Name: Caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di Citometria a Flusso Imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Scopri due metodi di isolamento dei monociti umani per generare cellule dendritiche in vitro e caratterizza l'espressione dei marcatori di superficie CD11c e CD14 mediante citometria a flusso imaging.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questa ricerca è supportata dal National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, premio K99/R00 AA021264. Un ulteriore supporto di laboratorio come parte del pacchetto di avvio è stato ricevuto dal Dipartimento di Immunologia, dall'Istituto di Farmacologia NeuroImmunitaria, dall'Herbert Wertheim College of Medicine e dall'Ufficio di Ricerca e Sviluppo Economico della FIU. Gianna Casteleiro è stata supportata da NIH/NIGMS R25 GM061347. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

studi del sangue umano complessivi sono stati esaminati e approvati dal Institutional Review Board (IRB) di FIU, protocollo IRB approvazione # IRB-13-0440. leukopaks umani sono stati acquistati dalla banca del sangue comunità in Miami, FL. 1. Isolamento di PBMC da Tecnica gradiente di densità standard <ol><li> Eseguire una diluizione 1: 1 di sangue con soluzione salina 1x-tampone fosfato in un pallone T75. </li><li> Pipettare 15 ml di soluzione gradiente di densità in 50 ml provette da centrifuga e accuratamente strato (25 - 30 ml / provetta) del sangue diluito su tutto questo gradiente. </li><li> Centrifugare per 20 minuti a 1200 xg con accelerazione e decelerazione 1 0. </li><li> Dopo la centrifugazione, raccogliere lo strato di interfaccia (globuli bianchi) in un nuovo 50 ml provetta da centrifuga e lavare le cellule due volte in PBS (3 min a 1.080 xg). Gettare il surnatante ogni volta. </li><li> Trattare le cellule con ammonio-cloruro di potassio-lisi (ACK) tampone (per la lisi dei globuli rossi). Aggiungere 10 ml di tampone e incubate per 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS, centrifugare per 3 min a 1.080 xg ed eliminare il surnatante ogni volta. </li><li> Salvare il pellet, che conterrà i PBMC. </li><li> Procedere con metodo di purificazione dei monociti di scelta. </li></ol> 2. Purificazione monociti secondo il metodo Aderenza <ol><li> Preparare completa mezzo di coltura cellulare contenente L-glutammina (300 mg / ml) ed addizionato con penicillina (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) e 10% siero fetale bovino. </li><li> Lasciare PBMC di aderire per circa 2 ore dalla loro coltura in una beuta T75 ad una concentrazione di 5 x 10 7 cellule per 10 ml di mezzo completo a 37 ° C e 5% CO 2 in un incubatore umidificato. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, rimuovere le cellule galleggianti non aderenti dal pallone di coltura e lavare delicatamente cellule aderenti due volte con PBS. </li><li> Incubare cellule aderenti in mezzo completo di coltura cellulare integrato con 2 microlitri / ml di granulociti-MACR umanaophage fattore stimolante le colonie (GM-CSF) e l&#39;interleuchina 4 (IL-4) conservato a uno stock concentrazione di 10 mg / ml. </li><li> Modificare la metà del mezzo e ricostituire le citochine ogni 48 ore. </li><li> Lasciare 5 - 7 giorni per la differenziazione dei monociti in MDDCs. </li></ol> 3. monociti Purificazione mediante metodo di separazione magnetica <ol><li> Raccogliere PBMC di tecnica gradiente di densità standard, versare in una provetta di polistirene da 5 ml e risospendere in tampone PBS ad una concentrazione di cellule / ml. </li><li> Aggiungere cocktail monociti arricchimento umano per mezzo di 50 ml / ml cellule, mescolare bene e incubare a 4 ° C per 10 min. