Indagini su GA (III) Complesso di EOB-DTPA e la sua ⁶⁸ Ga marcata radioattivamente analogico

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di valutare un nuovo complesso radioattivo di gallio-68 per l'imaging molecolare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della chimica del tracciante di gallio-68 come le condizioni di marcatura, la stabilità del tracciante e la lipofilia. La tecnica di marcatura radioattiva è semplice e consente una rapida determinazione dei risultati richiedendo solo quantità minime di materiale.

Per iniziare questa procedura, aggiungere tre millilitri di soluzione iniettabile di acido gadoxetico 0,25 molari in un pallone. Quindi aggiungere 500 milligrammi di acido ossalico alla soluzione di acido gadoxetico che si agita. Dopo aver agitato per un'ora, filtrare la sospensione attraverso una fritta a pressione ridotta.

Lavare il residuo tre volte con tre millilitri di acqua. Quindi, unire i filtrati acquosi in un becher e posizionare un elettrodo pH nella soluzione. Aggiungere 12 molari di acido cloridrico al filtrato fino a quando il pH è di circa 0,1.

Dopo aver rimosso il solvente nel vuoto, lavare accuratamente il residuo con acetato di etile caldo per rimuovere l'acido ossalico di accesso. Asciugare quindi il residuo a vuoto. Una volta che il residuo è asciutto, scioglierlo nuovamente in due millilitri di acqua deionizzata e poi raffreddare la soluzione in un bagno di ghiaccio.

Senza rimuovere il bagno di ghiaccio, aggiungere 0,5 molari di idrossido di sodio goccia a goccia fino a quando non si osserva un solido incolore e colloso. Quindi rimuovere l'acqua con una pipetta. Per preparare una soluzione madre 0,11 molare di tricloruro di gallio, sciogliere 1,94 grammi di solido in 100 millilitri di acqua.

Successivamente, sciogliere 80 milligrammi di EOB-DTPA in 10 millilitri di acqua. Se necessario, riscaldare la soluzione per ottenere la completa dissoluzione. Aggiungere 1,4 millilitri della soluzione madre di tricloruro di gallio alla soluzione EOB-DTPA e posizionare un elettrobo pH nel becher.

Quindi aggiungere una soluzione acquosa di ammoniaca diluita goccia a goccia fino a quando il pH della soluzione è di circa 4,1. Dopo aver rimosso il solvente sotto vuoto, porre il residuo in un pallone dotato di una testa d'acciaio con collo centrale e laterale parallelo. Dotare il collo centrale di un dito di raffreddamento e il collo laterale di un'uscita per la pompa del vuoto.

Riscaldare il residuo a pressione ridotta. Rimuovere periodicamente il cloruro di ammonio sublimato dal pallone con un panno leggermente umido. Precondizionare una cartuccia PSH plus lavandola lentamente con 1 millilitro di acido cloridrico 1 molare e, successivamente, 5 millilitri di acqua.

Successivamente, eluire la colonna di silice del generatore con quattro millilitri di acido cloridrico molare 0,05 e caricare l'eluato di gallio-68 nella cartuccia PSH plus. Sciacquare la cartuccia con cinque millilitri di acqua. Dopo l'essiccazione con aria, eluire il gallio-68 dalla cartuccia con un millilitro di cloruro di sodio acidificato a cinque molari.

Aggiungere ora 50 microlitri di eluato di gallio-68 e 50 microlitri di una soluzione madre EOB-DTPA da 19 micromolari precedentemente preparata in una fiala. Aggiungere 300 microlitri di tampone per aumentare il pH a 4,0. Agitare brevemente e incubare la soluzione a temperatura ambiente per cinque minuti.

Trasferire un'aliquota da cinque a 20 microlitri della soluzione in un flaconcino per HPLC. Quindi eseguire l'analisi HPLC radio su una colonna C18 a fase invertita. Per eseguire le misurazioni di stabilità in vitro, prelevare campioni dalla soluzione di marcatura contenente da sei a 12 megabecquerel di tracciante.

