Metodo per l'isolamento e l'identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

L'obiettivo di questo video è dimostrare il metodo per l'isolamento e l'identificazione di RNA e componenti proteici di complessi ribonucleoproteici da estratti cellulari utilizzando metodi di immunoprecipitazione. Ciao, mi chiamo Garrett Dom e sono uno studente laureato presso il dipartimento di Molecular and Microbiology and Immunology presso l'Università del Missouri e studia con il Dr.Eli sso. Grazie al progresso del sequenziamento ad alto rendimento e dell'analisi efficiente dei microarray, l'espressione genica e l'analisi globale sono diventate una forma di raccolta dati facile e prontamente disponibile in molti modelli di ricerca e malattia.

Tuttavia, i livelli di stato di studio dell'mRNA del gene bersaglio non sempre sono direttamente correlati con i livelli di proteina allo stato stazionario. La regolazione genica post-trascrizionale è una probabile spiegazione della divergenza tra i due. Guidato dalle interazioni delle proteine leganti l'RNA.

La regolazione post-trascrizionale influenza la localizzazione, la stabilità e la traduzione dell'mRNA formando un complesso proteico nucleo a coste con mRNA bersaglio. L'identificazione di questi bersagli sconosciuti dell'mRNA di Denovo dagli estratti cellulari di questo complesso è fondamentale per comprendere i meccanismi e le funzioni della proteina legante l'RNA e il loro effetto risultante sulla produzione proteica. Questo protocollo delinea un metodo chiamato proteina ribo, immunoimmunoprecipitazione o rip, che consente l'identificazione di specifici mRNA associati nel complesso ribonucleoproteico.

Prima di iniziare l'esperimento, è fondamentale avere tutti i reagenti, i contenitori e gli utensili. Gli RNA free trattano la vetreria con inibitore della R nasi come l'RNA ZAP di ambion, seguito dal risciacquo con acqua trattata con dpci, assicurano che tutti i reagenti siano confermati come privi di RNA. Il primo passo della procedura consiste nel raccogliere il complesso proteico del nucleo costale dal lisato cellulare, raccogliere cellule tissutali in crescita esponenziale per produrre da due a cinque milligrammi di proteine totali per ogni campione utilizzato, di solito sono sufficienti due piastre di coltura P uno 50.

Qui stiamo raccogliendo sette linee cellulari di cancro al seno umano MB 2, 31 e MC e studiando le interazioni del nucleo ribone della proteina legante l'RNA. Chi sono È importante notare che per ogni proteina legante l'RNA oggetto di indagine, il numero cellulare totale e le quantità proteiche devono essere ottimizzati per massimizzare le interazioni appropriate tra mRNA bersaglio e proteine leganti l'RNA. Pellet di cellule tramite centrifugazione a 1000 giri/min per circa 8-10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi lavare tre volte con PBS ghiacciato Dopo il lavaggio finale, muovere delicatamente il fondo del tubo e risospendere il pellet cellulare in volumi uguali di tampone di lisi polisomiale preparato con RNA e inibitori della proteasi.

Si consiglia di misurare il volume esatto del pellet cellulare, pipettare delicatamente la miscela per rompere i grumi di cellule e incubare il lisato su ghiaccio per cinque minuti. Centrifugare a 13.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius per eliminare il lisato dai detriti e trasferire immediatamente il surnatante eliminato agli RNA pre-raffreddati. Le provette per microcentrifuga gratuite si conservano in ghiaccio e si conservano a meno 80 gradi Celsius.

Questo lisato può essere conservato fino a sei mesi a meno 80 gradi Celsius. Evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento in quanto ciò può portare alla degradazione delle proteine e/o dell'mRNA. È meglio fare l'IP immediatamente.

Quantificare rapidamente la concentrazione di proteine e il lisato utilizzando il saggio proteico standard di Bradford. Successivamente, dovremo preparare i materiali per l'isolamento della nostra specifica proteina di interesse. Prima proteina pre rigonfiamento.