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere particelle magnetiche che utilizzano 50 ml / ml cellule, mescolare bene e incubare a 4 ° C per 5 min. </li><li> Portare sospensione cellulare fino ad un volume totale di 2,5 ml aggiungendo tampone PBS, mescolare bene pipettando su e giù 2 - 3 volte. </li><li> Posizionare il tubo di polistirene senza un tappo nel dispositivo magnetico e mettere da parte a temperatura ambiente per 2.5 minuti. </li><li> Dopo l&#39;incubazione e in un unico movimento continuo, prendere il magnete e versare la frazione dei monociti purificata desiderato in un tubo da 50 ml centrifugazione pulito. </li><li> Incubare cellule aderenti in mezzo completo di coltura cellulare integrato con 2 ml / ml di granulociti-macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF) umana e l&#39;interleuchina 4 (IL-4) conservato a uno stock concentrazione di 10 mg / ml. </li><li> Ogni 48 ore, cambia la metà del mezzo, spin down a 1.080 xg per 5 minuti e risospendere pellet con nuovi media (CRPMI) e citochine. </li><li> Lasciare 5 - 7 giorni per la differenziazione dei monociti in MDDCs. </li></ol> 4. Trypan Blue Esclusione vitalità Assay Nota: Utilizzare questa tecnica per ottenere la resa delle cellule e la vitalità di PBMC, monociti, e MDDCs. <ol><li> Celle di raccolta che utilizzano standard di tripsina-EDTA ed eseguire lavaggi dei fiaschi e il pellet cellulare in PBS. A seconda delle dimensioni del pellet, risospendere in 5 a 10 ml di PBS per dissolvere il pellet. </li><li> In un tubo micro-centrifuga, eseguire una diluizione 1: 1 di trypan reagente blu con pellet cellulare diluito. </li><li> Da questo mix, aliquote 10 ml in una cella contando scivolo e leggere i risultati utilizzando un contatore di cellule automatizzato secondo il protocollo del produttore. Se un contatore di cellule automatizzato non è disponibile, una conta cellulare simile è possibile utilizzando un emocitometro o un contatore manuale. </li></ol> 5. MTT Assay <ol><li> Cellule piastra a una concentrazione di 4 x 10 4/100 ml di completo supporto in ciascun pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Consentire 24 ore per le cellule per regolare alla cultura. </li><li> Incubare ed effettuare letture a 0 rispettivamente (giorno 0), 36 (giorno 3) e 84 ore (giorno 7). </li><li> Al termine della incubazione desiderato, rimuovere i supporti e sostituire con 100 microlitri di PBS solo. </li><li> Preparare 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio soluzione bromuro (MTT) (5 mg / ml) aggiungendo 10 ml di Dimethyl solfossido (DMSO) per 1 g di sodio dodecil solfato (SDS). </li><li> Aggiungere 10 ml (5 mg / ml) di soluzione MTT ad ogni pozzetto ed incubare a 37 ° C per 2 ore aggiuntive. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, rimuovere surnatanti che contengono PBS e la miscela di MTT non convertito (soluzione di colore giallo-colore). </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione di SDS-DMSO ad ogni pozzetto e incubare per un&#39;ora supplementare. </li><li> Leggere l&#39;assorbanza a 540 nm usando un lettore di micropiastre. </li></ol> 6. cellulari di superficie colorazione Analisi per Imaging citometria a flusso <ol><li> Dopo 7 giorni di differenziazione da monociti purificati, dispensare 1x10 6 aliquote cellulari delle cellule dendritiche derivate da monociti nel numero appropriato di provette da 1,5 ml. </li><li> Inizia la colorazione della superficie cellulare da parte delle cellule bloccando con 50 ml di calore inattivati ​​(HI) siero umano, incubare a 4 ° C per 10 min. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, le cellule centrifugare a 720 xg per 5 minuti, scartare il surnatante. </li><li> Alla cella pellet, aggiungere rispettivi anticorpi coniugati a fluorocromi (es, anti-CD11c o anti-CD14) e incubare a 4 ° C per 20 minuti al riparo dalla luce. In tubi separati, preparare singoli fluorocromi macchiato di campioni / ml) in quanto sono necessari per la compensazione. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare le cellule due volte in 1 ml di tampone PBS e centrifugare per volta a 720 xg per 5 min. </li><li> Mantenere le cellule al riparo dalla luce, ri-sospendere in tampone PBS alla concentrazione di cellule / 100 microlitri per citometria a flusso. </li><li> Al fine di cancello cellule vitali, aggiungere 1 ml di DAPI ad ogni provetta prima di acquisire le cellule sul singolo flusso di imaging cellulare citometria strumento secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 7. Analisi statistica <ol><li> Ingresso tutti i dati in un foglio di calcolo. </li><li> Confrontare i risultati con t-test dello studente e / o ANOVA a seconda dei casi. </li><li> Considerare differenze statisticamente significativo se p &lt;0.05. </li&gt; </ol>

