Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di migliorare le indagini sull'ecologia trofica, in particolare da campioni sul campo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ecologia della rete alimentare, come l'impatto delle specie invasive sulle interazioni trofiche. Il vantaggio principale è l'ulteriore applicazione per l'integrazione più temporizzata delle analisi trofiche per gli stessi campioni e che può essere applicata praticamente da tutti gli ecologi.

Sebbene abbiamo stabilito questo approccio per fornire informazioni sul consumo di prede da parte dei consumatori acquatici, può essere applicato anche per altri scopi, ad esempio per determinare la composizione delle specie all'interno di campioni di macroinvertebrati bentonici. A dimostrare la procedura sarà Christian Sodemann, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare questo esperimento, trasferire il tratto gastrointestinale del predatore precedentemente sezionato in una provetta di reazione da due millilitri contenente 440 microlitri di tampone per l'estrazione del sale.

Congelare immediatamente i campioni a meno 20 gradi Celsius fino all'estrazione del DNA. Dopo aver rimosso i campioni dal congelatore, iniziare l'estrazione del DNA utilizzando una pinza per aggiungere una perlina di acciaio inossidabile da cinque millilitri a ciascuna provetta del campione, quindi lasciare i campioni sul banco a temperatura ambiente per scongelarli. Utilizzando un mulino a sfere, omogeneizzare i campioni per un minuto a 15 hertz.

Dopo aver centrifugato brevemente i campioni, aggiungere ai campioni 90 microlitri di SDS al 10% e cinque microlitri di 10 milligrammi per millilitro di proteinasi K. Quindi, agitare accuratamente i campioni e incubarli a 60 gradi Celsius con agitazione costante a 400 giri/min su un ThermoMixer per un'ora. Per favorire ulteriormente la lisi, agitare i campioni ogni 10 minuti durante questa incubazione.

Dopo una breve centrifugazione, pipettare 350 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari nei campioni. Agitare per 30 secondi a un minuto per miscelare completamente i campioni. Quindi, centrifugare a 16, 200 volte g a cinque gradi Celsius per 40 minuti.

Quindi una delle cose più critiche quando si estraggono i campioni dalla centrifuga è evitare che le perle si muovano e disturbino il pellet contenente tutte le particelle che devono essere rimosse dal passaggio. Quindi, trasferire con cura circa 600 microlitri di surnatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere 600 microlitri di isopropanolo ghiacciato e capovolgere con cura il tubo alcune volte.

Conservare a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Dopo aver tolto i campioni dal congelatore, centrifugarli a 16, 200 volte g a temperatura ambiente per 20 minuti. Scartare il surnatante facendo attenzione a non perdere il pellet e utilizzare una carta velina per asciugare accuratamente il tubo.

Lavare questi pellet contenenti DNA aggiungendo 200 microlitri di etanolo ghiacciato al 70% e poi centrifugare a 16, 200 volte g a temperatura ambiente per 10 minuti. Eliminare il surnatante con cautela e utilizzare carta velina priva di lanugine per asciugare accuratamente il tubo. Infine, utilizzando una pipetta da 10 microlitri regolata a otto microlitri, rimuovere con cura il surnatante rimasto, facendo attenzione a non disturbare il pellet.

Asciugare il pellet fino a quando tutto l'etanolo non è evaporato. Quindi aggiungere da 50 a 100 microlitri di acqua priva di nucleasi, agitare brevemente e lasciare a quattro gradi Celsius durante la notte per sciogliere il pellet. Per verificare l'efficienza funzionale dei campioni di DNA qui estratti, testare ciascuno di essi mediante PCR, utilizzando set di primer universali adatti alla rispettiva fonte alimentare.

Inizia aggiungendo primer, miscela dNTP, tampone di reazione, Taq DNA polimerasi e acqua purificata in una provetta di reazione da 1,5 o 2,5 millilitri e agitando la miscela di reazione standard. Ora, per ogni campione di DNA, trasferire un microlitro di estratto di DNA corrispondente in nove microlitri della miscela di reazione standard all'interno di una piastra PCR. Chiudere la piastra, inserirla nel termociclatore e avviare il programma PCR.

Dopo la reazione PCR terminata, utilizzare un'opzione a breve termine di una mini centrifuga per centrifugare i prodotti PCR. Quindi mescolare tre microlitri di ciascun prodotto PCR con un microlitro di colorante a caricamento sei volte. Caricare questi campioni nelle fessure del gel di un gel di agarosio precedentemente preparato.

Caricare 1,5 microlitri di una scala di DNA da 100 coppie di basi in una fessura del gel come taglia standard. Chiudere il coperchio dell'unità di elettroforesi, collegarla a un alimentatore e far funzionare il gel a 100 volt per centimetro per 35 minuti. Dopo l'elettroforesi, rimuovere il gel e metterlo in un bagno di colorazione precedentemente preparato per circa 10 minuti.

