Name: Metodo per lisolamento e lidentificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Impara a isolare e identificare mRNA e componenti proteici dei complessi ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip. Questo metodo consente di studiare la regolazione post-trascrizionale dei geni.

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Dipartimento della Difesa (Premio Idea W81XWH-07-0406) - Per Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870 - Per Ulus Atasoy NIH R21 A1079341 - Per Ulus Atasoy University of Missouri fondi istituzionali - Per Ulus Atasoy

Esperimento di preparazione Prima di iniziare la sperimentazione, è fondamentale disporre di tutti i reagenti, contenitori e utensili RNasi libero. Trattare vetreria con RNasi inibitore (RNaseZAP, Ambion) seguito da risciacquo con acqua trattata con DEPC. Assicurarsi che tutti i reagenti sono confermati come RNasi libero. 1. Preparare mRNP lisato <ol><li> Coltivare e raccogliere le cellule del tessuto in crescita esponenziale a produrre tra 2-5 mg di proteina totale per ogni RIP. <ol class="lalpha"><li> Due piastre di coltura P150 sono in genere sufficienti. </li><li> Per ogni RBP in fase di studio, il numero totale ammonta cellulari e proteine ​​deve essere ottimizzata per massimizzare l&#39;mRNA di destinazione appropriata e le interazioni RBP. </li><li> RIP per qRT-PCR può richiedere meno lisato cellulare (circa 400 mg di proteine ​​totali) a causa della sua amplificazione e metodo di rilevazione soprattutto per RBP abbondanza elevati, come HuR, AUF1, TIAR. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Cellule pellet tramite centrifugazione a 200 xg per 8-10 min a 4 ° C, quindi lavare tre volte con PBS ghiacciato. </li><li> Dopo il lavaggio finale, picchietti leggermente la parte inferiore del tubo e risospendere il pellet cellulare in volumi uguali di preparato tampone di lisi polisomi (PLB) con inibitori della proteasi e RNasi. <ol class="lalpha"><li> Si consiglia di misurare il volume esatto di pellet. </li></ol></li><li> Miscela delicatamente pipetta (non vortex) a spezzare grumi di cellule e incubare lisato in ghiaccio per 5 min. </li><li> Centrifugare a 13.000 xg per 20 min a 4 ° C per cancellare il lisato di detriti. </li><li> Trasferire immediatamente eliminato sopranatante in pre-raffreddata provetta per microcentrifuga. </li><li> Tenere su ghiaccio e conservare a -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Congelamento immediato completa la lisi adeguata delle cellule e previene il legame indesiderato. Procedere con disgelo campione RIP immediatamente dopo e mantenere i campioni in ghiaccio per evitare la degradazione dell&#39;RNA. &lt;/ Li&gt; <li> Questo lisato può essere conservato per un massimo di sei mesi a -80 ° C. Evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo in quanto ciò può portare a proteine ​​e / o degradazione mRNA. </li></ol></li><li> Quantificare la concentrazione proteica nel lisato mediante saggio standard Protein Bradford. </li></ol> 2. Proteina di rivestimento A Perle Sepharose con anticorpi e Wash <ol><li> Pre-swell proteina A Sepharose (PAS) in perline overnight NT2 tampone (3-4 volumi) con 5% BSA. Conservare a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Conservazione a lungo termine fino a diversi mesi a 4 ° C è possibile quando è integrato con sodio azide allo 0,1%. </li><li> Perline Sepharose proteine ​​devono essere scelti sulla base di isotipo di anticorpo bersaglio RBP. Proteine ​​A, G e A / G tutti hanno obiettivi isotipo specifici e variano in affinità di destinazione. Proteine ​​perline A Sepharose sono stati utilizzati sulla base di specificità isotipo e affinità per gli anticorpi della proteina Hur. </li></ol></li><li> Prima dell&#39;uso, rimuovere l&#39;eccesso di tampone NT2, cosìche perle finali al rapporto del buffer è di 1:1. </li><li> Con 1,5 ml RNasi-free