Name: Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Impara a caratterizzare i sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero mediante citometria a flusso. Questo protocollo standardizzato consente di analizzare marcatori M1 e M2 con istruzioni chiare per il gating.

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Citometria a flusso è stata eseguita nel flusso Cytometry Core Facility è supportato dal Westmead Institute for Medical Research, Westmead Research Hub, Cancer Institute New South Wales e National Health and Medical Research Council. Questo studio è stato sostenuto dal fondo formazione e di ricerca di chimica clinica.

Questo studio è stato approvato dal comitato di etica della ricerca umana WSLHD (HREC) (approvazione AU rosso HREC/15/WMEAD/289).
1. preparazione del campione per citometria a flusso di sangue intero
Nota: Come il sangue umano è potenzialmente infettivo, la messa a punto del campione deve essere eseguita in una cappa biohazard.
<ol><li>Raccogliere i campioni di sangue da parte dei partecipanti in provette da 3 mL etilene diammina tetra acido acetico (EDTA).</li>
	<li>Determinare il numero di globuli bianchi (WBC) utilizzando un analizzatore ematologico o un emocitometro.</li>
	<li>Diluire con tamponato fosfato salino (PBS) (pH ~ 7.4) per regolare la concentrazione di ~ 5 x 106 WBC/mL.</li>
	<li>Preparare il mix master sufficienti per il numero di provette (ad es., per 14 tubi, preparare mix master: 16x) combinando 16x volumi di 50 µ l di sangue, 0,75 µ l anti-CD14-V450, 0,5 µ l anti CD16-APC e 0,625 µ l anti HLA-DR-PerCP. Vortice e pipetta 51,9 µ l di mix in ciascuna provetta (tabella 1). Nota: Gli anticorpi dovrebbero essere titolati per determinare le concentrazioni di colorazione ottimale per gli anticorpi fluorescenti utilizzate.</li>
	<li>Aggiungi marcatore di superficie (M1 e M2 o isotipo controllo, ficoeritrina (PE) etichettato) anticorpi (esempio come da tabella 2) e PE etichettati marcatori per cellule di T (CD3), cellule di B (CD19), neutrofili (CD66b), e cellule natural killer (NK) (CD56) (tabella 3). Vortex e incubare per 30 min, 4 ° C al buio. Nota: I marcatori per i linfociti, i neutrofili e le cellule NK sono inclusi solo per la validazione del metodo gating.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l di soluzione fissaggio di combinato del globulo rosso Lisi/WBC, delicatamente immediatamente, vortex e incubare per 10 minuti al buio a 4 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l di PBS e spin cellule giù a 260 x g per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante, risospendere le cellule a 300 µ l di 1% di formaldeide. Nota: La formaldeide è tossica. Utilizzare guanti in nitrile e in cappa.</li>
	<li>Conservare a 4 ° C al riparo dalla luce fino a quando l'analisi viene eseguita. Nota: L'analisi di flusso si raccomanda di essere fatto entro 48 h dalla preparazione del campione.</li>
</ol>2. flusso Cytometry
<ol><li>Verifica registro citometro a flusso per garantire il personale della struttura hanno effettuato i controlli di controllo di qualità. Nota: Per garantire la coerenza tra analisi, strumento di controllo di qualità e mantenere costante intensità di fluorescenza di destinazione utilizzando microsfere di controllo sono consigliate.</li>
	<li>Per impostare l'esperimento di citometria a flusso, fare clic su "nuovo esperimento poi"esemplare"e"nuovo tubo"per aggiungere i tubi. Selezionare bivariate grafici facendo clic sull'icona e utilizzare i menu a discesa per selezionare i parametri di asse. Garantire l'inclusione di un complotto di CD16/CD14 e una trama visualizzati da un rivelatore a fianco di tempo di monitorare l'acquisizione.</li>
	<li>Inserire il tubo e fare clic su "Acquire". Controllare le impostazioni di tensione strumento garantendo che il rilevatore segnali non sono fuori scala.</li>
	<li>Osservare le cellule che cade nel cancello del monocito della trama CD14/CD16. Impostare la soglia di registrazione a 5.000 eventi per il cancello classico del monocito e cliccare su "Record".</li>
	<li>Continuare a registrare i dati per provette rimanenti. Dopo dati per tutte le provette sono stati registrati, è possibile esportare i dati di flusso come file. FCS per l'analisi. Nota: Per garantire l'accuratezza, i controlli di compensazione di singolo colore dovrebbero essere registrati. Una matrice di incremento retributivo può essere calcolato e applicato ai dati prima dell'analisi per tenere conto di fuoriuscita spettrale oltre15,16.</li>
</ol>3. monocito Gating
<ol><li>Aprire i file nel software di analisi. Fare doppio clic su nome del filmato e selezione dei parametri dai menu a discesa per visualizzare le cellule su una area di forward scatter FSC (A) / dispersione altezza FSC(H) in avanti. Creare un cancello di esclusione del doppietto facendo clic sull'icona dello strumento del cancello di poligono e che racchiude le cellule come in (Figura 1A).</li>