<ol><li>Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+maturation+and+antigen+presenting+function+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Imunol%22%5BJournal%5D)">Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells.</a> Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).</li>
<li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of Dendritic Cells.</a> Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Kaouther, M., Ridha, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell-Based+Graft+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell-Based Graft Tolerance.</a> ISRN Pharmacol. , (2011).</li>
<li>Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+are+the+principal+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> J Exp Med. 157, 613-627 (1983).</li>
<li>Nair, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-directed+inhibition+of+DC-SIGN+by+dendritic+cells%3A+Prospects+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy.</a> AAPS J. 7, E572-E578 (2005).</li>
<li>Agudelo, M., et al. Chapter 10. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgudelo%2C+M+%22Dendritic+Cells%3A+Types%2C+Life+Cycles+and+Biological+Functions%22">Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions</a>. , Nova Publishers. 167-177 (2010).</li>
<li>Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+dendritic+cell-tumor+fusion+cells+on+cancer+vaccines+-+past+progress+and+future+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies.</a> Immunotherapy. , (2015).</li>
<li>Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+tissue+specific+tolerance+in+autoimmune+disease+with+tolerogenic+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells.</a> Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).</li>
<li>Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+dendritic+cell+responses+to+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy.</a> Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).</li>
<li>Zwolak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+dendritic+cells+in+alcoholic+and+autoimmune+liver+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders.</a> Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).</li>
<li>Agudelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+functional+role+of+cannabinoid+genes+in+alcohol+users%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Alcohol+Depend%22%5BJournal%5D)">Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users.</a> Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).</li>
<li>Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+Versus+Cannabinoids%3A+A+Review+of+Their+Opposite+Neuro-Immunomodulatory+Effects+and+Future+Therapeutic+Potentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alcohol+Drug+Depend%22%5BJournal%5D)">Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials.</a> J Alcohol Drug Depend. 3, 184(2015).</li>
<li>Boukli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+ER+Stress%2C+the+Unfolded+Protein+Response%2C+and+Pro-+and+Anti-Apoptotic+Protein+Fingerprints+in+Human+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+Treated+With+Alcohol%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol.</a> Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).</li>
<li>Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+Modulates+DC-SIGN+Expression+by+Mature+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).</li>
<li>Napuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+Enhances+HIV-1+Infectivity+in+Monocyte+Derived+Dendritic+Cells+by+Suppressing+microRNA-155%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155.</a> PLoS ONE. 8, e83682(2013).</li>
<li>Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+methamphetamine+on+expression+of+HIV+coreceptors+and+CC-chemokines+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells.</a> Life Sciences. 88, 987-994 (2011).</li>
<li>Nair, M. P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+Modulates+Dendritic+Cell-Specific+C+Type+Intercellular+Adhesion+Molecule-3-Grabbing+Nonintegrin+Expression+by+Dendritic+Cells+in+HIV-1+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients.</a> J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).</li>
<li>Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+methamphetamine+%28METH%29-induced+differential+protein+expression+by+immature+dendritic+cells+%28IDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC).</a> Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).</li>
<li>Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dendritic+cells.+Enrichment+and+characterization+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood.</a> J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).</li>
