Un metodo facile per piante polysome Profiling

Ciao, sono Cecile. Lavoro presso la LGBP di Marsiglia. Il protocollo che descriveremo in questo video è un metodo semplice per isolare polisomi e monosomi da vari tessuti vegetali al fine di identificare gli mRNA che vengono tradotti attivamente e per studiare la regolazione della traduzione.

A titolo di esempio, vi mostreremo l'isolamento dei polisomi da piantine di Arabidopsis thaliana di sei giorni, il successivo isolamento dell'RNA e l'analisi dei risultati. Seminate i semi nel piatto e lasciateli due giorni a quattro gradi. Quindi coltiva le piante durante sei giorni.

Raccogli la piantina e macinala in azoto liquido. Pesare 300 milligrammi di polvere vegetale e aggiungere 2,4 millilitri di tampone polisomiale. Centrifuga per raccogliere frammenti di piante e caricare il surnatante sulla sommità di un gradiente di saccarosio.

Gradiente di ultra-centrifuga quindi raccoglierlo dal basso verso l'alto con lettura continua del diametro esterno. Estrarre la frazione in un polisoma, un monosoma e una frazione surnatante e precipitare l'RNA durante la notte. Ultracentrifugare, risospendere il pellet ed estrarre l'RNA per la successiva analisi. Qualche giorno prima di eseguire la profilazione dei polisomi, preparare il gradiente di saccarosio.

Preparare una soluzione di saccarosio al 50, 35 e 20% e mantenerli a quattro gradi. Versare lo strato di saccarosio al 50%. Congelalo in un congelatore a meno 40.

Dopo sei ore, aggiungere lo strato al 35% e congelarlo in congelatore a meno 40 per una notte. Versare il primo strato del 20% e congelarlo. Il giorno dell'esperimento, rimuovere il numero necessario di gradienti dal congelatore.

Aggiungere l'ultimo strato di saccarosio al 20% e lasciare scongelare le sfumature in una cella frigorifera. Prepara il campione che abbiamo appena raccolto pianta. Qui stiamo utilizzando piantine di Arabidopsis thaliana di sei giorni.

Raccogli le piante congelate con azoto liquido e macinale accuratamente. Peso 300 milligrammi di polvere vegetale. Aggiungere rapidamente 2,4 millilitri di tampone polisomico fresco e omogeneizzare.

Pipettare la soluzione in due provette da 1,5 millilitri. Centrifugare l'estratto citosolico. Pipettare il surnatante.

Fai attenzione a evitare frammenti di piante. Avrebbero rovinato il profilo nel passaggio successivo. Caricare il surnatante sul gradiente di saccarosio senza interrompere il gradiente.

Mettere la pendenza in una benna del rotore SW 41. Centrifuga. Per visualizzare il profilo del polisoma e raccogliere la frazione, utilizziamo un semplice sistema costituito da un tubo capillare che si immerge nel gradiente. È collegato a una cuvetta UV.

È autocollegato a una pompa peristaltica. Uno spettrofotometro UV registra continuamente l'OD man mano che il gradiente avanza attraverso la cuvetta. Il raccoglitore di frazioni consente la raccolta di frazioni di due millilitri.

Pulire la cuvetta e inserirla nello spettrofotometro. Rimuovi la pendenza dal secchio senza disturbarlo. Le clorofille devono essere concentrate sulla parte superiore del gradiente.

Immergere i tubi capillari sul fondo del gradiente. Avviare la pompa peristaltica. Il gradiente viene raccolto dal basso verso l'alto e l'OD viene letto continuamente.

Vengono raccolte frazioni di due millilitri. Ecco la forma di un profilo classico. La precipitazione dell'RNA viene eseguita utilizzando guanidinio cloridrato e isopropanolo.

Per prima cosa, versare un volume di guanidinio cloridrato in un tubo da 50 millilitri e poi aggiungere la frazione. Quindi aggiungere 1,5 volume di isopropanolo e 50 microgrammi di corriere uguale. Far precipitare l'RNA durante la notte a meno 20 gradi.

Trasferire le frazioni in provette da ultracentrifuga da 40 millilitri e bilanciare la provetta con l'isopropanolo. Centrifuga. Rimuovere il surnatante e asciugare il pellet all'aria. Risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone TE caldo.

Estrarre ulteriormente l'RNA eseguendo una classica estrazione con cloroformio fenolo. Qui è mostrato un profilo rappresentativo dell'estratto di polisomi dalla piantina di Arabidopsis di sei giorni. Il picco principale corrisponde al monosoma, l'mRNA che è associato a un singolo ribosoma.

La prima parte del profilo corrisponde alle frazioni polisomiali, ovvero l'mRNA associato a molti ribosomi. Ogni picco corrisponde all'associazione del nuovo ribosoma all'mRNA. L'ultima parte del profilo corrisponde alla cosiddetta frazione surnatante che contiene le subunità ribosomiali libere e l'RNA.

Una grande quantità di subunità 60S forma una spalla vicino al picco del monosoma. Per valutarne l'integrità, gli RNA estratti dalle frazioni possono essere analizzati su un classico gel di Aragosio prima di essere utilizzati per ulteriori esperimenti. Abbiamo utilizzato questo protocollo per isolare polisomi da piantine di Arabidopsis thaliana, ma anche da rosette giovani e vecchie, nonché da foglie di Nicotiana benthamiana, pomodoro e riso, quindi dovrebbe funzionare con una vasta gamma di piante e tessuti.

Gli RNA purificati sono compatibili con l'analisi di micro array, nonché per l'identificazione di piccoli RNA associati a frazioni polisomiali.