	<li>Selezionare le celle con cancello (facendo doppio clic sulla regione con cancello) e sul display nuova casella regolare parametri del menu a discesa per visualizzare le celle su un FSC (A) / dispersione laterale SSC(A) plot. Fare clic sull'icona cancello rettangolare e generosamente selezionare la popolazione monocito basata sulle proprietà di dispersione avanti e laterali per escludere la maggior parte dei linfociti, cellule NK e granulociti (Figura 1B).</li>
	<li>Selezionare le celle con cancello e visualizzare nuovamente su un terreno di CD14/CD16, selezionando i parametri utilizzando i menu a discesa. Fare clic sul cancello poligono per selezionare monociti basati sulla loro forma caratteristica "┐" (Figura 1).</li>
	<li>Selezionare le celle con cancello e visualizzare i monociti su un terreno di CD16/HLA-DR utilizzando i menu a discesa per selezionare i parametri. Fare clic sul cancello poligono per selezionare le cellule positive di HLA-DR ed escludere qualsiasi restanti NK le cellule ed i neutrofili17 (Figura 1).</li>
	<li>Selezionare le celle con cancello e visualizzare le cellule positive di HLA-DR su un terreno di CD14/HLA-DR utilizzando il menu a discesa per selezionare i parametri. Fare clic sul cancello di poligono e disegnare un cancello per escludere le celle di bassa alta/CD14 HLA-DR (B cellule esprimono alti livelli di HLA-DR ma non CD14) (Figura 1E). Nota: contaminazione delle cellule B può verificarsi e quindi dovrebbe essere studiata. Se la popolazione non-classica in Figura 1 non è distinta dalle cellule alla sua sinistra, poi la contaminazione è probabile. Passaggio 3.5 può essere ignorato se le cellule B non sono sovrapposte con i monociti non-classica.</li>
	<li>Selezionare le celle con cancello e utilizzare il menu a discesa per visualizzarle su un terreno di CD16/CD14. Opzioni di stampa selezionare "Trama di Zebra" che consentirà di gates sottoinsieme del monocito deve essere disegnato per determinare le proporzioni sottoinsieme (Figura 1F). Nota: se zebra trama non è disponibile il software di analisi, pseudo colore (liscio) o contorno trama potrebbe essere adatto.</li>
	<li>Fare clic sull'icona cancello rettangolare e selezionare i monociti classici disegnando un approssimativo cancello rettangolare intorno alla popolazione di alta/CD16 basso, classica monociti CD14. In "Visualizzazione" selezionare "Visualizza mediane" per visualizzare l'intensità di fluorescenza mediano per i monociti classici. Regolare il cancello in modo che la popolazione ha una distribuzione uguale dalla mediana a sinistra e a destra che comprende tutte le celle a sinistra.</li>
	<li>Selezionare la popolazione intermedia disegnando un cancello rettangolare che racchiude le celle a destra del cancello classico. Regolare la parte inferiore del cancello per escludere le cellule non-classica allineando il cancello con il fondo dei cerchi concentrici che sono completamente entro il cancello classico del monocito, che assicura che il sottoinsieme intermedio ha un'espressione di CD14 paragonabile alla principale classica popolazione coerenza con la nomenclatura attuale.</li>
	<li>Cancello il sottoinsieme non classici disegnando una scatola rettangolare verso il basso dal bordo inferiore del sottoinsieme intermedio, selezionare tutte le celle verso il basso della popolazione (Figura 1F).</li>
	<li>In "Visualizzazione" selezionare "Visualizza le frequenze cancello" per determinare la percentuale di ogni sottoinsieme del monocito.</li>
</ol>4. convalida del metodo di Gating
<ol><li>Per determinare se i tipi di cellule potenzialmente contaminanti sono efficacemente gated-out, in primo luogo identificare popolazioni differenti delle cellule con anticorpi contro le cellule di T (CD3), cellule di B (CD19), neutrofili (CD66b) e le cellule NK (CD56) (Figura 2). Nota: Qui T cellule e neutrofili non sedersi vicino la forma di "┐" dei monociti e sono gated fuori in Figura 1.</li>
	<li>Confermare che le cellule NK vengono rimossi al punto 3.4 (Figura 1), e le cellule B vengono rimossi nel passaggio 3.5 (Figura 1E) come mostrato nella Figura 3. Se le cellule NK o cellule B non sono gated-out, regolare nuovamente le porte.</li>
</ol>5. fenotipica del monocito dell'espressione dei Marker
<ol><li>Selezionare le celle da ogni sottoinsieme del monocito. Modificare i parametri di elenco a discesa per creare un istogramma per ogni sottoinsieme di monociti (Figura 1F) visualizzando ogni marcatore e sua isotipo corrispondente (Figura 4).</li>
	<li>Calcolare il grado di espressione di ogni segno (mediana o media geometrica) rispetto al controllo di isotipo rispettivi.</li>
</ol>

<ol><li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).</li>
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<li>Szaloki, G., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+in+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Compensation in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).</li>
<li>Abeles, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2C+CD16+and+HLA-DR+reliably+identifies+human+monocytes+and+their+subsets+in+the+context+of+pathologically+reduced+HLA-DR+expression+by+CD14%28hi%29+%2FCD16%28neg%29+monocytes%3A+Expansion+of+CD14%28hi%29+%2FCD16%28pos%29+and+contraction+of+CD14%28lo%29+%2FCD16%28pos%29+monocytes+in+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).</li>
