Veloce e semplificato Metodo per alta through-put Isolamento dei miRNA da altamente purificato lipoproteine ​​ad alta densità

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di sviluppare un approccio semplificato per isolare rapidamente le lipoproteine purificate ad alta densità dal plasma sanguigno umano per l'analisi dei micro RNA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in epatologia e cardiologia, come la comprensione dei meccanismi molecolari e delle funzioni protettive delle lipoproteine ad alta densità. Alcuni dei principali vantaggi di questa tecnica sono che i micro RNA HDL purificati vengono pre-isolati da un volume inferiore di campioni in un breve periodo di tempo.

In questo protocollo, il plasma viene ottenuto da campioni di sangue venoso periferico a digiuno mediante più fasi di centrifugazione come descritto nel testo del protocollo. Trasferire il plasma in un nuovo tubo. E misurare la densità del plasma utilizzando un densitometro a temperatura ambiente, secondo le istruzioni del produttore.

Per rimuovere gli esosomi circolanti che rappresentano una fonte di contaminazione da micro RNA, aggiungere 252 microlitri di soluzione di precipitazione degli esosomi a un millilitro di plasma. E incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi centrifugare la miscela per 30 minuti per eliminare gli esosomi.

Trasferire un millilitro del surnatante risultante in una provetta per ultracentrifuga in policarbonato a pareti spesse per un'ulteriore lavorazione, come dimostrato nel prossimo segmento video. L'isolamento delle lipoproteine ad alta densità, o HDL, si ottiene mediante un protocollo di ultracentrifugazione a gradiente di densità in tre fasi, che prevede un isolamento sequenziale di lipoproteine a densità molto bassa, o VLDL, lipoproteine a bassa densità, o LDL e HDL. Le tre diverse soluzioni di densità, A, B e C, devono essere preparate fresche, seguendo la procedura descritta nel testo del protocollo.

In una provetta per ultracentrifuga in policarbonato da 6,5 millilitri a pareti spesse, mescolare un millilitro di plasma e 200 microlitri di Fat Red 7B privo di nucleasi. Quindi, sovrapporre con cura cinque millilitri di soluzione A sopra la miscela. Se necessario, aggiungere altro Fat Red 7B sopra la soluzione A per bilanciare il peso di ciascun tubo.

Caricare i tubi in un rotore pre-raffreddato. Mettere il rotore in una centrifuga a pavimento e centrifugare per due ore. Alla fine della corsa, dovrebbero essere visibili due strati.

Rimuovere 1,5 millilitri dello strato superiore, che rappresenta la frazione VLDL. E conservalo a quattro gradi Celsius. Utilizzare una pipetta per trasferire quattro millilitri dal fondo della provetta a una nuova provetta da 50 millilitri.

Questo contiene la frazione LDL e HDL. Il passo successivo è l'isolamento delle LDL. Mescolare due millilitri di soluzione B e 100 microlitri di Fat Red 7B privo di nucleasi nella provetta contenente la frazione LDL e HDL.

Metti sul ghiaccio per cinque-dieci minuti. Trasferire 6,5 millilitri del campione miscelato in una provetta per ultracentrifuga in policarbonato a pareti spesse. Caricare la provetta in un rotore pre-raffreddato e centrifugare per tre ore.

Al termine della centrifugazione, rimuovere 1,5 millilitri dello strato superiore, che rappresenta la frazione LDL e mantenere a quattro gradi Celsius. Trasferire quattro millilitri dal fondo della provetta, contenente la frazione HDL, in una provetta sterile da 50 millilitri. Il terzo passo è l'isolamento delle HDL.

Mescolare due millilitri di soluzione C, 100 microlitri di Fat Red 7B privo di nucleasi e 15 microlitri di beta-mercaptoetanolo al 98% nella provetta, contenente la frazione HDL. Controllare la densità della miscela. Caricare la provetta in un rotore pre-raffreddato e centrifugare per tre ore.

Dopodiché, rimuovere due millilitri dello strato superiore, che rappresenta la frazione HDL, e mantenerlo a quattro gradi Celsius. L'eccesso di sale deve essere rimosso dalle frazioni lipoproteiche per evitare interferenze con la successiva elettroforesi su gel di agarosio e PCR. In questo video, la desalinizzazione e la concentrazione saranno dimostrate solo per la frazione HDL.

Aggiungere 13 millilitri di PBS freddo alla frazione HDL e trasferire in un dispositivo di filtro centrifugo con il taglio del peso molecolare di 10K. Centrifugare in un rotore a secchiello oscillante, a 4000 volte g e quattro gradi Celsius, per 30 minuti. Dissalare la frazione HDL, una seconda volta, utilizzando 13 millilitri di PBS freddo, e centrifugare come prima.

Dopo la centrifugazione, rimuovere le lipoproteine contenenti soluti e mantenerle a quattro gradi Celsius. Per valutare la qualità e la purezza delle lipoproteine isolate, è stata eseguita l'elettroforesi su gel di agarosio con standard di lipoproteine umane, inclusi come riferimento dimensionale. I risultati rappresentativi di un isolamento, senza beta mercaptoetanolo, hanno mostrato che la frazione HDL è priva di qualsiasi contaminazione da VLDL e mostra una tipica mobilità alfa.

Tuttavia, la frazione HDL mostra anche tracce di mobilità beta dovute alla contaminazione con lipoproteine. L'aggiunta di beta mercaptoetanolo alla soluzione C, durante l'ultima fase di centrifugazione, rimuove efficacemente tutte le lipoproteine contaminanti dalla frazione HDL. Per dimostrare la fattibilità della quantificazione dei micro RNA, trasportati nelle HDL umane, purificati con questo metodo, due diversi micro RNA sono stati amplificati mediante PCR quantitativa in tempo reale.

In questi grafici di amplificazione, le linee orizzontali rappresentano la soglia di rilevamento. I dati rappresentativi della PCR in tempo reale da HDL isolato, ottenuti da sei campioni, hanno mostrato la rilevazione coerente di entrambi i micro RNA. Infine, le analisi della curva di fusione mostrano chiaramente un singolo picco distinto per entrambi i micro RNA, coerente con l'amplificazione specifica nella precedente PCR.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in nove ore, insieme alle procedure di desalinizzazione, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante lavorare sempre a una temperatura compresa tra i quattro e gli otto gradi centigradi. E per regolare la densità di ogni frazione lipoproteica prima dell'ultracentrifugazione.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la microscopia elettronica, per rispondere a ulteriori domande, come la purezza dell'HDL. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica consentirà ai ricercatori, nel campo della sindrome metabolica, di esplorare i micro RNA associati alle HDL come biomarcatori, nell'uomo con sospetta steatosi epatica. Può anche essere utilizzato per comprendere meglio la funzione delle HDL e i meccanismi molecolari con cui altera la biologia cellulare.