Un perle Sphero pernotta in N NT due tampone integrato con il 5% di BSA a quattro gradi Celsius. Utilizzare NT due tamponi con un rapporto di quattro a uno con perline PAS. È possibile una conservazione a lungo termine fino a diversi mesi a quattro gradi Celsius.

Se integrato con lo 0,1% di sodio azi prima dell'uso, rimuovere l'eccesso di NT due tamponi in modo che il rapporto finale tra perle e tampone sia di uno a uno. Utilizzando provette da microcentrifuga prive di RNA da 1,5 millilitri, rimuovere 100 microlitri di liquame di velocità SRO e aggiungere 30 microgrammi di anticorpi per ogni singola reazione IP. Ad esempio, nel nostro esperimento utilizziamo un anticorpo che è, che è un anticorpo IgG di topo.

Pertanto, anche il nostro anticorpo di controllo è IgG. Quindi, aggiungere da 100 a 200 microlitri di NT a due tamponi alla miscela di perle di anticorpi. Inoltre, un anticorpo corrispondente all'isotipo o un intero siero normale della stessa specie dovrebbe essere utilizzato in parallelo come controllo anticorpale contro l'RNA di fondo.

Aggiungere l'anticorpo appropriato alla miscela di perline e incubare durante la notte burattando oltre l'estremità a quattro gradi Celsius. Preparare le perle rivestite di anticorpi immediatamente prima dell'uso lavandole con un millilitro di ghiaccio freddo NT due tamponi, cinque volte lavare le perle mediante centrifugazione a 13.000 G per uno o due minuti a quattro gradi. Rimuovere con cautela il surnatante con pipettatore manuale o aspiratore.

Questo lavaggio aiuta a rimuovere gli anticorpi non legati e i contaminanti dell'RNA dalla miscela di anticorpi. Una volta completato il lavaggio finale, sospendere nuovamente le perle e 700 microlitri di tampone T 2 ghiacciato, seguito da un trattamento con vari inibitori di RNA per proteggere gli mRNA bersaglio, tra cui 10 microlitri di RNA, 10 microlitri di DTT da 100 millimolari e 15 microlitri di EDTA. Portare il volume a 900 microlitri con NT due tamponi.

Successivamente, immineremo il complesso bersaglio. Si consiglia vivamente di utilizzare un passaggio di pre-clear per ridurre il segnale di fondo nell'analisi dell'RNA dopo la procedura di rip pre-clear con 15 microgrammi di controllo isotipico per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere 50 microlitri di perle PAS gonfie non rivestite di anticorpi.

Incubare 30 minuti a quattro gradi Celsius con rotazione e oltre in centrifuga a 10.000 G a quattro gradi Celsius. Due pallini. Salva il super natin per ip.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di lisato chiarificato isolato con circa due-cinque milligrammi di proteine alla miscela di anticorpi preparata. La diluizione del lisato aiuterà a ridurre l'avvolgimento di fondo, il tubo e la paraforma per garantire una tenuta al soffitto e incubare a quattro gradi Celsius per quattro ore, rotolando e oltre nelle perle di pellet successive a 5.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risparmiare il supernat per l'analisi potenziale conservandolo a meno 80 gradi Celsius come descritto in precedenza. Lavare le perle cinque volte con un millilitro di ghiaccio freddo e T due tampone e centrifugazione.

Quindi rimuovere il super natin con un pipettatore manuale o un aspiratore. Metodi più rigorosi possono essere utilizzati per ridurre il fondo integrando NT two buffer con deossicoato di sodio, uria o SDS. Mantenere i campioni in ghiaccio il più possibile e lavorare rapidamente per ridurre al minimo la degradazione dell'mRNA target.