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<li>Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+CD11b%2FCD18+and+CD62L+on+human+monocytes+after+cell+preparation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).</li>
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<li>Hofer, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((slan-defined+subsets+of+CD16-positive+monocytes%3A+impact+of+granulomatous+inflammation+and+M-CSF+receptor+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation.</a> Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. 29, 886(2011).</li>
<li>Thomas, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Blood+Monocyte+Subsets%3A+A+New+Gating+Strategy+Defined+Using+Cell+Surface+Markers+Identified+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Citometria a flusso di sangue intero è un approccio ideale per studiare i monociti come le cellule sono esaminate in condizioni prossime loro microambiente fisiologico fornire uno spaccato del loro ruolo nell'infezione e condizioni infiammatorie. Inoltre, l'uso di fresco (cioè, non trasformati) campioni di sangue riduce al minimo le alterazioni o trasformazioni delle cellule che possono verificarsi a causa di archiviazione o gestione18,19, come quelli che si verificano con i monociti congelare-sciolto 20. preparazione richiesta campione è raccomandato in quanto alcuni marcatori sono sovraregolati se i campioni sono conservati a temperatura ambiente prima dell'elaborazione19. Le concentrazioni ottimale di marcatori M1 e M2 sono state determinate mediante titolazione, e questo dovrebbe essere fatto per qualsiasi nuovo anticorpo limitare il legame non specifico assicurando nel contempo che il grado di spostamento è dovuto l'espressione dell'antigene e non limitato dalla mancanza di anticorpo. La rimozione dei globuli rossi e la fissazione delle cellule bianche del sangue con soluzione di Lisi è un passo importante in questo protocollo, in quanto la presenza di globuli rossi può interferire con il flusso cytometry21,22. Si noti che, mentre alcune soluzioni di lisi sono compatibili con la macchiatura no-lavaggio, popolazioni più chiare sono evidenti nelle nostre mani, quando un passaggio di lavaggio viene utilizzato.
Corretta installazione del citometro a flusso è anche critico quando si confrontano espressione degli indicatori del monocito. Si consiglia che i ricercatori mantengono l'intensità di fluorescenza di destinazione coerente di microsfere di controllo ed eseguire il controllo di qualità sullo strumento da utilizzare per fornire risultati coerenti attraverso diversi campioni eseguire in giorni diversi. Oltre a questo, isotype controlli vengono utilizzati per aiutare nell'interpretazione di qualsiasi segnale di fondo non specifici generati dall'anticorpo specifico non associazione. I monociti hanno alti livelli di recettori Fc11 e pertanto sono soggetti a legame non specifico. Della nota, il livello di legame non specifico differisce per i sottoinsiemi diversi, e quindi l'utilizzo di un controllo di isotipo diventa importante quando si confrontano il grado di espressione di marcatori tra sottoinsiemi.
Un altro criterio importante da considerare è la procedura gating impiegata. Alcuni studi suggeriscono che è fondamentale per disegnare un cancello stretto intorno il monocito popolazione in FSC(A)/SSC(A) complotto per sbarazzarsi della maggior parte delle non-monocytic CD16 cellule positive23,24,25, ma questo può portare alla perdita di alcuni monociti, cellule monocito-non possono sovrapporsi con i monociti su FSC/SSC trame26. Piuttosto, per escludere eventuali altre cellule del sangue che potrebbero contaminare i monociti, l'inclusione di un terzo marcatore del monocito oltre CD14 e CD16, è essenziale26,27. Per questo motivo, HLA-DR è usato spesso ed è ideale in quanto non è espressa da NK cellule o neutrofili17,28. Anche se i linfociti (cellule B e le cellule di T) possono esprimere HLA-DR, si differenziano dai monociti rispetto all'espressione di CD14. Mentre HLA-DR è un marcatore ideale di terzo, CD86 è stato raccomandato anche5,27,29 ma non è stato utilizzato qui come è anche un indicatore di M1 e così il suo grado di espressione su sottoinsiemi del monocito è stata valutata.
Convalida della strategia gating utilizzata è di importanza cruciale. Mentre le cellule NK sono noti a sovrapporsi con non-classici, se essi non sono gated fuori28, notiamo che le cellule B possono sovrapporsi anche con i non-classici (Figura 2B); Se questo è il caso in altri studi può dipendere la scelta del fluorocromo, configurazione dello strumento, sensibilità rivelatore o anche la condizione di malattia in esame. Qui, la sovrapposizione B cellule hanno mostrato un'alta espressione di HLA-DR e non erano gated fuori dalla selezione di cellule positive HLA-DR in Figura 1. Piuttosto, per rimuovere le cellule B abbiamo usato un ulteriore terreno di CD14 / HLA-DR, dove le cellule B separano da non-classici a causa della loro maggiore HLA-DR e bassa espressione di CD14.