<li>Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mac-1+and+p150%2C95+beta+2+integrins+bind+denatured+proteins+to+mediate+leukocyte+cell-substrate+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion.</a> Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).</li>
<li>Delirezh, N., Shojaeefar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+comparison+between+flask+adherent+and+magnetic+activated+cell+sorted+monocytes+derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Iran+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells.</a> Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).</li>
<li>Lehner, M., Holter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin-Free+Purification+of+Monocytes+for+Dendritic+Cell+Generation+via+Discontinuous+Density+Gradient+Centrifugation+Based+on+Diluted+Ficoll-Paque+Plus%3Csup%3E%C2%AE%3C%2Fsup%3E%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®.</a> Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).</li>
<li>Van Brussel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+activated+cell+sorting%3A+An+effective+approach+to+study+dendritic+cell+subsets+in+human+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques.</a> J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).</li>
<li>Mucci, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methodological+approach+for+the+generation+of+humandendritic+cells+from+monocytes+affects+the+maturation+state+of+the+resultant+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells.</a> Biologicals. 37, 288-296 (2009).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYuan%2C+N+%22The+American+Association+of+Immunologists+%28AAI%29%22">The American Association of Immunologists (AAI)</a>. , AAI. Miami Beach, FL. (2007).</li>
<li>Romani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+dendritic+cell+progenitors+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Proliferating dendritic cell progenitors in human blood.</a> J Exp Med. 180, 83-93 (1994).</li>
<li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).</li>
<li>Grützkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+mighty%3A+How+the+MACS%C2%AE-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).</li>
<li>El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+magnetic+activated+cell+sorted+monocytes+and+monocyte+adherence+techniques+for+in+vitro+generation+of+immature+dendritic+cells%3A+an+Egyptian+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Cent+Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial.</a> Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).</li>
<li>Curry, C. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCurry%2C+CV+%22Differential+Blood+Count%22">Differential Blood Count</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview">http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview</a> (2015).</li>
<li>Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+presentation+of+soluble+antigen+by+cultured+human+dendritic+cells+is+maintained+by+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+plus+interleukin+4+and+downregulated+by+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).</li>
<li>Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cell+Cultures+Is+Caused+by+Progenitor+Cells+Capable+of+Myeloid+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation.</a> Blood. 92, 1598-1607 (1998).</li>
<li>Ardeshna, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+proliferate+and+are+not+susceptible+to+retroviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction.</a> Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).</li>
<li>Chapuis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+dendritic+cells+from+monocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro.</a> Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).</li>
<li>Zhou, L. J., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2B+blood+monocytes+can+differentiate+into+functionally+mature+CD83%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B70%2FB7-2+is+identical+to+CD86+and+is+the+major+functional+ligand+for+CD28+expressed+on+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells.</a> J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+dendritic+cells+through+CD40+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking.</a> J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).</li>
<li>Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Linkage+of+Innate+to+Adaptive+Immunity+via+Maturing+Dendritic+Cells+In+Vivo+Requires+CD40+Ligation+in+Addition+to+Antigen+Presentation+and+CD80%2F86+Costimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation.</a> J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).</li>
<li>Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+and+maturation+on+human+monocyte-derived+dendritic+cell+surface+markers%2C+necrosis+and+antigen+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding.</a> Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).</li>
</ol>