Infine, utilizzeremo trattamenti con DNA e proteinasi K seguiti da precipitazione dell'RNA per isolare gli RNA della proteina nucleare ribone dopo il lavaggio con perle di risospensione con 100 microlitri di N NT due tamponi integrati con cinque microlitri di RNA DNA libero uno. Conservare i campioni a 37 gradi Celsius per cinque-10 minuti. Aggiungere un millilitro di N NT due tampone e centrifugare a 5.000 g per cinque minuti.

Scartare la proteina di spin SUPERNAT Reese, un pellet SROs e 100 microlitri di NT, due tamponi con cinque microlitri di proteinasi K a 10 milligrammi per millilitro e un microlitro di SDS al 10%, incubare la miscela di perle risospese per 30 minuti in un bagno d'acqua a 55 gradi Celsius, muovendo delicatamente ogni 10 minuti. La proteinasi K aiuta il rilascio dei componenti proteici del nucleo costale. Perline in pellet.

Aggiungere 5.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente, raccogliere il nome del super, che dovrebbe essere di circa 100 microlitri di volume. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di centrifuga NT a due tamponi a 5.000 G per due minuti. Raccogli circa 200 microlitri di super natin e scarta le perline.

Unire la super natin e aggiungere 300 microlitri di vortice di fenolo acido a strato inferiore. Un minuto a temperatura ambiente e centrifugare alla massima velocità a temperatura ambiente per un minuto. Raccogli 250 microlitri di strato superiore.

Fai molta attenzione a non disturbare l'interfaccia in quanto ciò potrebbe contaminarsi. Il campione di RNA aggiunge 25 microlitri di acetato di sodio a pH di 5,2 625 microlitri di etanolo refrigerato al 100% e cinque microlitri di miscela di glico blu. Conservare bene durante la notte a meno 20 gradi Celsius.

Inoltre, per garantire un corretto recupero dell'RNA. L'aggiunta di glico blu aumenterà la visibilità del pellet di RNA agendo come molecola vettore il giorno successivo, mescolando le provette invertendole da tre a cinque volte, quindi centrifugare a 12.000 G a quattro gradi Celsius per 30 minuti e scartare la super natina. Aggiungere un millilitro di etanolo refrigerato al 70% al pellet blu e miscelato mediante centrifuga a inversione o vortice.

Campionare a 12.000 g a quattro gradi Celsius per due minuti. Scartare il supernat e centrifugare a 12.000 g per un minuto a quattro gradi Celsius. Rimuovere eventuali residui, etanolo al 70% con una pipetta e pellet essiccato all'aria.

Aggiungere la temperatura ambiente per cinque minuti. Respendi in 20-40 microlitri di RNA, acqua priva di DNA. Il campione è ora pronto per la quantificazione mediante spettrometria NanoDrop e ulteriori applicazioni a valle, come la PCR quantitativa in tempo reale o l'analisi di microarray dopo l'isolamento dell'RNA, il microarray e la PCR quantitativa in tempo reale sono stati eseguiti per rivelare i bersagli dell'mRNA della proteina legante l'RNA e il loro conseguente arricchimento dall'immunoprecipitazione.

La conferma mediante western blot rivela un isolamento netto di chi sono le proteine. La PCR quantitativa dimostra l'arricchimento del fold dell'mRNA target beta actina rispetto ai controlli IgG one. Mentre l'analisi dei microarray rivela profili genetici unici tra MC 7 e MB 2 31, l'immunoprecipitazione delle proteine del nucleo delle costole delle linee cellulari del cancro al seno si è rivelata uno strumento eccellente utilizzato per isolare e studiare le interazioni tra le proteine leganti l'RNA e il loro MR. Un obiettivo del nostro gruppo, così come di molti altri gruppi di ricerca, anche se sensibile nella natura e nella pratica, la corretta esecuzione di questa procedura porterà all'isolamento di questi complessi proteici del nucleo costale, che fino a poco tempo fa erano inaccessibili per la scoperta e l'analisi.