Ci sono anche molti modi diversi in cui sono state tratte le porte per i monociti stessi nella letteratura; Questi includono quadranti (i sottoinsiemi sono separati da marcatori quadrante) e scatole rettangolare o trapezoidale,13 (con scatole separate disegnato per ogni sottoinsieme) che inoltre differiscono da nella loro collocazione delineazione dove uno sottoinsieme finisce e inizia un altro. Queste differenze probabilmente riflettono il fatto che i monociti esistano come un continuum delle cellule, differenziazione da classico a tronchetti, piuttosto che come chiaramente distinte popolazioni. Tuttavia, perché variazioni nelle tecniche per identificare i sottoinsiemi stessi possono portare a differenze nelle proporzioni sottoinsieme calcolato del monocito, diventa importante che il metodo gating è ragionevolmente oggettivi, piuttosto che soggettive, come questo rendere il metodo più affidabile e riproducibile. Alcuni studi utilizzano un controllo di isotipo per CD16 per determinare il confine tra il classico e intermedi sottoinsiemi30. D'altra parte, per definire la separazione tra intermedi e non-classici, è stato proposto che la linea di demarcazione può essere verticale o obliquo, con la scelta fino agli investigatori, condizione che dovrebbe essere riproducibile, ma un cancello rettangolare è stato raccomandato per facilitare i confronti tra studi13,30,31. Qui, una maggiore obiettività è stata ottenuta tracciando i dati su un terreno di zebra e l'applicazione di regole oggettive di visual, perché zebra trame forniscono una stecca di visualizzazione aggiuntive mescolando la sfumatura di colore per ogni bin uguale probabilità sopra una trama di contorno tradizionale. Il bordo destro del sottoinsieme classico è stato tale che la popolazione era distribuita uniformemente intorno la mediana della popolazione. La divisione fra i prodotti intermedi e non-classici sono stata standardizzata anche avendo la base degli intermedi allineare con il fondo dei cerchi concentrici all'interno della popolazione classica (cioè, la popolazione intermedia chiaramente esprime elevati livelli di CD14, secondo la nomenclatura standard1).
Mentre alcuni studi hanno suggerito l'uso di ulteriori indicatori, quali tipo di C-C chemokine receptor 2 (CCR2) o 6-sulfo LacNAc (SLAN) per ottenere successo enumerazione dei monociti e di rivelare il loro significato clinico32,33 , nelle nostre mani il livello di espressione di molti marcatori funzionali del monocito varia ampiamente tra gli individui14. Tale variazione può limitare l'utilità di questi indicatori per definire sottoinsiemi basati sulla loro espressione. Automatizzato di approcci computazionali sono stati utilizzati anche per visualizzare e cluster sottoinsiemi del monocito compreso visual interattiva stocastico vicino di casa incorporamento (viSNE), t-distribuito stocastico prossimo incorporamento (tSNE) o progressione di Spanning-tree Analisi di densità-normalizzato eventi (SPADE)34,35, in grado di fornire una rappresentazione visiva delle celle basate sul set di marcatori più utilizzati. Mentre questo è stato indicato per aumentare l'accuratezza della strategia di gating in classificazione sottoinsieme del monocito, è riconosciuto che un inconveniente è il numero di anticorpi (e canali corrispondenti fluoroforo) richiesto. La sua utilità dipenderà molto le domande; la complessità supplementare non può essere giustificata, ad esempio, negli studi di enumerazione.
Monociti recintati con la nostra tecnica mostrano le proporzioni in linea con la letteratura e l'espressione di marcatori di superficie di tre sottoinsiemi può essere determinata facilmente. Nel complesso, la tecnica e la metodologia spiegato qui fornisce un metodo semplice e standardizzato di enumerazione di proporzioni sottoinsieme del monocito e valutare espressione dei marker di superficie, che può essere estesa per includere altri marcatori pure, quindi convalida il loro ruolo funzionale in varie condizioni.

I monociti sono un tipo di globuli bianchi che svolgono un ruolo importante nella promozione e risoluzione di infiammazione. Ci sono tre principali sottoinsiemi di monociti riconosciuti, classici (~ 85%), intermedio (~ 5%) e non-classica monociti (~ 10%), che sono caratterizzati dal loro livello di cluster di differenziazione (CD) 14 e CD16 espressione1. Le proporzioni dei sottoinsiemi del monocito possono variare con la presenza della malattia, come una proporzione aumentata di intermedi in vari stati infiammatori2,3 tra cui malattie cardiovascolari, dove si trova il livello di sostanze intermedie associato a eventi clinici4,5. Inoltre, in condizioni di malattia, monociti possono anche subire cambiamenti funzionali, con molti cambiamenti rilevabili da una differenza di superficie dell'indicatore espressione6,7. Un esempio è monocito M1-inclinazione, un aumento in marcatori associati con i macrofagi M1, che è stato osservato nella malattia cardiovascolare, diabete, obesità e sindrome metabolica7,8,9 , 10.
Nonostante la popolarità di citometria a flusso per valutare la funzione e la proporzione di sottoinsieme del monocito, c'è una considerevole variabilità nella preparazione del campione e sottoinsieme gating tra gli studi che lo rende difficile confrontare i risultati tra tali studi. Cosa importante, non ci è consenso nella delimitazione dei sottoinsiemi del monocito, ancora un approccio standardizzato è essenziale dato il significato clinico dei cambiamenti nelle proporzioni di sottoinsieme in parecchie malattie. Parte della difficoltà di gating deriva dal fatto che i monociti differenziano dal classico attraverso l'intermedio al sottoinsieme non classici11 e come tale, monociti esistano come uno spettro continuo, piuttosto che popolazioni distinte12 . Interessante, Zawada et al hanno mostrato che utilizzando entrambi un rettangolare o trapezoidale gating del sottoinsieme intermedio, sia portato in un sottoinsieme di intermedio superiore che ha predetto un endpoint cardiovascolari13. Questo mette in evidenza che, almeno per calcolare le proporzioni, la questione chiave è l'applicazione di una coerenza strategia di gating tra diversi campioni (e studi), piuttosto che tentare di definitivamente discriminare tra sottoinsiemi. Mentre gating definitivo può essere più importante quando la valutazione della funzione, la variazione dell'espressione dei marker tra sottoinsiemi è incrementale12,14, e così ancora una volta, coerenza nel gating è forse chiave. Come tale, è necessario un obiettivo gating metodo che riproducibile distribuendole i sottoinsiemi del monocito tra diversi campioni. Lo scopo del metodo presentato qui è quello cancello sottoinsiemi del monocito con una chiara spiegazione e giustificazione per la tecnica di gating impiegato e valutare i sottoinsiemi dell'espressione dei marker di superficie, fornendo così un metodo che permette ai ricercatori di avere fiducia nell'uso di questa tecnica nella valutazione di campioni diversi.