Tutti gli autori non rivelano interessi finanziari concorrenti.

Sulla base delle note difficoltà di isolare e generando MDDCs dal sangue umano, il presente studio ha lo scopo di fornire un confronto completo dei due metodi consolidati per la generazione di MDDCs. Il primo metodo rispetto è un metodo tradizionale consolidata per generare MDDCs sfruttando la capacità dei monociti di aderire al vetro o plastica (metodo aderenza) 21,22,27. Il metodo aderenza è veloce ed economica, e non richiede l&#39;uso di attrezzature complesse. Tuttavia, alcuni svantaggi di questo process...

Le cellule dendritiche (DC) sono mediatori essenziali del sistema immunitario innato e adattativo. La loro funzione di indurre risposte immunitarie primari e facilitare lo sviluppo della memoria immunologica. Queste cellule sono i principali responsabili per la cattura l&#39;antigene, la migrazione e la stimolazione delle cellule T e sono quindi indicati per le cellule presentanti l&#39;antigene come professionali (APC) 1 .Manipulation delle DC potrebbe essere utilizzato in una vasta gamma di settori di ricerca e in ambito clinico per il trattamento di diverse malattie infiammatorie come l&#39;HIV 6,7, il cancro, le malattie autoimmuni 8 9, e le risposte allergiche 10. DC sono anche utilizzati per la ricerca abuso di sostanze al fine di risolvere i meccanismi sconosciuti e percorsi, come quelli associati con la dipendenza da alcol 11-14, tossicodipendenza 13,15, e la combinazione di infezione da HIV e abuso di sostanze 16-19. Questi studi in corso e studi di ricerca future In campo dell&#39;immunologia fare in vitro generazione delle DC estremamente importante per la ricerca. Tuttavia, vi sono diverse difficoltà legate isolare cellule dendritiche dal sangue umano come costituiscono solo lo 0,1 - 1% delle cellule totali mononucleari del sangue 20. Ad oggi, alcune delle tecniche comunemente per la generazione di cellule dendritiche in vitro costituito da plastica o vetro aderenza dei monociti 21,22, densità centrifugazione in gradiente 23, specifica separazione basato marcatore come cellula magnetica attivato smistamento 22, fluorescente cellule attivate classificare 24, selezione positiva dei monociti CD14 + utilizzando nanoparticelle magnetiche rivestite destrano 25, e un rapido isolamento dei monociti altamente purificati mediante selezione cellulare negativa completamente automatizzato 26. Tuttavia, il miglior metodo di scelta rimane controverso. Pertanto, per migliorare le tecniche di generazione di DC, vari metodi sono stati sviluppati in cuila purezza di queste cellule può essere notevolmente aumentata di differenziazione da cellule CD34 + progenitrici purificati e monociti isolati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) 27. Come accennato prima, un metodo ampiamente utilizzato e popolare per la generazione di monociti derivati da cellule dendritiche (MDDCs) è quello di esplorare la capacità dei monociti di aderire al vetro o plastica (metodo di aderenza) 21,22,27. Il metodo aderenza è un metodo rapido e semplice che non richiede l&#39;uso di attrezzature complesse. Tuttavia, alcuni svantaggi di questo processo includono contaminazione linfociti, scarsa flessibilità, e monociti manipolazione transitoria 28. Un metodo alternativo al metodo aderenza è l&#39;isolamento magnetico di monociti da PBMC totali, in particolare con l&#39;uso di un kit monociti arricchimento umano, che è progettato per isolare monociti da PBMC da selezione negativa 26. Durante questa procedura, le cellule indesiderate sono mirati per la rimozione con tetramericcomplessi di anticorpi e particelle magnetiche rivestite destrano. Il vantaggio di questo metodo di isolamento è che le cellule marcate indesiderate vengono separati usando un magnete mentre le cellule bersaglio possono essere liberamente versato fuori in un nuovo tubo senza bisogno di colonne. Ad oggi, con la disponibilità di specifici anticorpi monoclonali che possono etichettare popolazioni cellulari unici, la tecnica di separazione magnetica è diventata non semplicemente un ulteriore metodo, ma una necessità per l&#39;isolamento di cellule rare nel campo della immunologia. Per esempio, tecniche come la cellula magnetica ordinamento con disponibili in commercio paramagnetiche MACS-nanoparticelle hanno facilitato lo sviluppo di nuovi approcci per la ricerca e applicazioni cliniche 22,29. Inoltre, studi recenti ricerche che confrontano generazione DC dai metodi monociti aderenza e la tecnologia MACS hanno dimostrato una maggiore purezza DC e la vitalità usando MACS monociti 22,30 separati. I regali studioun confronto tra due metodi per la generazione di cellule dendritiche umane da monociti isolati da PBMC: 1) isolamento monociti da aderenza e 2) isolamento dei monociti di selezione negativa utilizzando un kit commerciale monociti arricchimento umano. Questo studio fornisce la prova per dimostrare che la procedura di selezione separazione magnetica negativa per isolare monociti genera il più alto rendimento dei monociti senza differenze significative nei monociti vitalità se confrontato con monociti