps in acciaio inossidabile: pinza Dumont Electronic No. 5</td><td>Bioform</td><td>B40b</td><td>Questa pregiata pinza in acciaio inossidabile è ideale per la preparazione del tratto gastro-intestinale di campioni di consumo.</td></tr><tr><td>DNA-ExitusPlus</td><td>AppliChem</td><td>A7409,1000RF</td><td>Soluzione di decontaminazione per la rimozione di contaminazioni da DNA e RNA</td></tr><tr><td>Tovagliolo di carta senza peluria</td><td>Qualsiasi</td> bilancia <td>da laboratorio NA</td><td></td></tr><tr><td>Qualsiasi</td><td></td><td>NA</td><td>La precisione deve essere di almeno 0,01 g.</td></tr><tr><td>Pipette per microlitri (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 &mu; L)</td><td>Qualsiasi</td><td></td> provetta NA <td></td></tr><tr><td>Safe-Lock da 2,0 ml</td><td>VWR</td><td>211-2165</td><td>È fondamentale che queste provette di razione siano prive di inibitori di DNA, DNasi, RNasi e PCR (PCR clean)!</td></tr><tr><td>Provette Safe-Lock da 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>211-2164</td><td>È fondamentale che queste provette di razione siano prive di inibitori di DNA, DNasi, RNasi e PCR (PCR clean)!</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio &ge; 99,5%, p.a., ACS, ISO</td><td>carlroth</td><td>3957.3</td><td>Per tampone di estrazione del sale (SEB) e soluzione di NaCl 5M necessaria per l'estrazione del DNA.</td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)-amminometano Tris</td><td>carlroth</td><td>4855.2</td><td>Per tampone di estrazione del sale (SEB) e tampone TBE</td></tr><tr><td>Pipette per microlitri (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 &mu; L)</td><td>carlroth</td><td>8043.1</td><td>Per tampone di estrazione del sale (SEB) e tampone TBE</td></tr><tr><td>Acido borico &ge; 99,8 %, p.a., ACS, ISO</td><td>carlroth</td><td>6943.2</td><td>Per tampone TBE. Non necessario se si ottiene un tampone TBE disponibile in commercio.</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td> <td>carlroth</td><td>4360.1</td><td>Per l'estrazione della DNA</td></tr><tr><td>proteinasi K liofilo.</td><td>carlroth</td><td>7528.1</td><td>Preparare una soluzione di lavoro contenente 10 mg/ml.</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Quiagen</td><td>85300</td><td>Mulino per microsfere per l'omogeneizzazione dei campioni.</td></tr><tr><td>Perline in acciaio inossidabile, 5 mm</td><td>Quiagen</td><td>69989</td><td>Per l'omogeneizzazione dei campioni.</td></tr><tr><td>Termoscuotitore di riscaldamento</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata: himac CT 15 RE</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td>Centrifuga refrigerata utilizzata per la centrifugazione durante l'estrazione del DNA (Protocollo 1).</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>carlroth</td><td>6752,5</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 99,8 %, p.a.</td><td>Qualsiasi</td> acqua <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Grado di biologia molecolare (ddH2O)</td><td>AppliChem</td><td>A7398,1000</td><td>acqua priva di nucleasi (sterilizzata in flusso e trattata con DEPC) utilizzata per la risospensione del DNA e ogni volta che si riferisce a ddH2O all'interno del manoscritto</td></tr><tr><td>Olonucleotidi non modificati</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>NA</td><td>Primers non marcati</td></tr><tr><td>Olegonucleotidi modificati</td><td>Metabion International AG</td><td>NA</td><td>Primer marcati</td></tr><tr><td>peqGOLD Taq all inclusive</td><td>VWR Peqlab</td><td>01-1000</td><td>Taq all inclusive per miscele di reazioni PCR (tampone di reazione Y e S, dNTP e MgCl2)</td></tr><tr><td>Primus 96 advanced gradient thermocycler o peqStar96x Universal Gradient</td><td>Peqlab</td><td>NA</td><td>I set di primer sono stati originariamente stabiliti su un termociclatore a gradiente avanzato Primus 96. Poiché questo ciclatore era piuttosto vecchio, abbiamo quindi verificato se i nostri set di primer sono efficienti e specifici nelle stesse condizioni utilizzando il peqSta96x (che potrebbe anche simulare il modello precedente). Tuttavia, i test hanno dimostrato che i nostri primer funzionano bene e sono ancora specifici (vedi Koester et al. 2013) senza utilizzare la simulazione della vecchia macchina.</td></tr><tr><td>Piastre PCR standard a 96 pozzetti</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-2879</td><td>Utilizzate per le reazioni PCR.</td></tr><tr><td>Strisce per provette a basso profilo da 0,15 ml con strisce per tappo piatto</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-3223</td><td>Strisce per tappo utilizzate per chiudere le piastre PCR.</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td>Utilizzato per l'elettroforesi su gel.