<table><tbody><tr><td>Set per la raccolta del sangue BD vacutainer</td><td>Becton Dickinson</td><td>367286</td><td></td></tr><tr><td>BD vacuitainer K2E 5,5 mg più provette per la raccolta del sangue -3,0 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>7128959</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfatato (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Provetta FACS in polistirene da 5 ml (12 mm x 75 mm)</td><td>Tecnologie</td><td>in vitro 352054</td><td></td></tr><tr><td>V450 Anticorpo CD14 anti-umano di topo [M&phi; P9]</td><td>BD Biosciences</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-CD16 di topo APC [3G8]</td><td>Abcam Australia</td><td>ab140477</td><td></td></tr><tr><td>Per CP Anticorpo HLA-DR umano [L243]</td><td>BioLegend</td><td>307628</td><td></td></tr><tr><td>PE IgG1 di topo &kappa; Controllo isotipo [MOPC-21]</td><td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>Lotto # 4283901</td></tr><tr><td>PE Topo Anticorpo CD163 Anti-Umano [GHI/61]</td><td>BD Biosciences</td><td>556018</td><td>Lotto # 2335626</td></tr><tr><td>PE Topo Anticorpo CD64 Anti-Umano [10.1]</td><td>BD Biosciences</td><td>558592</td><td>Lotto # 36768</td></tr><tr><td>PE Topo Anti-Umano CD86 Anticorpo [2331 (FUN-1)]</td><td>BD Biosciences</td><td>555658</td><td>Lotto # 3109766</td></tr><tr><td>PE Topo Anticorpo CD11b/Mac-1 [ ICRF44]</td><td>BD Biosciences</td><td>561001</td><td>Lotto # 3228959</td></tr><tr><td>PE Topo IgG2A Controllo dell'isotipo [20102]</td><td>R& D Systems</td><td>IC003P</td><td>Lotto # 1212031</td></tr><tr><td>PE umano TNF RII/TNFRSF1B Anticorpo [22235]</td><td>R& D Systems</td><td>FAB226P</td><td>Lotto # 612051</td></tr><tr><td>PE Mouse IgG1, &kappa; Controllo dell'isotipo [MOPC-21]</td><td>BioLegend</td><td>400112</td><td>Lotto # B220359</td></tr><tr><td>PE Anticorpo CD93 anti-umano [VIMD2]</td><td>BioLegend</td><td>336107</td><td>Lotto # B143544</td></tr><tr><td>PE Topo Anticorpo CD3 Anti-Umano [SK7]</td><td>BD Biosciences</td><td>347347</td><td>Lotto # 3010929</td></tr><tr><td>PE Topo Anticorpo CD19 Anti-Umano [HIB19]</td><td>BD Biosciences</td><td>561741</td><td>Lotto # 2307721</td></tr><tr><td>PE Topo Anticorpo CD56 Anti-Umano [B159]</td><td>BD Biosciences</td><td>561903</td><td>Lotto # 3011796</td></tr><tr><td>PE Anticorpo CD66b [G10F5]</td><td>BioLegend</td><td></td><td>305105 Lotto # B154037</td></tr><tr><td>OptiLyse C</td><td>Beckman Coulter</td><td>A11895</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide 37%</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Citometro a flusso</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore automatico di ematologia, XT-1800i</td><td>Sysmex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga GS-6R</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo software v10.0.7</td><td>Tree Star Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso cytometry analisi

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

I monociti sono contributori chiave in vari disordini infiammatori e alterazioni di queste cellule, tra cui loro sottoinsieme proporzioni e funzioni, possono avere significato patologico. Un metodo ideale per l'esame di alterazioni di monociti è cytometry di flusso di sangue intero, come la manipolazione minima dei campioni da questo metodo limita l'attivazione delle cellule artifactual. Tuttavia, molti approcci diversi sono prese per i sottoinsiemi del monocito portando a incoerente identificazione dei sottoinsiemi tra gli studi del cancello. Qui dimostriamo un metodo utilizzando sangue intero flusso cytometry per identificare e caratterizzare i sottoinsiemi di monociti umani (classiche, intermedi e non classica). Abbiamo illustrato come preparare i campioni di sangue per citometria a flusso, cancello i sottoinsiemi (verificare di aver rimosso cellule contaminanti) e determinare monocito sottoinsieme espressione di marcatori di superficie — in questo esempio M1 e M2 marcatori. Questo protocollo può essere esteso ad altri studi che richiedono un metodo di controllo standard per la valutazione del monocito sottoinsieme proporzioni ed espressione di sottoinsieme del monocito di altri marcatori funzionali.