Infine, rimuovere il gel dal bagno di colorazione e posizionarlo su un sistema di documentazione del gel e visualizzarlo secondo il manuale. Per analizzare il contenuto intestinale del predatore, utilizzare soluzioni di lavoro precedentemente preparate di estratto di DNA. Eseguire reazioni di PCR separate per ciascuno dei 16 set di primer specifici per gruppo di prede.

Includere un controllo positivo con DNA proveniente da un esemplare appartenente al rispettivo gruppo di prede e un controllo negativo con DNA della specie predatore. È fondamentale documentare esattamente l'assegnazione del campione all'interno di ciascuna piastra PCR per evitare di raggruppare campioni diversi mentre li si carica su una piastra di sequenziamento per il rilevamento di un sequenziatore di assegnazione e, in ultima analisi, di assegnare risultati errati a un individuo consumatore. Quindi, eseguire le reazioni di PCR utilizzando lo stesso protocollo descritto in precedenza, regolato in base alla temperatura di ricottura specifica e al numero di ciclo per ciascun set di primer utilizzato.

Per rilevare i frammenti amplificati in queste reazioni PCR, eseguire analisi automatizzate dei frammenti in due lotti, A e B.Preparare una miscela contenente la soluzione di caricamento del campione, o SLS, e il rispettivo standard dimensionale per ciascun lotto. Successivamente, scongelare i prodotti PCR precedentemente congelati delle otto reazioni PCR appartenenti al rispettivo lotto, assicurandosi che siano tenuti al buio. Usa un'opzione a breve tiratura di una mini centrifuga per farli girare.

Su una piastra di sequenziamento, caricare il numero di pozzetti corrispondente al numero di campioni da analizzare con 22 microlitri della rispettiva miscela standard di dimensioni SLS per ciascun campione. Quindi caricare un microlitro di prodotto PCR di ciascuna delle otto reazioni PCR nei rispettivi pozzetti della piastra. Quindi, utilizzare un'opzione a breve termine di una mini centrifuga a piastre per centrifugare con cura questa miscela.

Dopodiché, copri ogni pozzetto con una goccia di olio minerale. Quindi riempire i pozzetti di reazione di una piastra tampone con 250-300 microlitri di tampone di separazione del DNA. Utilizzare il software del sequenziatore capillare per creare una configurazione del campione secondo le istruzioni del produttore.

Assicurarsi che l'assegnazione dei campioni all'interno della configurazione del campione corrisponda all'allocazione del campione nella piastra di sequenziamento e che la configurazione del campione contenga il metodo appropriato per elaborare il rispettivo lotto. Quando si analizzano i risultati, è importante ricontrollare visivamente l'elettroferogramma di ciascun campione e confermare/non confermare ogni picco chiamato per ciascun primer marcatore impostato separatamente e inserire picchi non chiamati che soddisfano i criteri di un primer marcatore impostato manualmente o eliminare quelli errati. Dopo aver condotto esperimenti di alimentazione per determinare l'efficacia dei set di primer specifici per il gruppo stabiliti per le analisi PCR eseguite in questo protocollo, i risultati della PCR utilizzando il DNA del tratto gastrointestinale del predatore sono stati analizzati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio e il polimorfismo di conformazione a filamento singolo, o SSCP.

L'elettroforesi su gel di agarosio ha rivelato singole bande di DNA a doppio filamento, che non potevano essere distinte tra le diverse specie di prede studiate. Al contrario, l'elettroforesi SSCP è riuscita a distinguere tra le diverse specie di prede confrontando i campioni di contenuto intestinale con i campioni di riferimento. Il DNA estratto dall'intestino dell'acaro dell'acqua dopo l'esperimento di alimentazione è stato sequenziato in diversi periodi di tempo dopo il consumo della preda.

Da una a 50 ore dopo l'alimentazione, la quantità relativa di DNA della preda rilevata è stata significativamente ridotta. Il DNA estratto dall'anfipode invasivo, Dikerogammarus villosus gut, è stato testato per il DNA delle prede macroinvertebrate utilizzando 16 set di primer specifici per il gruppo descritti in questo protocollo. Solo il 16% del contenuto intestinale di D. villosus era positivo per il DNA appartenente a uno dei 16 taxa di prede bersaglio.

Inoltre, il DNA di 12 taxa di prede testati è stato trovato in almeno un campione, mentre il DNA di quattro taxa non è mai stato rilevato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che i primer utilizzati siano specifici per i taxa all'interno del proprio sistema. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estendere la tua ricerca sulle interazioni trofiche integrando i metodi abitualmente utilizzati all'interno del tuo laboratorio con analisi genetiche.