microprovette, rimuovere 100 pl di PAS liquami e aggiungere 30 mg di anticorpo per ogni reazione IP individuale (ad esempio, specifica RBP e controllo isotipo). </li><li> Aggiungere 100-200 ml di tampone per NT2 anticorpo miscela di sferette. <ol class="lalpha"><li> Miscela può essere conservata per diverse settimane a 4 ° C quando è integrato con 0,1% di sodio azide. </li><li> Un isotipo-abbinato anticorpo o tutta sieri normali da una stessa specie devono essere utilizzati in parallelo come un controllo anticorpo contro RNA sfondo. </li></ol></li><li> Aggiungi anticorpo opportuno miscela di sferette ed incubare una notte, cadendo fine sull&#39;estremità a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Ottimizzate il titolo anticorpale per proteina specifica in fase di studio (mg 1, 5, 10 o 30 di anticorpo è di solito sufficiente). </li></ol></li><li> Preparare anticorpi perle rivestite immediatamente prima dell&#39;uso mediante lavaggio con 1 ml dighiacciato NT2 buffer di 5 volte. <ol class="lalpha"><li> Lavare miscela di sferette per centrifugazione a 13.000 xg per 1-2 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere con attenzione la quantità massima di supernantant con pipetta mano o aspiratore, ma stare attenti a non interrompere pellet. </li><li> Lavaggio aiuta a rimuovere l&#39;anticorpo non legato e contaminanti RNasi da miscela di anticorpi. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio è stato completato, risospendere le sfere in 700 pl di tampone ghiacciato NT2 seguita da trattamento con vari inibitori della RNasi per proteggere gli mRNA bersaglio, di cui 10 ml di RNasi a 40 U / pl, 10 pl di 100 mM DTT e 15 microlitri EDTA (15 mM). Portare il volume a 1000 ml con tampone NT2. <ol class="lalpha"><li> Complessi ribonucleosidi Vanadil non sono utilizzati a causa dell&#39;effetto inibitorio di EDTA. </li></ol></li></ol> 3. Immunoprecipitazione e RNA Precipitazione <ol><li> Opzionale Passo preclear:<ol class="lalpha"><li> Per ridurre sfondo, perline e anticorpo di controllo può essere utilizzato per pre-clear lisato. Questo può ridurre il segnale in uscita. </li><li> Questo passaggio può essere necessario ridurre il fondo quando si fa IP seguita da microarray. Non è generalmente necessario per IP seguita da RT-PCR. </li><li> Preclear con 15 microgrammi di controllo isotipo per 30 min / 4 ° C fine oscillando negli fine. </li><li> Aggiungere 50 ml di perline preswollen PAS non rivestiti con anticorpo dal punto 2.1. </li><li> Incubare 30 min / 4 ° C con l&#39;estremità di rotazione rispetto a fine </li><li> Centrifugare a 10.000 xg a 4 ° C. Salva surnatante per IP. </li></ol></li><li> Aggiungere 100 ml di lisato isolato eliminato (circa 2-5 mg) al mix di anticorpi preparati. <ol class="lalpha"><li> Diluizione lisato contribuirà a ridurre il fondo e legame non specifico. </li><li> Quantità di input lisato può variare a seconda del metodo di rilevazione e abbondanza di RBP oefficienza r di anticorpi RBP come indicato nel passo 1.1.c. </li></ol></li><li> (Facoltativo) Miscelare immediatamente tubo delicatamente muovendo più volte, centrifugando breve a 10.000 xg a 4 ° C per perline pellet e rimuovere immediatamente 100 pl di surnatante come rappresentazione totale mRNA input per analisi qPCR utilizzando le normali tecniche di isolamento dell&#39;RNA. <ol class="lalpha"><li> Questo passo è quello di confermare che l&#39;input lisato RNA è ottimale per IP e deve essere eseguita solo come un passo di controllo o come un passo di risoluzione dei problemi in seguito PIR con scarsi risultati RNA. </li></ol></li><li> Tube Wrap in parafilm per assicurare la tenuta stretta e incubare a 4 ° C per 2 a 4 ore, cadendo fine su fine. <ol class="lalpha"><li> Tempi di incubazione dovrebbe essere ottimizzato basato sull&#39;abbondanza bersaglio e deve essere minimizzato per evitare complesso riarrangiamento o