Correlativo luce e microscopia elettronica allo Studio microgliali Interazioni con placche beta-amiloide

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le placche di beta-amiloide nelle sezioni cerebrali da modelli murini di Alzheimer prima dell'immunocolorazione pre-incorporata e del processamento tissutale per la microscopia elettronica. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della neuroimmunologia, come l'interazione delle cellule microgliali con i grafici della sinapsi vicino all'amiloide-beta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di pre-selezionare sezioni di tessuto cerebrale contenenti grafici di amiloide-beta nelle regioni e negli strati di interesse.

Sebbene questo metodo possa essere applicato al morbo di Alzheimer, può essere applicato anche a qualsiasi altra malattia o tessuto in cui è presente l'amiloidosi. Per prima cosa, prepara una soluzione di cinque milligrammi per millilitro di composto metossi X04. Utilizzando una bilancia mirco, pesare cinque milligrammi di metossi X04.

Sotto una cappa aspirante, sciogliere il metossi X04 in 100 microlitri di DMSO e mescolare fino ad ottenere una soluzione limpida e verdastra. Aggiungere successivamente 450 microlitri di glicole propilenico e 450 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato mescolando. Mantieni la soluzione mescolando a quattro gradi Celsius per una notte.

Il giorno successivo, si dovrebbe vedere un'emulsione verde-giallastra. Dopo aver iniettato metossi X04, aggiungere una dose di 10 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo e sacrificare l'animale nel momento desiderato secondo i metodi approvati, lavare il cervello fissato con para ormaldeide tre volte con PBS refrigerato. Quindi, usando una lama di rasoio affilata, rimuovere il bulbo olfattivo e tagliare il cervello coronalmente in due o tre pezzi di altezza approssimativamente uguale, che possono essere sezionati contemporaneamente per accelerare la procedura.

Incollare i pezzi di tessuto cerebrale sulla piastra del campione fissata nel vassoio. Assicurarsi che la superficie di taglio liscia aderisca saldamente alla piastra del campione. Aggiungere la soluzione di PBS al vassoio fino a quando l'intera superficie cerebrale non è completamente sommersa.

Posizionare il vassoio nel vibratomo e regolare le impostazioni del vibratomo per ottenere sezioni spesse 50 micron. Iniziare il taglio e, in caso di schermatura, trasferire immediatamente le sezioni in PBS utilizzando un pennello fine. In alternativa, le sezioni possono essere collocate in fiale di vetro contenenti soluzione crioprotetta per la conservazione a 20 gradi Celsius.

Con l'aiuto di un atlante cerebrale stereotassico di topo, selezionare le sezioni cerebrali contenenti la regione di interesse e posizionare ciascuna sezione in crioprotettore in un pozzetto di una piastra di coltura a 24 pozzetti. Quindi, utilizzare una pipetta monouso per aggiungere una goccia di PBS su un vetrino da microscopio, quindi posizionare la sezione sulla gocciolina. Esaminare la sezione al microscopio a fluorescenza per identificare le regioni contenenti placche a-beta marcate con metossi X04.

Senza spostare il tavolino del microscopio, è possibile acquisire immagini delle regioni di interesse in campo chiaro e in modalità fluorescenza. Ogni immagine deve mostrare la stessa regione in entrambi i campi per correlare la placca alla regione strutturale della sezione di tessuto. Salva e assegna un nome alle immagini scattate in base al numero dell'animale.

Registrare anche il numero del pozzo nella targa e il campo delle foto scattate. Riposizionare la sezione nel pozzetto designato una volta completata l'imaging. Esamina la sezione successiva della sequenza utilizzando la stessa procedura per evitare di asciugare le sezioni.

Per allineare le immagini, aprire le immagini del campo chiaro e del campo UV per lo stesso ROI in ImageJ. Quindi, usa il plug-in MosaicJ per allineare i bordi delle due immagini. Salva l'immagine allineata e combinata in base al numero del pozzetto in una cartella con il numero dell'animale in questione.

Combina le immagini di diverse sezioni dello stesso animale per identificare e localizzare le placche nella regione di interesse. Al termine del processo di screening, conservare le sezioni esaminate a 20 gradi Celsius in una piastra di coltura a 24 pozzetti contenente crioprotettore fino a quando non viene eseguita l'immunocolorazione o un'ulteriore elaborazione. Per prima cosa, preparare una soluzione di tetrossido di osmio all'1% in tampone fosfato in una fiala di vetro.

