Caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di Citometria a Flusso Imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti

L'obiettivo generale di questo studio è confrontare due diversi metodi di isolamento dei monociti umani per la generazione di cellule dendritiche in vitro e caratterizzare l'espressione della superficie cellulare CT11c e CT14 delle popolazioni derivate dai monociti risultanti mediante citometria a flusso. Questi protocolli di isolamento dei monociti possono contribuire allo sviluppo di metodi affidabili per la purificazione di cellule dendritiche umane per la ricerca e le applicazioni cliniche. Il vantaggio principale di questi protocolli è che facilitano l'isolamento dei monociti umani e la loro differenziazione in cellule derivate da monociti vitali e funzionali.

Inoltre, questo è il primo studio a caratterizzare la popolazione specifica di cellule dendritiche derivate da monociti mediante citometria a flusso con imaging a singola cellula. Questo metodo può essere applicato anche come alternativa per l'isolamento di altre cellule rare con una resa adeguata per applicazioni di ricerca a valle. La dimostrazione visiva di questi metodi è fondamentale in quanto può essere difficile gestire i campioni di sangue in modo sicuro senza le istruzioni e l'esperienza appropriate.

Iniziare diluendo il campione di sangue in un rapporto uno a uno con PBS in un pallone T75. Quindi, aggiungere 15 millilitri di soluzione di gradiente di densità in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e sovrapporre accuratamente da 25 a 30 millilitri di sangue diluito sul gradiente. Per ottenere una corretta separazione delle cellule mononucleate del sangue periferico, caricare il sangue sulla soluzione del gradiente di densità rapidamente, ma con attenzione e senza mescolare gli strati.

Separare le cellule mediante centrifugazione, seguita dal trasferimento dello strato di interfaccia dei globuli bianchi in una nuova provetta conica da 50 millilitri. Lavare le celle due volte in PBS, rimettendo in sospensione il pellet finale in 10 millilitri di tampone di lisi di potassio cloruro di ammonio per 15 minuti a 4 gradi centigradi. Quindi lavare le celle altre due volte in PBS.

Per isolare i monociti con il metodo dell'aderenza, coltivare cinque volte 10 nelle sette cellule del pellet di PBMC risultante per 10 millilitri di terreno completo in un nuovo pallone T75 per due ore a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica in un incubatore umidificato. Al termine dell'incubazione, scartare le cellule galleggianti non aderenti e lavare delicatamente le cellule aderenti due volte con PBS. Quindi, nutrire le cellule aderenti con un terreno di coltura cellulare completo integrato con GMCSF umano e IL4 e rimettere la coltura nell'incubatore per cinque-sette giorni.

Per isolare i monociti mediante separazione magnetica, dopo aver raccolto la PBMC mediante separazione in gradiente di densità, trasferire lo strato di globuli bianchi in una provetta di polistirene da cinque millilitri e risospendere le cellule in PBS a una concentrazione da cinque volte 10 a sette cellule per millilitro. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di un cocktail di arricchimento di monociti umani per millilitro alle cellule mescolando e incubare le cellule con il cocktail a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aggiungere 50 microlitri di particelle magnetiche per millilitro di cellule mescolando attentamente e incubare le cellule a 4 gradi Celsius per cinque minuti.

Al termine della seconda incubazione, aggiungere PBS alle cellule per portare il volume totale fino a due virgola cinque millilitri e mescolare pipettando due o tre volte. Quindi posizionare il tubo di polistirolo in un apposito dispositivo magnetico a temperatura ambiente. Dopo due minuti e mezzo, con la provetta ancora nel magnete, decantare la frazione di monociti purificata in una nuova provetta conica da 15 millilitri.

Quindi coltivare i monociti purificati e il terreno di coltura cellulare completo integrato con GMCSF e IL4 per cinque-sette giorni, come appena dimostrato. Dopo sette giorni di differenziazione, somministrare una volta per 10 agli aliquat a sei cellule delle cellule dendritiche derivate dai monociti nel numero appropriato di provette da cinque millilitri e aggiungere 50 microlitri di siero umano inattivato a caldo a ciascun campione per bloccare qualsiasi risultato non specifico. Dopo 10 minuti, centrifugare le cellule e risospendere i pellet negli opportuni anticorpi primari coniugati a fluorescenza per 20 minuti a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce.

Quindi lavare le celle due volte in un millilitro di PBS, risospendendo i pellet in 100 microlitri di PBS per una volta dieci per le sei cellule. Poco prima dell'analisi, aggiungere un microlitro di DAPI a ciascuna provetta. Quindi, leggere i campioni su un citometro a flusso con imaging a cellula singola secondo le istruzioni del produttore.

In media, i monociti isolati con il metodo dell'aderenza rappresentano circa il 6,2% della popolazione totale di monociti del sangue periferico, o PBMC, mentre i monociti isolati mediante separazione magnetica rappresentano fino al 25% del totale delle PBMC. I monociti isolati con entrambi i metodi sono ugualmente vitali. Gli MDDC differenziati dai monociti purificati con entrambi i metodi sono stati prima gated sulla base di cellule DAPI negative o vitali da singole cellule totali, seguiti dal gating di ciascuna popolazione cellulare.

Entrambi i metodi di isolamento hanno prodotto una bassa popolazione CD14 positiva ed entrambi i metodi hanno prodotto un'alta popolazione CD11c positiva totale. Un'ulteriore analisi fenotipica è stata eseguita su tutte le cellule CD11c positive e anche se l'isolamento magnetico fornisce una percentuale più elevata di cellule CD11c positive CD14 positive, questo effetto non è stato significativo se confrontato con il metodo di aderenza. Queste cellule CD11c positive doppie positive e CD14 positive possono essere MDDC differenziate in fase iniziale che non hanno ancora abbandonato il marcatore monocitico CD14.

Quando si analizzano le singole cellule CD11c positive, il metodo di aderenza fornisce la massima resa di cellule CD11c positive e CD14 negative. Queste singole cellule positive possono essere MDDC differenziate in stadio avanzato. Una volta padroneggiate, le tecniche di aderenza e isolamento magnetico possono essere completate rispettivamente in tre-quattro e una o due ore, se eseguite correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di avere citochine fresche di differenziazione delle cellule dendritiche ogni 48 ore quando il terreno viene reintegrato. Lavorare con fluidi a rischio biologico, come il sangue, può essere estremamente dannoso e l'uso di dispositivi di protezione individuale e metodi di smaltimento appropriati deve essere sempre adottato durante l'esecuzione di queste procedure. Questo studio apre la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare l'uso di monociti umani e cellule dendritiche per il trattamento terapeutico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottimizzare l'isolamento dei monociti umani per generare diverse popolazioni di cellule derivate dai monociti in vitro.