degradazione. Per alcuni RBPs brevi incubazioni possono essere più ottimale. </li></ol></li><li> Perline pellet a 5.000 XGFo 5 min a 4 ° C il surnatante e potenziale per analisi mediante Western blot. Aliquote Conservare a -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Aliquote di supernatante con elevate quantità di proteine ​​bersaglio residua può indicare un guasto della proteina per essere precipitato da perline sefarosio. </li></ol></li><li> Come descritto in precedenza, lavare perline 5 volte con 1 ml di tampone ghiacciato e NT2 centrifugazione (5000 xg per 5 minuti a 4 ° C), quindi rimuovere il surnatante con pipettatore mano o un aspiratore. <ol class="lalpha"><li> Metodi di lavaggio più rigorose possono essere utilizzati per ridurre sfondo completandolo NT2 tampone con sodio desossicolato, urea o SDS. </li><li> Tenere campioni in ghiaccio per quanto possibile e lavorare rapidamente per minimizzare la degradazione di mRNA bersaglio. </li></ol></li><li> Opzionale: Salva una piccola aliquota (10%) di miscela di sferette o eseguire un campione supplementare in parallelo per il controllo della efficienza IP proteina bersaglio mediante analisi Western blot.</li></ol> 4. DNasi e proteinasi K Trattamenti <ol><li> Dopo il lavaggio, risospendere le perline con 100 pl di tampone NT2 supplementato con 5 ml di RNase-free DNase 1 (2 U / pl). </li><li> Mantenere a 37 ° C per 5-10 min. Aggiungere 1 ml di tampone NT2 e centrifugare a 5000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. <ol class="lalpha"><li> Una piccola (~ 10%) aliquota di perle possono essere utilizzati per verificare l&#39;efficienza IP mediante SDS-PAGE. </li></ol></li><li> Risospendere PAS pellet in 100 microlitri tampone NT2, 5 pl proteinasi K (10 mg / ml), e 1 pl SDS 10%. </li><li> Incubare la miscela risospeso tallone per 30 min a 55 ° C in un bagno d&#39;acqua, delicatamente sfogliando ogni 10 min. <ol class="lalpha"><li> Proteinasi K sarà di aiuto nel rilascio dei componenti RNP. </li></ol></li><li> Perline pellet a 5000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) e raccogliere il surnatante (~ 100 pl). </li><li> Aggiungere 200 microlitri NT2 buffer perline, centrifugheFuge 5000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente, raccogliere il supernatante (~ 200 pl), e perline rigetti. </li><li> Combinare supernatanti (100 microlitri e 200 microlitri) e aggiungere strato inferiore 300 ul di acido fenolo-CHCl 3. </li><li> Vortice, 1 min RT (o 37 ° C in shaker) e centrifugare a 16.000 xg a temperatura ambiente per 1 min. </li><li> Raccogliere 250 ml di strato superiore (NON interrompere l&#39;interfaccia), aggiungere 25 microlitri di acetato di sodio a pH 5,2, 625 microlitri ETOH 100% e 5 glycoblue microlitri, e mescolare bene. </li><li> Memorizzare una notte a -20 ° C. <ol class="lalpha"><li> Per garantire il corretto recupero di RNA, l&#39;aggiunta di glycoblue aumenterà la visibilità del pellet di RNA agendo come una molecola di trasporto. </li></ol></li><li> Il giorno seguente, i tubi Mescolare capovolgendo 3-5 volte, girare a 12.000 xg a 4 ° C per 30 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di 70% ETOH per il pellet blu e mescolare per inversione o vortex. </li><li> Centrifugare 12.000 xg a 4 ° C per 2 min. </li><li> Discard surnatante e centrifugare 12.000 xg per 1 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere qualsiasi residuo di ETOH 70% con una pipetta e pellet aria secca a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Risospendere in 20-40 microlitri RNasi / DNasi-free acqua o un altro volume appropriato in base alle esigenze. <ol class="lalpha"><li> Il campione è ora pronto per ulteriori applicazioni a valle, come qRT-PCR o microarray. </li><li> Spettrofotometria Nanodrop può essere utilizzato per valutare la concentrazione del campione, tuttavia, con campioni preziosi, può essere utile