Poiché il tetrossido di osmio è fotosensibile, coprire la fiala di vetro con un foglio di alluminio per proteggere la soluzione dalla luce. Dopo il lavaggio in tampone fosfato, rimuovere il tampone dalle sezioni e stenderle in piano con un pennello fine. Assicurati di appiattire le sezioni immediatamente prima di aggiungere il tetrossido di osmio poiché eventuali pieghe nelle sezioni diventeranno permanenti e il tentativo di appiattire il tessuto dopo la fissazione dell'osmio romperà solo le sezioni.

Utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere tetrossido di osmio alle sezioni una goccia alla volta fino a quando la sezione non è immersa. Coprire il pozzetto con un foglio di alluminio per proteggere le sezioni dalla luce e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Durante questa incubazione preparare la resina plastica in un becher monouso.

Unire i componenti in ordine e mescolare bene utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri fino ad ottenere un colore uniforme. Trasferire la miscela preparata in piatti di alluminio. Questi riceveranno le sezioni di tessuto una volta che sono stati disidratati.

Una volta trascorso il tempo di incubazione, disidratare le sezioni in concentrazioni crescenti di etanolo per due minuti ciascuna. Trasferire le sezioni disidratate dalla piastra di coltura a 24 pozzetti in fiale di vetro da 20 millilitri. Quindi immergere le sezioni nell'ossido di propilene tre volte per due minuti ogni volta per rimuovere l'etanolo residuo.

Quindi, utilizzare una punta di pipetta in vetro piegato o un pennello fine per trasferire le sezioni dalla soluzione di ossido di propilene nella resina plastica e lasciare per una notte per l'infiltrazione a temperatura ambiente. Dopo l'infiltrazione, posizionare i piatti di alluminio contenenti i campioni in un forno a 50-60 gradi Celsius per 10-15 minuti. Per incorporare le sezioni su fogli di pellicola di policlorotrifluoroetilene, utilizzare prima un pennello fine per dipingere un sottile strato di resina sulla sezione.

Quindi, spostare una sezione di tessuto alla volta da un piatto di pesata in alluminio al foglio di pellicola PCTFE. Rimuovi la resina in eccesso intorno al tessuto, facendo attenzione a non disturbarlo. Dopo aver spostato tutte le sezioni da un piatto di pesata al foglio di pellicola PCTFE, posizionare un secondo foglio PCTFE sopra il primo creando un sandwich di tessuto e resina tra i due fogli.

Polimerizzare la resina in un incubatore per tre giorni a una temperatura compresa tra 55 e 60 gradi Celsius. Il tessuto è quindi pronto per il sezionamento ultrasottile e l'esame ultrastrutturale. Le immagini seguenti mostrano la doppia imaging di una sezione ippocampale utilizzando le modalità di campo chiaro e fluorescenza.

Le regioni e gli strati di interesse sono visualizzati in campo chiaro. Mentre le placche a-beta vengono localizzate con successo utilizzando un filtro UV a una distanza compresa tra 340 e 380 nanometri. Questa immagine mostra una sezione ippocampale prima dell'immunocolorazione pre-incorporata per IBA1.

Una targa visibile è delineata dalla linea tratteggiata. Questa immagine mostra la stessa sezione dopo l'immunocolorazione pre-incorporata per IBA1 e l'elaborazione per la microscopia elettronica a trasmissione. Si noti che la placca circondata da una linea tratteggiata è ancora visibile durante l'elaborazione dei tessuti per la microscopia elettronica.

Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere completato in una settimana se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che ogni passaggio deve essere eseguito rigorosamente per ridurre la probabilità di contaminazione e altri degradi strutturali che influenzeranno la qualità dei campioni. Non dimenticare che lavorare con l'osmio può essere estremamente pericoloso e quindi dovresti sempre prendere precauzioni come indossare un camice da laboratorio e guanti durante l'esecuzione di questa procedura.

Assicurati di scartare dopo l'uso alla fine dell'esperimento in conformità con le linee guida della tua struttura.