isolati con il metodo di aderenza. A sua volta, dopo sette giorni, i monociti isolati da separazione magnetica differenziate in MDDCs con significativamente più alta capacità proliferativa e una maggiore quantità di cellule che esprimono doppio positivo (+ CD11c / CD14 +) fenotipo senza influenzare MDDC vitalità. Nel complesso, questo studio si differenzia dai precedenti studi citati sopra in quanto dimostra la capacità di entrambe le tecniche per generare simultaneamente monociti che sono in grado di proliferare e differenziarsi in CD11c +MDDCs (&gt; 70%) dopo sette giorni di coltura senza compromettere la loro vitalità. Inoltre, l&#39;attuale approccio fornisce per la prima volta la caratterizzazione di differenti CD11c / CD14 popolazioni MDDCs dal flusso di imaging citometria. In sintesi, poiché DC giocano un ruolo centrale riguardante la ricerca nel campo della immunologia, diversi parametri devono essere presi in considerazione quando si considera come sono derivate e quali metodi sono utilizzati per isolare e cultura li in vitro. Pertanto, questo studio mira a fornire approfondimenti su due diversi metodi di isolamento dei monociti e di come questi metodi influenzano in modo differenziale monociti vitalità e la resa alla fine colpisce la vitalità delle cellule dendritiche, la proliferazione, e fenotipo. Questi risultati contribuiranno notevolmente al campo della immunologia e forniranno un protocollo dettagliato di DC isolamento, purificazione e caratterizzazione.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>Deve essere utilizzato presso RT</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ACK Tampone di lisi</td><td>Qualità Biologico</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>tampone RoboSep</td><td>StemCell</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit per l'arricchimento di monociti umani</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contatore di cellule automatizzato</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0101</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Colorazione blu di tripano (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 lettore multimodale</td><td>Biotek</td><td>7131000</td><td></td></tr><tr><td>XTT Bioreagente sale di sodio (XTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X4626-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Bioreagente dimetilsolfossido (DMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tiazoil-blu tetrazolio bromuro (MTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>m5655-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Dodecil Solfato (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Fenazina Metosolfato (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9626-1G</td><td></td></tr><tr><td>Siero Umano Inattivato (HI)</td><td>Chemicon</td><td>S1-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso Accuri C6 BD</td><td>Accuri</td><td>653119</td><td></td></tr><tr><td>FlowSight Amnis Citometro a flusso</td><td>EMD Millipore</td><td>100300</td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di citometria a flusso imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Le cellule dendritiche (DC) sono cellule presentanti l'antigene del sistema immunitario che svolgono un ruolo cruciale nelle risposte dei linfociti, nei meccanismi di difesa dell'ospite e nella patogenesi dell'infiammazione. L'isolamento e lo studio delle DC sono stati importanti nella ricerca biologica a causa delle loro caratteristiche distintive. Sebbene siano mediatori chiave essenziali del sistema immunitario, le DC sono molto rare nel sangue, rappresentando circa lo 0,1-1% delle cellule mononucleate totali del sangue. Pertanto, le alternative per i metodi di isolamento si basano sulla differenziazione delle DC dai monociti isolati dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). L'utilizzo di tecniche di isolamento adeguate che combinano semplicità, convenienza, elevata purezza e alta resa delle celle è imperativo da considerare. Nel presente studio, verranno confrontati due metodi distinti per la generazione di DC. I monociti sono stati selezionati per aderenza o arricchiti negativamente utilizzando la procedura di separazione magnetica seguita dal differenziamento in DC con IL-4 e GM-CSF. La vitalità, la proliferazione e il fenotipo dei monociti e dell'MDDC sono stati valutati utilizzando coloranti di vitalità, saggio MTT e analisi dei marcatori di superficie CD11c/CD14 mediante citometria a flusso di imaging. Sebbene il metodo di separazione magnetica abbia prodotto una percentuale significativamente più alta di monociti con una maggiore capacità proliferativa rispetto al metodo di adesione, i risultati hanno dimostrato la capacità di entrambe le tecniche di generare contemporaneamente monociti in grado di proliferare e differenziarsi in MDDC CD11c+ vitali dopo sette giorni di coltura. Entrambi i metodi hanno prodotto > 70% di MDDC CD11c+. Pertanto, i nostri risultati forniscono intuizioni che contribuiscono allo sviluppo di metodi affidabili per l'isolamento e la caratterizzazione delle DC umane.