per evitare campioni nanodropping come può essere uno spreco e relativamente imprecisa. Si consiglia di campioni per la normalizzazione trascritti del gene housekeeping per valutare la purezza e l&#39;efficienza IP per campioni di rendimento preziosi o bassa. </li></ol></li></ol> 5. Risultati rappresentativi Se la procedura è ottimizzato ed eseguito correttamente, il immunoprecipitazione dovrebbe produrre un arricchimento significativo di mRNA target. Tipicamente, A seconda della sua destinazione e RBP mRNA (s), vediamo arricchimento di circa 10 - a 50 volte quando valutata mediante RT-PCR. Molti obiettivi RBP può essere scoperto in massa usando l&#39;analisi microarray. Tuttavia, questo metodo è più sensibile alla degradazione rispetto qRT-PCR. A seconda della RBP, il numero di obiettivi e l&#39;efficienza della reazione, microarray può rivelare centinaia di nuovi bersagli, o può scoprire solo pochi, se presente. Ad esempio, uno dei meglio caratterizzato RNA binding proteins HuR, post-trascrizionalmente regola l&#39;espressione e la traduzione di molti geni importanti fisiologiche 1, 2. Isolamento del HuR-ribonucleo-complesso tramite RIP-Chip in linee cellulari di tumore mammario, per esempio, ha rivelato arricchimento di alcuni importanti obiettivi Hur note, comprese β-actina mediante RT-PCR, come mostrato in Figura 1. Nelle linee di cellule tumorali sia β-actina è arricchito 12 - a 15 volte. In genere, quando eseguita correttamente vediamo un significativo Enrichment di β-actina in una varietà di linee cellulari. Tuttavia, se il RIP non rivela alcuna arricchimento significativo per la β-actina questo indica un problema con il RIP e la procedura può essere necessario ripetere. Inoltre, l&#39;analisi di campioni microarray immunoprecipitate da queste linee cellulari di espressione rivelato sottoinsiemi distinti di obiettivi in Hur recettore degli estrogeni (ER diversa) positive cellule MCF-7 cancro rispetto negativi per ER-MB 231 linee cellulari di tumore mammario come evidenziato in Figura 2 1. Tali obiettivi rientrano in diverse categorie: obiettivi Hur conosciuti e sconosciuti che erano o associati o non associati con il cancro. Ad esempio, CALM2 e CD9 sono entrambi geni del cancro che non sono stati precedentemente identificati come obiettivi Hur. Utilizzando il microarray e confermando con RT-PCR, e CALM2 CD9 sono risultati 5 - a 180 volte arricchito in pellet HuR indica una interazione tra la proteina prominente HuR e questi geni bersaglio. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Figura 1&quot; /&gt; Figura 1. Immunoprecipitazione e RIP in MB-231 (ER-) e MCF-7 (ER +), le cellule di cancro al seno. Immunoprecipitazione sono stati eseguiti da MB-231 o MCF-7 lisati cellulari utilizzando anticorpi anti-Hur anticorpo monoclonale (3A2) e di controllo isotipo IgG1. A. IP occidentale HuR rivelato banda dimensioni previste, come rilevato da 3A2. Pannello a destra rivela quantità di HuR in ingresso lisati utilizzato da entrambe le linee cellulari, con β-tubulina come controllo di caricamento. B. Verifica da RT-PCR ha mostrato quindici e undici volte arricchimenti di β-actina, un bersaglio HuR noto, nei PI 3A2 da MB-231 e MCF-7, rispettivamente. Tutti i valori sono stati normalizzati per ΔΔCT GAPDH. Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato (n = 2). <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. HuR RIP-CHIP identifica distinti profili genetici in ER + e ER-cellule di cancro al seno.Immunoprecipitazione Hur sono state eseguite da MB-231 o MCF-7 lisati cellulari con anticorpi IgG1 e HuR controllo isotipo ibridato Illumina array Sentrix (47.000 geni). Segnali di controllo sono stati sottratti. I risultati rappresentano dati cumulativi da 12 matrici differenti. Esperimenti sono stati fatti in triplicato (n = 3) per ciascuna linea cellulare con controlli corrispondenti. Le scale sono log2.

