Un metodo facile per piante polysome Profiling
28 agosto 2016
Questo protocollo descrive un metodo semplice per estrarre e frazionare i trascritti dai tessuti vegetali sulla base del numero di ribosomi legati. Permette una stima globale dell'attività traduttiva e la determinazione dello stato traduzionale di specifici mRNA.
Ciao, sono Cecile. Lavoro al LGBP di Marsiglia. Il protocollo che descriveremo in questo video è un metodo semplice per isolare polisomi e monosomi da diversi tessuti vegetali, al fine di identificare gli mRNA che sono attivamente tradotti e per studiare la regolazione della traduzione.
Come esempio, vi mostreremo l'isolamento di polisomi da piantine di Arabidopsis thaliana di sei giorni, l'isolamento successivo dell'RNA e l'analisi dei risultati. Seminare i semi su una piastra e lasciarli due giorni a quattro gradi. Successivamente, far crescere le piante per sei giorni.
Raccolti i semenzali e macinateli in azoto liquido. Pesare 300 milligrammi di polvere vegetale e aggiungere 2,4 millilitri di buffer per polisomi. Centrifugare per raccogliere i frammenti vegetali e caricare il surnatante sulla sommità di un gradiente di saccarosio.
Successivamente alla centrifugazione ultraveloce con gradiente, raccogliere le frazioni dal basso verso l'alto con lettura continua dell'OD. Raccogliere la frazione in una frazione di polisoma, una di monosoma e una di soprannatante, quindi precipitare l'RNA per tutta la notte. Centrifugare in ultravelocità, risospendere il pellet ed estrarre l'RNA per analisi successive. Alcuni giorni prima di eseguire il profilo dei polisomi, preparare il gradiente di saccarosio.
Preparare soluzioni di saccarosio al 50%, 35% e 20% e mantenerle a quattro gradi. Versare lo strato di saccarosio al 50%. Congelarlo in un congelatore a meno 40 gradi.
Dopo sei ore, aggiungere lo strato al 35% e congelarlo in un congelatore a meno 40 °C durante la notte. Versare lo strato iniziale al 20% e congelarlo. Nel giorno dell'esperimento, rimuovere dal congelatore il numero necessario di gradienti.
Aggiungere l'ultimo strato di saccarosio al 20% e lasciare scongelare i gradienti in una stanza fredda. Preparare il campione di pianta appena raccolto. In questo caso, stiamo utilizzando piantine di Arabidopsis thaliana di sei giorni.
Raccogliere le piante congelate in azoto liquido e macinarle accuratamente. Pesare 300 milligrammi di polvere vegetale. Aggiungere rapidamente 2,4 millilitri di tampone per polisomi fresco e omogeneizzare.
Trasferire la soluzione in due provette da 1,5 millilitro. Centrifugare l'estratto citosolico. Aspirare il soprannatante.
Attenzione a evitare frammenti vegetali, poiché comprometterebbero il profilo nel passaggio successivo. Caricare il soprannatante sul gradiente di saccarosio senza alterare il gradiente.
Posizionare il gradiente in un secchio del rotore SW 41. Centrifugare. Per visualizzare il profilo dei polisomi e raccogliere la frazione, utilizziamo un sistema semplice costituito da un tubo capillare che viene immerso nel gradiente. È collegato a una cuvetta UV.
È collegato autonomamente a una pompa peristaltica. Uno spettrofotometro UV registra in continuo la densità ottica (OD) man mano che il gradiente attraversa la cuvetta. Il raccoglitore di frazioni permette la raccolta di frazioni da due millilitri.
Pulire la cuvetta e posizionarla nello spettrofotometro. Rimuovere il gradiente dal secchio senza disturbarlo. I clorofilli devono essere concentrati nella parte superiore del gradiente.
Immergere i tubi capillari fino al fondo del gradiente. Avviare la pompa peristaltica. Il gradiente viene raccolto dal basso verso l'alto e l'OD viene letto in modo continuo.
Vengono raccolte frazioni di due millilitri. Questa è la forma di un profilo classico. La precipitazione dell'RNA viene eseguita utilizzando cloridrato di guanidinio e isopropanolo.
Prima, versare un volume di cloridrato di guanidinio in un tubo da 50 millilitri e quindi aggiungere la frazione. Aggiungere poi 1,5 volumi di isopropanolo e 50 microgrammi di vettore equimolare. Precipitare l'RNA per tutta la notte a meno 20 gradi.
Trasferire le frazioni in provette da 40 millilitri per ultracentrifuga e bilanciare la provetta con isopropanolo. Centrifugare. Rimuovere il soprannatante e lasciare asciugare il pellet all'aria. Risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone TE tiepido.
Estrarre ulteriormente l'RNA eseguendo una classica estrazione con fenolo e cloroformio. Qui è mostrato un profilo rappresentativo di un estratto di polisomi ottenuto da piantine di Arabidopsis di sei giorni. Il picco principale corrisponde al monosoma, ovvero all'mRNA associato a un singolo ribosoma.
La prima parte del profilo corrisponde alle frazioni polisomiali, ovvero l'mRNA associato a molti ribosomi. Ogni picco corrisponde all'associazione di un nuovo ribosoma all'mRNA. L'ultima parte del profilo corrisponde alla cosiddetta frazione del supernatante, che contiene i subunità ribosomiali libere e l'RNA.