La strategia di gating del monocito e analisi di citometria a flusso usato qui (Figura 1) con successo recintato i sottoinsiemi del monocito e rivelato loro proporzioni relative. Le proporzioni (per questo esempio) sono state calcolate come 88,1% classici, 4,33% intermedi e 7.49% non-classici. Questi cancelli sottoinsieme non sono stati contaminati con le cellule B, cellule T, neutrofili o cellule NK, che è stata confermata con marcatori CD19, CD3, CD56 e CD66b, rispettivamente. Valutando la posizione relativa delle altre popolazioni, è chiaro che le cellule T ed i neutrofili non rientrano bene la forma del monocito "┐" su un terreno di CD16/CD14 (Figura 2A e 2D). Tuttavia, sia le cellule NK e popolazioni di cellule B sovrappongono con la popolazione non-classica del monocito (Figura 2B e 2C). I passaggi della strategia gating (Figura 1 e 1E) sono stati confermati per escludere le cellule NK (Figura 3A) e cellule di B (Figura 3B). Anche se la popolazione delle cellule B inclusa una piccola porzione dei monociti non-classica, la quantità era trascurabile.
Avendo gated i sottoinsiemi, il grado a cui essi espressi diversi marcatori di superficie, M1 (CD64, CD86 e CD120b) e M2 (CD163, CD11b e CD93) è stata valutata. I marcatori ha mostrato espressione positiva rispetto ai corrispondenti controlli isotipo, come visto tramite lo spostamento degli istogrammi (Figura 4). La mediana dei marcatori è stato superiore a quello dei controlli isotype.
Applicazione di questa strategia di gating per un campione di sangue, che era suddivisa in quattro tubi, macchiato e analizzato separatamente, rendimenti risultati comparabili tra i tubi (tabella 4).
<img alt="grafici a dispersione per citometria a flusso; classificazione delle cellule immunitarie; diagramma; marcatori CD; Analisi delle sottopopolazioni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: rappresentanza monocito gating strategia nel sangue umano intero. (A) FSC(A) vs FSC(H) trama: le cellule che hanno un uguale area ed altezza di Gating, eliminando in tal modo ciuffi (FSC(A) maggiore rispetto al FSC(H)) e detriti (bassissima FSC) K = 1000. (B) FSC(A) vs SSC(A) trama: ampia selezione dei monociti in base alle loro proprietà SSC/FSC. (C) CD16 vs CD14 trama: Gating per selezionare monociti basato sulla loro forma caratteristica "┐". (D) CD16 vs HLA-DR trama: Gating di selezionare cellule positive HLA-DR e rimuovere le cellule NK. (E) CD14 vs HLA-DR: Gating di escludere le cellule di B (HLA-DR alta/CD14 basso) da monociti. (F) selezionato monociti rivisualizzati il CD16 vs CD14 trama a cancello i sottoinsiemi del monocito. Per A-F colore rappresenta la densità delle cellule con blu e verde che indica bassa densità, rosso e arancione che indica ad alta densità e arancione che indica la densità di mid-range. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Diagrammi di citometria a flusso del differenziamento delle cellule immunitarie: cellule T, B, NK, neutrofili; Marcatori CD." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: convalida di gating strategia di identificazione di potenzialmente contaminanti cellule. Le cellule potenzialmente contaminanti sono identificate da marcatori cellule (A) T (CD3), linfociti (B), B (CD19), cellule NK (C) (CD56) e neutrofili (D) (CD66b). I pannelli di sinistra Visualizza identificazione di ogni popolazione dopo gating come da Figura 1A e 1B, con colore che rappresenta la densità delle cellule dall'alto (rosso) a bassa (blu). I pannelli di destra mostrano ogni popolazione cellulare (blu) sovrapposta la trama di CD16/CD14 monocito finale per rivelare la vicinanza di queste popolazioni di monociti (rossi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Analisi di citometria a flusso; grafici di dispersione di monociti, NK e cellule B mediante marcatori CD, distribuzione dei dati." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: conferma che gating passaggi rimuovere contaminanti cellule. Calore mappe che mostrano il grado di espressione da alta (rosso) a bassa (blu) di CD56 (A) e (B) CD19. Gating passaggi escludono con successo cellule con alta CD56 (cellule NK) e alta CD19 (linfociti B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Grafici di citometria a flusso; marcatori M1, M2; Fenotipi dei macrofagi: classico, intermedio, non classico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: espressione del monocito di M1 (CD120b) e M2 (CD93) marcatori. Levigata istogrammi del monocito M1 e M2 (blu) mostrando il netto spostamento dall'isotipo (rosso) per (A) classici, prodotti intermedi (B) e (C) non-classici dell'espressione dei marker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anticorpo</td>
			<td>Volume (50 µ l di sangue)</td>
			<td>Volume (16x) 800 µ l di sangue</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14 - V450</td>
			<td>Μ l 0.75</td>
			<td>12 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD16 - APC</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
			<td>8 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR-PerCP</td>
			<td>0,625 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Anticorpi per il flusso di sangue intero e mix master.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tubo</td>
			<td>Anticorpi PE</td>
			<td>Codice</td>
			<td>Isotype Match</td>
			<td>Concentrazione d'archivio</td>
			<td>Volume di lavoro</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1,0 µ g/20 µ l</td>
			<td>0,625 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>CD163</td>
			<td>BD (556018)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>0.125 µ g/20 µ l</td>
			<td>5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>CD64</td>