<ol><li>Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+protein+HuR+differentially+regulates+unique+subsets+of+mRNAs+in+estrogen+receptor+negative+and+estrogen+receptor+positive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.</a> BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).</li>
<li>Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+RNA+binding+protein+HuR+impairs+tumor+growth+in+triple+negative+breast+cancer+associated+with+deficient+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).</li>
<li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP-Chip%3A+the+isolation+and+identification+of+mRNAs%2C+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonomics%3A+identifying+mRNA+subsets+in+mRNP+complexes+using+antibodies+to+RNA-binding+proteins+and+genomic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays.</a> Methods. 26, 191-198 (2002).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+regulatory+analysis+using+en+masse+nuclear+run-ons+and+ribonomic+profiling+with+autoimmune+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera.</a> Gene. 317, 79-87 (2003).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).</li>
<li>Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+RIP-Chip+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in RIP-Chip Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).</li>
<li>de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).</li>
<li>de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuR%3A+post-transcriptional+paths+to+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">HuR: post-transcriptional paths to malignancy.</a> RNA Biol. 2, 11-13 (2005).</li>
<li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+stability+using+transcription+inhibitors+and+microarrays+reveals+posttranscriptional+control+of+ribosome+biogenesis+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors.</a> Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).</li>
<li>Hieronymus, H., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA-protein+interactions+illustrates+specificity+of+the+mRNA+export+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery.</a> Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).</li>
<li>Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mRNA+surveillance+is+coupled+to+mRNA+export%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export.</a> Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).</li>
<li>Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Regulatory+Mapping+Indicates+that+the+RNA-Binding+Protein+HuR+Couples+Pre-mRNA+Processing+and+mRNA+Stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability.</a> Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

A causa della natura di questa ottimizzazione esperimento, e l&#39;esperienza saranno gli unici modi garantiti per acquisire con successo i risultati attesi. In molti passi di questo procedimento, la temperatura e la gestione efficiente di reagenti e prodotti sono criticamente importanti. Una corretta pianificazione e l&#39;esecuzione della tecnica aiuterà ad assicurare che l&#39;esperimento è stato eseguito in un periodo di tempo adeguato alle temperature ottimali consigliate. Una questione importante con gli esperimenti di isolamento di RNA è la sensibilità di RNA alla degradazione da RNasi. Tutti i reagenti devono essere RNasi libero e immagazzinati o utilizzati in contenitori privi di RNasi. Questo è un passo fondamentale per garantire l&#39;integrità del campione di mRNA. Anche quando l&#39;esperimento viene eseguito correttamente, tuttavia, il risultato desiderato non può essere raggiunto a causa della natura della interazione tra l&#39;RBP e suoi mRNA bersaglio. Un potenziale problema è avere basso o addirittura nessun segnale dal RNA isolato da RIP-Chip.Anche se ci può essere il segnale di RNA totale, questo può essere il risultato di insufficiente legame proteico essere tirato giù dalle perle. Il primo passo di risoluzione dei problemi è confermare che il lisato cellulare utilizzato ha espressione adeguata del RBP specifico. Alla conferma, le proteine ​​possono essere isolati dopo il lavaggio finale NT2 e risospese in tampone Laemmli o altro tampone appropriato denaturazione e riscaldata a 95 ° C per 5 min. Analisi Western blot può essere utilizzato su questi campioni in coordinamento con lisato ingresso nonché controlli negativi per garantire sufficiente tirare verso il basso di proteine ​​associate. Inoltre, poiché la lisi cellulare è necessario per accedere a questi componenti, il potenziale di interazioni anormali e indesiderabili tra proteine ​​normalmente separati e mRNA possono essere introdotti. Queste interazioni potrebbero legare e &quot;assorbire&quot; le mRNA bersaglio o proteine ​​di legame attraverso interazioni non specifiche. Inoltre, in queste proteine ​​co variandonditions può piegare in più varianti e dei loro motivi di legame può diventare inaccessibile ai loro mRNA bersaglio, impedendo loro interazioni. Entrambi rafforzare l&#39;importanza di lavorare efficacemente, nonché utilizzando le temperature ottimali elencati limitare queste interazioni indesiderate. Inoltre, l&#39;ottimizzazione delle condizioni di lavaggio per ogni proteina bersaglio specifico sarà fondamentale per massimizzare la purezza dell&#39;interazione. Condizioni di lavaggio più severi può essere necessaria. Per esempio, il tampone di lavaggio può essere integrato con SDS o una quantità appropriata di urea per ridurre le interazioni non specifiche e sfondo nel segnale di uscita. Questo sarà completamente dipendente RBP bersaglio dello sperimentatore nonché l&#39;mRNA bersaglio nelle loro condizioni fisiologiche