<html> Monociti Resa dalla separazione magnetica è superiore rispetto a monociti Resa secondo il metodo Aderenza I dati presentati in Figura 1 mostra PBMC e conta delle cellule monociti dal metodo di esclusione del trypan blue alla data di isolamento delle PBMC e separazione dei monociti. In media, monociti isolati con il metodo aderenza rappresentato circa il 6,2 per cento di PBMC totali, ment...

Questo studio confronta due diversi metodi di isolamento dei monociti umani per ottenere cellule dendritiche (DC) in vitro. I monociti vengono selezionati per adesione o arricchiti negativamente per separazione magnetica. La resa e la vitalità dei monociti, insieme alla vitalità dell'MDDC, alla proliferazione e all'espressione del marcatore di superficie CD11c/CD14 saranno confrontate tra i due metodi.

Caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di Citometria a Flusso Imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

L'obiettivo generale di questo studio è confrontare due diversi metodi di isolamento di monociti umani per la generazione in vitro di cellule dendritiche e caratterizzare l'espressione sulla superficie cellulare di CT11c e CT14 delle popolazioni derivate dai monociti mediante citometria a flusso con imaging. Questi protocolli di isolamento dei monociti possono contribuire allo sviluppo di metodi affidabili per la purificazione di cellule dendritiche umane per applicazioni di ricerca e cliniche. Il principale vantaggio di questi protocolli è che facilitano l'isolamento di monociti umani e la loro differenziazione in cellule derivate dai monociti vitali e funzionali.Inoltre, questo è il primo studio che caratterizza la popolazione specifica di cellule dendritiche derivate dai monociti mediante citometria a flusso con imaging a singola cellula. Questo metodo può essere applicato anche come alternativa per l'isolamento di altre cellule rare con un rendimento adeguato per applicazioni di ricerca successive. La dimostrazione visiva di questi metodi è fondamentale, poiché può risultare difficile manipolare i campioni di sangue in modo sicuro senza un'adeguata istruzione ed esperienza.Iniz

characterization-human-monocyte-derived-dendritic-cells-imaging-flow

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Qui, dettaglio una metodologia per l'isolamento rapido delle cellule dendritiche di topo intestinali (DCS) e macrofagi. Caratterizzazione fenotipica di DC intestinali e macrofagi viene eseguita utilizzando multi-color analisi citometrica mentre magnetica arricchimento tallone seguita dalla selezione cellulare viene utilizzato per produrre le popolazioni di elevata purezza per gli studi funzionali.