			<td>BD (558592)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>0.06 µ g/20 µ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1,0 µ g/20 µ l</td>
			<td>1.25 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>CD86</td>
			<td>BD (555658)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>1,0 µ g/20 µ l</td>
			<td>1.25 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD (561001)</td>
			<td>BD IgG1</td>
			<td>1,0 µ g/20 µ l</td>
			<td>1.25 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>R &amp; S (IC003P)</td>
			<td>NA</td>
			<td>25 µ g/mL</td>
			<td>5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>CD120b (TNFRII)</td>
			<td>R &amp; S (FAB226P)</td>
			<td>R &amp; D IgG2a</td>
			<td>25 µ g/mL</td>
			<td>5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BL (400112)</td>
			<td>NA</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
			<td>2,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>CD93</td>
			<td>BL (336108)</td>
			<td>IgG1 BL</td>
			<td>50 µ g/mL</td>
			<td>1.25 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: M1/M2-PE fluorocromo etichettato anticorpi monoclonali per il flusso di sangue intero.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tubo</td>
			<td>Anticorpo</td>
			<td>Volume di lavoro</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>CD3</td>
			<td>5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>CD19</td>
			<td>5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>CD66b</td>
			<td>1.25 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>CD56</td>
			<td>5 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: PE fluorocromo etichettato anticorpi monoclonali per i linfociti (cellule T, cellule B), i neutrofili e le cellule NK.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tubo</td>
			<td>% Classica</td>
			<td>% Intermedio</td>
			<td>% Non-classical</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>84,3</td>
			<td>5.11</td>
			<td>10.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>84,2</td>
			<td>5.05</td>
			<td>10.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>84,3</td>
			<td>5.03</td>
			<td>10.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>81,6</td>
			<td>5.03</td>
			<td>12.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4: Le proporzioni sottoinsieme del monocito da campione di un sangue macchiato e analizzato separatamente.

Qui presentiamo un protocollo per la caratterizzazione di sottoinsiemi del monocito mediante citometria di flusso di sangue intero. Ciò include che delinea come cancello i sottoinsiemi e valutare la loro espressione di marcatori di superficie e dando un esempio della valutazione dell'espressione di M1 (infiammatoria) e marcatori M2 (antinfiammatorio).

Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia. Ad esempio, determinare come le proporzioni del sottoinsieme di monociti, o l'espressione di marcatori diversi, vengono alterate negli stati di malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica, è che le cellule sono vicine al loro stato nativo, e che vengono utilizzate istruzioni chiare e giustificazione, per fornire un metodo di gating standardizzato.Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo possono avere difficoltà, perché molti documenti non danno istruzioni chiare su come è stata eseguita la gating delle cellule. Inizia questo protocollo con la raccolta di campioni di sangue e la determinazione del conteggio dei globuli bianchi, come descritto nel protocollo di testo. Diluire il sangue con soluzione salina tamponata da fosfati, per regolare la concentrazione a circa 5 milioni di globuli bianchi per millilitro.Preparare un mix master sufficiente per il numero di tubi combinando sangue, anti CD14-V450, anti CD16-APC e anti HLA-DR-PerCP. Vortice e pipetta 51,9 microlitri di miscela in ciascun tubo. Aggiungere anticorpi marcatori M1 e M2 etichettati PE, nonché marcatori per cellule T, cellule B, neutrofili e cellule killer naturali ai loro tubi corrispondenti.Vortice e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Ora, aggiungere 250 microlitri dilisi combinata dei globuli rossi e soluzione di fissaggio dei globuli bianchi e vortice immediatamente la miscela, delicatamente. Incubare la miscela vorticiosa per 10 minuti al buio, a quattro gradi Celsius.Dopo 10 minuti, aggiungere 250 microlitri di PBS e far girare le celle a 260 g, per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in 300 microlitri di formaldeide all'1%. Conservare le celle a quattro gradi celsius, protette dalla luce fino a quando non viene eseguita l'analisi.La citometria del flusso deve essere eseguita entro 48 ore dalla preparazione del campione. Per iniziare, controllare il registro del citometro di flusso per assicurarsi che il personale della struttura abbia eseguito controlli di qualità. Per impostare l'esperimento di citometria a flusso, fare clic su un nuovo esperimento, seguito da nuovo campione e nuovo tubo, per aggiungere tubi.Selezionate i plottamenti bivariati, facendo clic sull'icona, e utilizzate i menu a discesa per selezionare i parametri di accesso. Garantire l'inclusione di un grafico CD16/CD14 e di un grafico che mostra un rilevatore insieme al tempo, per monitorare l'acquisizione. Inserire il tubo e fare clic, acquisire.Controllare le impostazioni di tensione dello strumento, assicurando che i segnali del rilevatore non siano fuori scala. Osservare le cellule che cadono nel cancello del monocita del grafico CD14/CD16. Impostare la soglia di registrazione su 5.000 eventi per il classico cancello monocito e fare clic sulla registrazione.Continuare a registrare