Esecuzione di analisi TLC radio su piastre di alluminio rivestite con gel di silice da 80 millimetri utilizzando citrato di sodio acquoso molare 0,1 molare come eluente. Analizza le lastre con uno scanner di radioattività TLC. Per determinare la stabilità in soluzione salina tamponata con fosfato, aggiungere 150 microlitri di soluzione madre di PBS da 10 millimolari e 60 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 a 65 microlitri di soluzione di marcatura.

Mescolare accuratamente la soluzione. Successivamente, trasferire da uno a cinque microlitri di aliquota della soluzione in una piastra di silice per l'analisi TLC. Conservare immediatamente la soluzione in un incubatore a 37 gradi Celsius.

Rimuovi le aliquote per eseguire l'analisi TLC in punti temporali rappresentativi nell'arco di tre ore. Per determinare la stabilità verso un eccesso di apotransferrina, aggiungere 50 microlitri di soluzione madre di PBS da 10 millimolari e 430 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 a 120 microlitri di soluzione di marcatura. Aggiungere 40 microlitri di una soluzione da 25 milligrammi per millilitro di apotransferrina e mescolare accuratamente la soluzione.

Successivamente, trasferire un'aliquota da uno a cinque microlitri della soluzione in una piastra di silice per l'analisi TLC. Conservare immediatamente la soluzione in un incubatore a 37 gradi Celsius. Rimuovi le aliquote per eseguire l'analisi TLC in punti temporali rappresentativi nell'arco di tre ore.

Per determinare la stabilità nel siero umano, aggiungere 45 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 e 500 microlitri di siero umano a 25 microlitri di soluzione di marcatura. Dopo aver accuratamente miscelato la soluzione, trasferire un'aliquota da uno a cinque microlitri in una piastra di silice per l'analisi TLC. Conservare immediatamente la soluzione in un incubatore a 37 gradi Celsius.

Rimuovi le aliquote per eseguire l'analisi TLC in punti temporali rappresentativi nell'arco di tre ore. Per determinare il coefficiente di distribuzione, aggiungere 20 microlitri di soluzione madre PBS da 10 millimolari e 170 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 a 50 microlitri di soluzione di marcatura. Trasferire 200 microlitri di soluzione in un flaconcino di plastica a V e aggiungere 200 microlitri di n-ottanolo.

Chiudere la fiala e vorticare per due minuti, quindi centrifugare il campione a 1600 volte g per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere i triplicati di 40 microlitri dalla fase n-ottanolo e dalla fase acquosa e metterli in fiale di plastica a V separate. Infine, misurare l'attività di ciascun campione in un contatore di pozzetti gamma per 30 secondi.

L'EOB-DTPA ligenato e il complesso di gallio tre non radioattivo sono stati analizzati tramite spettroscopia NMR di protoni e carbonio, spettrometria di massa e analisi elementare. La procedura di marcatura porta alla formazione del tracciante desiderato, gallio-68, EOB-DTPA, indicato come picco radio HPLC che mostra un tempo di ritenzione di 2,8 minuti. Il confronto con il tempo di ritenzione dello standard a freddo a 220 nanometri conferma il successo dell'etichettatura.

L'efficienza di marcatura del gallio-68 di EOB-DTPA è stata studiata determinando la resa di marcatura in funzione della concentrazione ligenata tramite HPLC. Qui è mostrato un cromatogramma rappresentativo di una lastra TLC analizzata con uno scanner di radioattività TLC. Per studiare la stabilità del tracciante, la purezza radiochimica nel tempo è stata determinata tramite TLC.

La percentuale standardizzata di tracciante intatto è qui rappresentata in funzione del tempo. I valori di attività e il successivo calcolo del coefficiente di distribuzione sono elencati qui. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come gli esperimenti in vitro, per rispondere a ulteriori domande come la biodistribuzione e le dinamiche di assorbimento.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione delle tecniche utilizzate per valutare e analizzare i traccianti di gallio-68 per l'imaging molecolare. Non dimenticare che lavorare con sostanze radioattive può essere dannoso. Può essere eseguito solo da personale addestrato.

Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni di sicurezza come l'uso di schermi di piombo e pinzette.