Una grande quantità di subunità 60S forma una spalla accanto al picco del monosoma. Per valutarne l'integrità, gli RNA estratti dalle frazioni possono essere analizzati su un gel classico di agarosio prima di essere utilizzati per esperimenti successivi. Abbiamo utilizzato questo protocollo per isolare i polisomi da piantine di Arabidopsis thaliana, ma anche da rosette giovani e vecchie, nonché da foglie di Nicotiana benthamiana, pomodoro e riso, pertanto dovrebbe funzionare con un'ampia gamma di piante e tessuti.
Gli RNA purificati sono compatibili con l'analisi mediante microarray nonché con l'identificazione di RNA di piccole dimensioni associati a frazioni polisomiali.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare polisomi e monosomi da tessuti vegetali, consentendo l'identificazione di mRNA attivamente tradotti e lo studio della regolazione della traduzione. L'esempio fornito si concentra sull'isolamento di polisomi da piantine di Arabidopsis thaliana di sei giorni.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia vegetale
- Regolazione della traduzione
- Analisi dell'mRNA
Sfondo
- Comprendere l'attività di traduzione è fondamentale per lo studio dell'espressione genica.
- I polisomi sono aggregati di ribosomi che traducono l'mRNA, mentre i monosomi sono ribosomi singoli.
- Questo metodo fornisce informazioni sullo stato traduzionale di specifici mRNA.
- Arabidopsis thaliana è un organismo modello nella ricerca vegetale.
Scopo dello studio
- Isolare polisomi e monosomi da tessuti vegetali.
- Identificare gli mRNA che sono attivamente tradotti.
- Studiare la regolazione della traduzione nelle piante.
Metodi Utilizzati
- Piantare i semi su piastre e sottoporli a stratificazione fredda per due giorni.
- Fare crescere le piantine per sei giorni in condizioni ottimali.
- Isolare polisomi e monosomi dai tessuti vegetali.
- Analizzare l'RNA per determinare l'attività di traduzione.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di polisomi da piantine di Arabidopsis thaliana.
- Identificazione di mRNA attivamente tradotti.
- Informazioni sulla regolazione della traduzione nei tessuti vegetali.
- Dimostrazione dell'efficacia del metodo nello studio della traduzione.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per lo studio della traduzione nelle piante.
- Migliora la comprensione della regolazione dell'espressione genica.
- L'approccio può essere applicato a diverse specie vegetali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il profilo dei polisomi fornisce un'istantanea diretta dell'attività traduttiva, consentendo una riduzione meccanicistica dei rischi associati alle ipotesi sui bersagli nella scoperta di biopharma di origine vegetale. Distinguendo i pool di mRNA attivamente tradotti, il metodo supporta la validazione dei bersagli e lo screening fenotipico in sistemi di rilevanza agricola. Questo approccio aumenta la sicurezza predittiva nella selezione di candidati promettenti per il miglioramento delle colture o per applicazioni nell'agricoltura molecolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche collegando l'abbondanza di mRNA all'output traduzionale.
- Valore operativo: Chiarisce l'attività del percorso attraverso parametri di coinvolgimento dei ribosomi.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando bersagli con un coinvolgimento traduzionale sostenuto.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti in piattaforme di espressione vegetale.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione dei saggi mediante profilazione quantitativa dell'OD260 e riproducibilità delle frazioni.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma su tessuti di Arabidopsis, Nicotiana, pomodoro e riso.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la validazione del bersaglio nella fase di scoperta alla valutazione preclinica di biomarcatori in sistemi vegetali.
- De-risking meccanicistico: Si concentra sul valore predittivo isolando popolazioni di mRNA definite dal carico di ribosomi.
- Sistema rilevante per le malattie: Applicabile a modelli di colture utilizzati nella produzione molecolare e biofarmaceutica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale della scoperta, supportando la verifica delle ipotesi prima dell'identificazione del composto attivo e consentendo una continuità traslazionale nella valutazione preclinica in sistemi a base vegetale.
- Biologia della Scoperta: Verifica l'interazione con il bersaglio misurando le variazioni nei rapporti polisoma/monosoma in condizioni sperimentali.
- Screening: Fornisce letture di profilazione dei ribosomi utili per confrontare gli effetti di composti o perturbazioni genetiche.
- Analisi: Produce tracciati quantitativi di OD260 e resa di RNA frazionato per l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca Translazionale: Si integra con la scoperta di biomarcatori nei processi produttivi di farmaci molecolari vegetali.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una capacità di frazionamento applicabile a diversi tessuti vegetali e specie.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica risolvendo gli stati traduttivi degli mRNA bersaglio.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso la frazionatura standardizzata su gradiente di saccarosio e il monitoraggio continuo dell'OD.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo evidenze dirette della modulazione del bersaglio a livello traduttivo.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio basata sui dati di attività traduttiva.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei tessuti vegetali e nella preparazione del buffer per polisomi.
- Richiede l'uso di attrezzature per ultracentrifugazione e sistemi di raccolta delle frazioni dotati di monitoraggio UV.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei gradienti e i protocolli di raggruppamento delle frazioni.
- Richiede considerazioni di adattamento qualora si voglia estendere l'applicazione a sistemi vegetali non modello.
- Comporta limitazioni pratiche legate all'integrità dell'RNA durante le fasi di frazionamento ed estrazione.