i dati per i tubi rimanenti. Dopo aver registrato i dati per tutti i tubi, esportare i dati di flusso come file fcs per l'analisi. Per eseguire la gating monocite, aprite i file nel software di analisi, fate doppio clic sul nome del tubo e selezionate i parametri dai menu a discesa per visualizzare le celle su un'area di dispersione in avanti rispetto al grafico dell'altezza di dispersione in avanti.Create un cancello di esclusione del faretto, facendo clic sull'icona dello strumento cancello poligonale e racchiudendo le celle. Selezionare le celle recingate facendo doppio clic sull'area recintata. Nella nuova casella di visualizzazione, regolate i parametri del menu a discesa per visualizzare le celle su un'area di dispersione in avanti rispetto al tracciato dell'area di dispersione laterale.Clicca sull'icona del cancello rettangolare e seleziona generosamente la popolazione di monociti, in base alle proprietà di dispersione avanti e laterale, per escludere la maggior parte dei linfociti, delle cellule killer naturali e dei granulociti. Selezionate le celle recintate e rivisualizzate su un plottaggio CD14/CD16, selezionando i parametri utilizzando i menu a discesa. Clicca sul cancello poligonale, per selezionare i monociti in base alla loro caratteristica forma l rovesciata.Se la popolazione non classica non è distinta dalle cellule alla sua sinistra, allora la contaminazione è probabile e dovrebbe essere studiata. Selezionate le celle gated e visualizzate i monociti su un plottaggio HLA-DR CD/16, utilizzando i menu a discesa per selezionare i parametri. Fare clic sul cancello poligonale per selezionare le cellule positive HLA-DR ed escludere eventuali cellule e neutrofili natural killer rimanenti.Selezionate le celle gated e visualizzate le celle positive HLA-DR in un plottaggio CD14/HLA-DR utilizzando i menu a discesa per selezionare i parametri. Fare clic sul gate poligonale e disegnare un cancello per escludere le celle B basse HLA-DR high/CD14. Selezionate le celle recintate e utilizzate i menu a discesa per visualizzarle in un plottaggio CD16/CD14.Dalle opzioni di plottaggio, selezionate il plottaggio zebrato, che consentirà di disegnare i cancelli del sottoinsieme monocito, per determinare le proporzioni dei sottoinsiemi. Ora, fate clic sull'icona della porta rettangolare e selezionate i monociti classici disegnando un cancello rettangolare approssimativo attorno alla bassa popolazione di monociti classici CD14 high/CD16. Sotto la visualizzazione, selezionare, mostrare le mediane, per visualizzare l'intensità di fluorescenza mediana per i monociti classici.Regolare il cancello in modo che la popolazione abbia una distribuzione uguale dalla mediana a sinistra e a destra, e comprenda tutte le celle a sinistra. Selezionare la popolazione intermedia disegnando una porta rettangolare che racchiude le celle a destra della porta classica. Regolare la parte inferiore del cancello per escludere le celle non classiche, allineando il cancello con il fondo dei cerchi concentrici, che si trovano completamente all'interno della classica porta monocita.Gate il sottoinsieme non classico, disegnando una casella rettangolare verso il basso dal bordo inferiore del sottoinsieme intermedio, selezionando tutte le celle nella parte inferiore della popolazione. In visualizzazione, selezionare, mostrare le frequenze di gate, per determinare la percentuale di ogni sottoinsieme di monociti. Infine, selezionare le celle da ogni sottoinsieme di monociti.Modificate i parametri a discesa per creare un istogramma per ogni sottoinsieme di monociti, visualizzando ogni marcatore. Quindi, calcola il grado di espressione, usando la mediana o la media geometrica, come descritto nel protocollo di testo. Qui vengono mostrate popolazioni di monociti recintate con successo.E le proporzioni sono in linea con quelle della letteratura. Le proporzioni per questo campione sono state calcolate come, 88,1% classico, 4,33% intermedi e 7,49% non classico. Valutando la posizione relativa di altre popolazioni, è chiaro che le cellule T e i neutrofili qui mostrati in blu, seguono ben al di fuori del monocita, forma l rovesciata, su un grafico CD16/CD14.Tuttavia, sia le cellule killer naturali che le popolazioni di cellule B, mostrate qui in blu, si sovrapponevano alla popolazione di monociti non classica. Le mappe di calore che confermano che i tipi di cellule contaminanti sono state rimosse, sono mostrate qui. Le cellule killer naturali sono state gated fuori dal passo HLA-DR CD16, mentre, le cellule B sono state gated fuori dal passo HLA-DR CD/ 14.L'espressione dei marcatori M1 e M2 in blu, rispetto ai loro controlli isotipi in rosso, è mostrata qui. CD120b un marcatore M1, mostra un chiaro spostamento sopra il suo controllo isotipo, per tutti i sottoinsiemi di monociti. Questo è anche il caso di CD93 un marcatore M2, con l'espressione più alta nel classico, moderata sugli intermedi e bassa su non classica.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che le celle contaminanti vengano gateed out, in quanto possono altrimenti contribuire all'espressione quantificata. A seguito di questa procedura, possono essere esaminati altri marcatori. Al fine di rispondere a ulteriori domande, come, come cambia l'espressione marcatore monocitare nella malattia.Non dimenticare che lavorare con sangue umano e formaldeide può essere pericoloso, e quindi precauzioni come i dispositivi di protezione individuale e l'uso di una cappa a rischio biologico, dovrebbero sempre essere prese quando si esegue questa procedura.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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