Veloce e semplificato Metodo per alta through-put Isolamento dei miRNA da altamente purificato lipoproteine ​​ad alta densità

L'obiettivo generale di questo metodo è sviluppare un approccio semplificato per isolare rapidamente lipoproteine ad alta densità purificate dal plasma sanguigno umano per l'analisi del micro RNA. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in epatologia e cardiologia, ad esempio comprendere i meccanismi molecolari e le funzioni protettive delle lipoproteine ad alta densità. Tra i principali vantaggi di questa tecnica vi è il fatto che il micro RNA delle HDL purificate viene pre-isolato da volumi ridotti di campione in breve tempo.

In questo protocollo, il plasma viene ottenuto da campioni di sangue venoso periferico a digiuno mediante diverse centrifugazioni, come descritto nel testo del protocollo. Trasferire il plasma in un nuovo tubo e misurare la densità del plasma utilizzando un densitometro a temperatura ambiente, seguendo le istruzioni del produttore.

Per rimuovere gli esosomi circolanti che rappresentano una fonte di contaminazione da microRNA, aggiungere 252 microlitri di soluzione di precipitazione degli esosomi a un millilitro di plasma. Incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi centrifugare la miscela per 30 minuti per ottenere un pellet di esosomi.

Trasferire un millilitro del soprannatante ottenuto in un tubo per ultracentrifuga in policarbonato con pareti spesse per ulteriori elaborazioni, come dimostrato nel prossimo segmento video. L'isolamento delle lipoproteine ad alta densità, o HDL, viene effettuato mediante un protocollo di ultracentrifugazione su gradiente di densità in tre passaggi, che prevede l'isolamento sequenziale delle lipoproteine a very low density, o VLDL, delle lipoproteine a bassa densità, o LDL, e delle HDL. Le tre diverse soluzioni di densità, A, B e C, devono essere preparate al momento, seguendo la procedura descritta nel testo del protocollo.

In un tubo da ultracentrifuga in policarbonato da 6,5 millilitri con pareti spesse, mescolare un millilitro di plasma e 200 microlitri di Fat Red 7B privo di nucleasi. Successivamente, stratificare con attenzione cinque millilitri di soluzione A sopra la miscela. Se necessario, aggiungere ulteriore Fat Red 7B sopra la soluzione A per bilanciare il peso di ciascun tubo.

Caricare i tubi in un rotore preraffreddato. Posizionare il rotore in una centrifuga da pavimento e centrifugare per due ore. Al termine della corsa, dovrebbero essere visibili due strati.

Rimuovere 1,5 millilitri dello strato superiore, corrispondente alla frazione VLDL, e conservarlo a quattro gradi Celsius. Utilizzare una pipetta per trasferire quattro millilitri dal fondo del tubo in un nuovo tubo da 50 millilitri.

Questo contiene la frazione LDL e HDL. Il passaggio successivo è l'isolamento della LDL. Mescolare due millilitri della soluzione B e 100 microlitri di Fat Red 7B privo di nucleasi nel tubo contenente la frazione LDL e HDL.

Mettere sul ghiaccio per cinque-dieci minuti. Trasferire 6,5 millilitri del campione miscelato in un tubo ultracentrifuga in policarbonato con pareti spesse. Caricare il tubo in un rotore preraffreddato e centrifugare per tre ore.

Al termine della centrifugazione, rimuovere 1,5 millilitri dello strato superiore, corrispondente alla frazione di LDL, e mantenere a quattro gradi Celsius. Trasferire quattro millilitri dal fondo del tubo, contenente la frazione di HDL, in un tubo sterile da 50 millilitri. Il terzo passaggio è l'isolamento dell'HDL.

Mescolare due millilitri di soluzione C, 100 microlitri di Fat Red 7B privo di nucleasi e 15 microlitri di beta-mercaptoetanolo al 98% nel tubo contenente la frazione di HDL. Verificare la densità della miscela. Posizionare il tubo in un rotore preraffreddato e centrifugare per tre ore.

Successivamente, rimuovere due millilitri dello strato superiore, corrispondente alla frazione HDL, e mantenere a quattro gradi Celsius. È necessario rimuovere il sale in eccesso dalle frazioni di lipoproteine per evitare interferenze con la successiva elettroforesi su gel di agarosio e la PCR. In questo video, la desalazione e la concentrazione verranno dimostrate soltanto per la frazione HDL.

Aggiungere 13 millilitri di PBS freddo alla frazione HDL e trasferirla in un dispositivo filtrante centrifugo con cutoff di peso molecolare di 10K. Centrifugare in un rotore a cestelli oscillanti, a 4000 × g e a quattro gradi Celsius, per 30 minuti. Desaltare la frazione HDL una seconda volta, utilizzando 13 millilitri di PBS freddo e centrifugando come in precedenza.

Dopo la centrifugazione, rimuovere i soluti contenenti lipoproteine e conservarli a quattro gradi Celsius. Per valutare la qualità e la purezza delle lipoproteine isolate, è stata eseguita un'elettroforesi su gel di agarosio utilizzando standard di lipoproteine umane, inclusi come riferimento dimensionale. I risultati rappresentativi di un'isolazione, effettuata senza beta-mercaptoetanolo, hanno mostrato che la frazione HDL è priva di qualsiasi contaminazione da VLDL ed esibisce una tipica mobilità alfa.

Tuttavia, la frazione HDL mostra anche tracce di mobilità beta a causa della contaminazione con lipoproteine. L'aggiunta di beta-mercaptoetanolo alla soluzione C, durante l'ultimo passaggio di centrifugazione, rimuove efficacemente tutte le lipoproteine contaminanti dalla frazione HDL. Per dimostrare la fattibilità della quantificazione di micro RNA trasportati nell'HDL umano, purificati con questo metodo, due diversi micro RNA sono stati amplificati mediante PCR quantitativa in tempo reale.

In questi grafici di amplificazione, le linee orizzontali rappresentano la soglia di rilevamento. Dati rappresentativi di PCR in tempo reale ottenuti da HDL isolate, provenienti da sei campioni, hanno mostrato un rilevamento costante di entrambi i microRNA. Infine, le analisi delle curve di denaturazione mostrano chiaramente un picco singolo e distinto per entrambi i microRNA, coerente con un'amplificazione specifica nella PCR precedente.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in nove ore, comprese le procedure di desalazione, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante lavorare a una temperatura compresa tra i quattro e gli otto gradi centigradi, in ogni momento. E regolare la densità di ciascuna frazione di lipoproteine prima dell'ultracentrifugazione.

Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la microscopia elettronica, al fine di rispondere ad ulteriori quesiti, ad esempio sulla purezza delle HDL. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica permetterà ai ricercatori nel campo del sindrome metabolica di esplorare le micro-RNA associate alle HDL come biomarcatori in soggetti umani con sospetta steatoepatite. Potrà inoltre essere utilizzata per comprendere meglio la funzione delle HDL e i meccanismi molecolari attraverso cui queste alterano la biologia cellulare.