Isolamento e caratterizzazione di cellule dendritiche ei macrofagi dall&#39;intestino mouse

Presentiamo un protocollo semplice ed efficiente per la generazione di macrofagi umani. Buffy coats sono trattati con doppia centrifugazione in gradiente di densità e monociti isolati sono poi differenziate a macrofagi in sacchi di coltura cellulare teflonato. Questo massimizza i rendimenti macrofagi e facilita la raccolta di cellule per esperimenti successivi.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Qui, dimostriamo come i monociti vengono isolati mediante separazione di biglie magnetiche dalle cellule mononucleate del sangue periferico dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue umano anticoagulato. Dopo un'incubazione di 5 giorni, i monociti umani vengono differenziati in cellule dendritiche immature e sono pronti per le procedure sperimentali in un contesto non clinico.

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Questo protocollo fornisce un'analisi delle subpopulazioni del macrofage nel sistema nervoso centrale del mouse adulto mediante citometria a flusso ed è utile per lo studio di marcatori multipli espressi da queste cellule.

Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

Descriviamo qui un metodo per isolare e purificare le cellule dendritiche da diversi compartimenti anatomici nel tratto riproduttivo femminile umano per la valutazione delle loro caratteristiche fenotipiche e funzionali. Questo metodo può essere adattato per isolare altre cellule immuni o cellule dendritiche da altri tessuti mucosi.

Isolamento di cellule dendritiche dal tratto riproduttivo femminile umano per studi fenotipici e funzionali

Qui presentiamo un protocollo per la caratterizzazione di sottoinsiemi del monocito mediante citometria di flusso di sangue intero. Ciò include che delinea come cancello i sottoinsiemi e valutare la loro espressione di marcatori di superficie e dando un esempio della valutazione dell'espressione di M1 (infiammatoria) e marcatori M2 (antinfiammatorio).

Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi

Presentato qui è un protocollo ottimizzato per isolare, coltivare, tradurre e differenziare i monociti primari umani da individui infettati dall'HIV e dai controlli sani.

Isolamento, trasfezione e cultura dei monociti umani primari

Qui, presentiamo un metodo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo ad alta purezza dai topi dopo 7 giorni di coltura con 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

Viene presentato un protocollo unico e completo per generare cellule dendritiche (mo-DC) derivate da monociti umani desialilati da cellule mononucleate isolate del sangue periferico (PBMC) utilizzando un trattamento con sialidasi. Inoltre, vengono descritti metodi per valutare la caratterizzazione fenotipica e funzionale delle mo-DC e valutare come il trattamento con sialidasi migliora il livello di maturazione delle mo-DC.

Generazione di cellule dendritiche derivate da monociti con diversi fenotipi sialilati

I monociti e i macrofagi sono cellule immunitarie molto plastiche e riprogrammabili, cruciali per la salute e la malattia. Percepiscono e rispondono a un'ampia gamma di stimoli adottando specifici programmi di differenziazione e fenotipi. Abbiamo standardizzato un modello in vitro per studiare la polarizzazione e la riprogrammazione dei macrofagi, fornendo uno strumento prezioso per la ricerca.

Riprogrammazione del modello di macrofagi derivati da monociti umani per saggi in vitro

Descriviamo una procedura per valutare la capacità degli agenti farmacologici di generare cellule dendritiche tollerogeniche da cellule dendritiche naive derivate da monociti in vitro e convalidare la loro potenza mediante la generazione di cellule T regolatorie autologhe.

Un metodo semplice ed efficiente per testare gli agenti immunomodulatori per la generazione di cellule dendritiche tollerogeniche da monociti CD14+ umani

Scopri due metodi di isolamento dei monociti umani per generare cellule dendritiche in vitro e caratterizza l'espressione dei marcatori di superficie CD11c e CD14 mediante citometria a flusso imaging.

Caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di Citometria a Flusso Imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti (Video) | JoVE Journal

Caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di Citometria a Flusso Imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti

Esplora altri video