</td></tr><tr><td>Microonde</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pallone conico</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduato</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Unità di elettroforesi orizzontale e rispettivi pettini con denti</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per elettroforesi su gel di agarosio.</td></tr><tr><td>Alimentatore per elettroforesi PS3002</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di bromuro di etidio 1 %</td><td>carlroth</td><td>2218.1</td><td>Utilizzato per preparare il bagno di colorazione per gel di agarosio.</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>carlroth</td><td>6749.1</td><td>Necessario per il tampone di denaturazione per le analisi SSCP.</td></tr><tr><td>Blu di bromfenolo</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td>Necessario per il colorante di caricamento per l'elettroforesi su gel di agarosio.</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>carlroth</td><td>4621.1</td><td>Necessario per il colorante di caricamento per l'elettroforesi su gel di agarosio.</td></tr><tr><td>100 bp-DNA-Ladder esteso</td><td>carlroth</td><td>T835.1</td><td>Come standard di dimensioni per l'elettroforesi su gel di agarosio.</td></tr><tr><td>Sistema di documentazione UV</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Per visualizzare i risultati dell'elettroforesi su gel.</td></tr><tr><td>Rotiphorese NF-Acrilammide/Bis-soluzione 40 % (29:1)</td><td>carlroth</td><td>A121.1</td><td>Per la preparazione di gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Perossidisolfato di ammonio</td><td>carlroth</td><td>9592.2</td><td>Per la preparazione di gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>clip pieghevoli (32 mm)</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per la preparazione di gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>scatola di plastica di forma quadrata (21 &volte; 6,5 &volte; 5 cm)</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per la preparazione di gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>carlroth</td><td>23.67.1</td><td>Per la preparazione di gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Becher</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RC 10 Refrigeratore digitale</td><td>VWR</td><td>462-0138</td><td>Per analisi SSCP con elettroforesi su gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Unità di elettroforesi verticale P10DS (OWL Separation Systems)</td><td>VWR</td><td>700-2361</td><td>Per analisi SSCP con elettroforesi su gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Lastra di vetro dentellata</td><td>VWR</td><td>730-0261</td><td>Per analisi SSCP mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Lastra di vetro vuota</td><td>VWR</td><td>730-0260</td><td>Per analisi SSCP mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Distanziatori</td><td>VWR</td><td>730-0262</td><td>Per analisi SSCP utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Pettine a 25 denti</td><td>VWR</td><td>730-0294</td><td>Per analisi SSCP con elettroforesi su gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Piattaforma di agitazione</td><td>Qualsiasi</td><td>NA</td><td>Per l'agitazione costante del bagno di colorazione.</td></tr><tr><td>Colorazione per acido nucleico GelStar (Lonza Rockland, Inc.)</td><td>Biozym</td><td>850535 (50535)</td><td>Per la colorazione di gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp</td><td>AB Sciex</td><td>608098</td><td>Per analisi automatizzate dei frammenti. Dimensione standard per il lotto B.</td></tr><tr><td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp</td><td>AB Sciex</td><td>608095</td><td>Per analisi automatizzate dei frammenti. Formato standard per il lotto A.</td></tr><tr><td>Soluzione di caricamento dei campioni (SLS)</td><td>AB Sciex</td><td>608082</td><td>Per analisi automatizzate dei frammenti.</td></tr><tr><td>Piastra di sequenziamento - Micropiastra PCR in polipropilene a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>6551</td><td>Per analisi automatizzate di frammenti.</td></tr><tr><td>Centrifuga a piastre, PerfectSpin P</td> VWR Mini centrifuga a piastre <td>Peqlab</td><td>NA</td><td>utilizzata per la centrifuga di prodotti PCR.</td></tr><tr><td>Piastra tampone - 96 pozzetti EIA/RIA Polistirene trasparente a fondo piatto non trattato Micropiastra</td><td>Corning</td><td>9017</td><td>Per analisi automatizzate di frammenti.</td></tr><tr><td>GenomeLab Tampone di separazione</td><td>AB Sciex</td><td>608012</td><td>Per analisi automatizzate di frammenti.</td></tr><tr><td>Gel di separazione - LPAI</td><td>AB Sciex</td><td>608010</td><td>Per analisi automatizzate di frammenti.</td></tr><tr><td>Sequenzer - CEQ8000 Sistema di analisi genetica</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>Per l'analisi automatizzata dei frammenti.</td></tr><tr><td>GeneMarker V1.95</td><td>Softgenetics</td><td>NA</td><td>Per analizzare i risultati delle analisi automatizzate dei frammenti.</td></tr></tbody></table>

protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rdna acquatica macroinvertebrati using group-specific primers

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

L'analisi di reti alimentari è essenziale per una migliore comprensione degli ecosistemi. Ad esempio, interazioni cibo web possono subire cambiamenti severi causati dall'invasione di specie non indigene. Tuttavia, un'esatta identificazione delle interazioni predatore-preda campo è difficile in molti casi. Queste analisi sono spesso basate su una valutazione visiva del contenuto intestinale o l'analisi dei rapporti dell'isotopo stabile (δ15N e δ13C). Tali metodi richiedono una conoscenza completa circa, rispettivamente, diversità morfologica o firma isotopica da preda singoli organismi, che conduce agli ostacoli nell'esatta identificazione di organismi di preda. Analisi del contenuto intestinale Visual sottovalutare soprattutto organismi morbido corposo preda, perché macerazione, ingestione e la digestione delle prede organismi rendono difficile identificazione di specie particolari. Quindi, strategie di reazione a catena (PCR) basata della polimerasi, ad esempio l'utilizzo di primer specifico del gruppo imposta, forniscono un potente strumento per l'indagine sulle interazioni di rete alimentare. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per studiare il contenuto dell'intestino dei macroinvertebrati consumatori da campo utilizzando primer gruppo-specifici insiemi di ribosomal nucleare dell'acido desossiribonucleico (rDNA). DNA può essere estratta dall'interi esemplari (nel caso di piccoli taxa) o dal contenuto dell'intestino di esemplari raccolti sul campo. Presenza e l'efficienza funzionale dei modelli di DNA devono essere confermati direttamente dall'individuo testato utilizzando primer universale imposta le rispettive subunità della DNA di targeting. Inoltre dimostriamo che preda consumata può essere determinato ulteriore fino a livello di specie tramite PCR con primer di gruppo-specifici non modificato combinato con analisi di polimorfismo (SSCP) conformazione successivo singolo filamento usando i gel di poliacrilammide. Inoltre, mostriamo che l'uso di tinture fluorescenti differenti come etichette consente la proiezione parallela per frammenti di DNA di preda diversi gruppi dai campioni contenuti multipli dell'intestino tramite l'analisi del frammento automatizzato.

Abbiamo utilizzato con successo la procedura descritta in questo protocollo per analisi di dieta all'interno di diversi studi. In questa sezione presentiamo esempi che descrivono l'applicabilità delle diverse sezioni del protocollo.
Ad esempio, per dimostrare l'efficacia del set di primer specifico del gruppo stabilito da autori28 e le potenzialità di analisi successive a valle dei prodotti di PCR mediant...

Analisi del contenuto intestinale più comune di macroinvertebrati sono visive. Che richiedono intensa conoscenza diversità morfologica degli organismi di preda, essi perdere morbido corposo preda e, grazie alla forte comminuzione della preda, sono quasi impossibile per alcuni organismi, tra cui anfipodi. Forniamo dettagliati, romanzo approcci genetici per macroinvertebrati preda identificazione nella dieta di anfipodi.

Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è migliorare le indagini sulla ecologia trofica, in particolare a partire da campioni di campo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ecologia delle reti alimentari, come l'impatto delle specie invasive sulle interazioni trofiche. Il vantaggio principale è l'applicazione aggiuntiva a analisi trofiche integrate nel tempo sugli stessi esemplari e la possibilità che può essere utilizzato praticamente da ogni ecologo.Sebbene abbiamo sviluppato questo approccio per ottenere informazioni sul consumo di prede da parte di organismi acquatici, esso può essere applicato anche ad altri scopi, ad esempio per determinare la composizione delle specie all'interno di campioni di macroinvertebrati bentonici. La procedura sarà dimostrata da Christian Sodemann, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare l'esperimento, trasferire il tratto gastrointestinale del predatore precedentemente dissezionato in una provetta da reazione safe-lock da due millilitri contenente 440 microlitri di buffer di estrazione salina.Congelare immediatamente i campioni a meno 20 gradi Celsius fino all'estrazione del DNA. Dopo aver prelevato

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Questa pubblicazione descrive come utilizzare il sistema di identificazione delle specie di pesce Agilent per identificare la specie di un pesce con l'estrazione del DNA e l'esecuzione di analisi di PCR e RFLP.

Basati sul DNA Fish Identification Specie protocollo

La comunità batterica attivo associato con l'intestino di Spodoptera littoralis, è stato determinato mediante stabile-isotopo probing (SIP) accoppiato a pyrosequencing. Utilizzando questa metodologia, l'identificazione delle specie di batteri metabolicamente attivi all'interno della comunità è stato fatto con alta risoluzione e precisione.

Identificazione dei batteri metabolicamente attivo nell&#39;intestino del generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA isotopi stabili Probing Utilizzo<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosio

PCR combinata con alta risoluzione melt analisi (HRMA) è dimostrato come un metodo rapido ed efficace al genotipo zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Viene fornito un protocollo per quantificare i geni rRNA 16S batterici e i trascritti dai sedimenti costieri tramite PCR in tempo reale. La metodologia comprende la co-estrazione di DNA e RNA; preparazione di RNA privo di DNA; e quantificazione del gene e della trascrizione dell'rRNA 16S tramite RT-q-PCR, inclusa la costruzione di curve standard.

DNA-RNA simultanea Estrazione da sedimenti costieri e la quantificazione dei geni 16S rRNA e trascrizioni da Real-time PCR

Vi presentiamo un protocollo per la valutazione funzionale delle biblioteche unico sito di saturazione di mutagenesi complete di proteine ​​che utilizzano high-throughput sequencing. È importante sottolineare che questo approccio utilizza coppie di primer ortogonali al multiplex di costruzione di biblioteche e sequenziamento. Risultati rappresentativi utilizzando TEM-1 β-lattamasi selezionato ad un dosaggio clinicamente rilevante di ampicillina sono forniti.

Un protocollo per la valutazione funzionale del Whole-Protein Saturazione mutagenesi biblioteche Utilizzando High-Throughput Sequencing

Questo manoscritto descrive un dettagliato protocollo standardizzato di alta-16S rRNA-amplicone sequenziamento. Il protocollo introduce un protocollo integrato, in uniforme, fattibile ed economico a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l'analisi dei dati. Questo protocollo consente l'analisi di un gran numero di campioni con rigorosi standard e diversi controlli.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere i dati di sequenza di amplicon del suolo, rizosfera e radice endosphere microbiomi. Questa informazione può essere utilizzata per studiare la composizione e la diversità delle comunità microbiche pianta-collegato ed è adatta per l'uso con una vasta gamma di specie di piante.

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

Zebrafish sono stati usati come organismi modello genetico affidabile nella ricerca biomedica, soprattutto con l'avvento delle tecnologie di modifica del gene. Quando sono previsti fenotipi larvali, identificazione di estrazione ed il genotipo di DNA può essere impegnativo. Qui, descriviamo una procedura efficiente genotipizzazione per larve di zebrafish, coda di ritaglio, più presto 72 h post-fertilizzazione.

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Questo protocollo descrive un efficace approccio di ibridazione in situ per rilevare i livelli di espressione dell'mRNA e i modelli spaziali dei geni bersaglio nel fluido coelomico del nudus Sipunculus.

Ibridazione in situ per Sipunculus nudus Coelomic Fluid

I test del DNA ambientale richiedono una progettazione, un test, un'ottimizzazione e una convalida rigorosi prima che possa iniziare la raccolta dei dati sul campo. Qui, presentiamo un protocollo per portare gli utenti attraverso ogni fase della progettazione di un saggio qPCR specifico per specie e basato su sonda per il rilevamento e la quantificazione di un DNA di specie bersaglio da campioni ambientali.

Sviluppo e test di test quantitativi PCR specifici per specie per applicazioni del DNA ambientale

Il protocollo rileva i geni chiave del ciclo del metano nelle zone umide costiere del Texas meridionale e visualizza la loro distribuzione spaziale per migliorare la comprensione della regolazione del metano e dei suoi impatti ambientali in questi ecosistemi dinamici.

Visualizzazione delle dinamiche microbiche del ciclo del metano nelle zone umide costiere

Impara un protocollo genetico per analizzare il contenuto intestinale di macroinvertebrati acquatici e valutare le interazioni trofiche. Questo metodo migliora gli studi ecologici sui reti alimentari e l'impatto delle specie invasive.

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