uniche. Alcune condizioni non sarà adatto a determinati strumenti di analisi di mRNA, che devono essere conosciute per la preparazione dei campioni. Infine, anche se è riuscito a RIP l&#39;arricchimento di RNA-RBP interazioni, un problema ben noto con RIP (CHIP) metodo è l&#39;incapacità di identificare i domini di legame specifico del RBP sui bersagli mRNA transitori. Diverse tecniche di reticolazione può essere utilizzata seguita da RIP isolare obiettivi sequenza univoci, tuttavia, l&#39;uso di onde corte UV tende a portare a danni acido nucleico. Un nuovo metodo noto come PAR-CLIP, o reticolazione ribonucleoside fotoattivabile e immuoprecipitation, impiega onda lunga UV per incorporare thiouridine in RNA nascenti che consentono l&#39;identificazione di siti di legame unici sia da stabili e transitori interazioni RNA. Nel complesso, RIP-Chip è stato stabilito come un ottimo strumento utilizzato per isolare e studiare le interazioni tra proteine ​​legano l&#39;RNA e ai loro obiettivi di mRNA dal nostro gruppo, così come molti altri gruppi di ricerca. Anche se di natura sensibile e pratica, la corretta esecuzione di questa procedura produrrà l&#39;isolamento di questi complessi RNP, che fino a poco tempo fa, sono stati inaccessible per la scoperta e l&#39;analisi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 1 M ditiotreitolo </td><td> Pescatore </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> DNasi 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNasi libero </td></tr><tr><td> Etilendiammina Acid Tetraccetic </td><td> Pescatore </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Glicogeno </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7,0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Pescatore </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> Pescatore </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td><td> * Vedere di seguito </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lysis Buffer polisomi </td><td> * Vedere di seguito </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inibitori della proteasi cocktail compresse </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Proteina A Sepharose Beads </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasi K </td><td> Pescatore </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi Out inibitore della RNasi </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / pl </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> Pescatore </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio dodecil solfato </td><td> Pescatore </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> Pescatore </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Complessi ribonucleosidi Vanadil </td><td> New England Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Reagente Workup </td></tr><tr><td> Preparare i reagenti in RNasi / DNasi-free, trattata con DEPC vetro </td></tr><tr><td> Lisi buffer polisomi </td></tr><tr><td> 100 mM KCl </td></tr><tr><td> 5 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> HEPES 10 mM (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 0,5% NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 unità / ml RNasi Out </td></tr><tr><td> 400 pM VRC </td></tr><tr><td> Inibitore della proteasi tablet cocktail </td></tr><tr><td> 5 ml di tampone di lisi polisomi </td></tr><tr><td> Aggiungere 50 ml di 1 M HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 500 microlitri di 1 M KCl </td></tr><tr><td> 25 ml di 1 M MgCl 2 </td></tr><tr><td> 25 pl di NP40 </td></tr><tr><td> 4,7 ml DNasi RNasi-free H 2 O </td></tr><tr><td> 50 ml di 1 M DTT </td></tr><tr><td> 12,5 microlitri di 100 U / ml RNasi Out </td></tr><tr><td> 200 pl cocktail di inibitori delle proteasi (dissolto secondo costruttore) </td></tr><tr><td> 10 pl 200 mM VRC (al momento dell&#39;uso) </td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td></tr><tr><td> 1 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,05% NP40 </td></tr><tr><td> 1 L di tampone NT2 </td></tr><tr><td> 50 ml di Tris (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 30 ml di NaCl 5 M </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 NP40 pl </td></tr><tr><td> 820 ml DNasi RNasi-free H 2 O </td></tr></tbody></table>

metodo per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di mrna, microrna e componenti proteiche dei complessi ribonucleoproteina da estratti cellulari con rip-chip

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Come risultato dello sviluppo di alta sequenziamento e analisi microarray efficiente, globale analisi di espressione genica è diventata una forma semplice e facilmente disponibile di raccolta dati. In numerose ricerche e modelli di malattia tuttavia, i livelli allo stato stazionario di mRNA target gene non sempre direttamente correlata con i livelli stabili di proteine ​​di Stato. Regolazione post-trascrizionale del gene è una probabile spiegazione della divergenza tra i due. Spinto dal legame di RNA binding proteins (RBP), regolazione post-trascrizionale riguarda la localizzazione mRNA, la stabilità e la traduzione formando un Ribonucleoproteina (RNP) complesso con mRNA bersaglio. Identificare questi obiettivi sconosciuti de novo da mRNA estratti cellulari nel complesso RNP è fondamentale per la comprensione dei meccanismi e delle funzioni del RBP e la loro conseguente effetto sulla produzione di proteine. Questo protocollo descrive un metodo denominato RNP immunoprecipitazione-microarray (RIP-Chip), che consente l&#39;identificazione di smRNA SPECIFICHE associato nel complesso ribonucleoproteina, alle mutevoli condizioni sperimentali, insieme con la possibilità di ottimizzare ulteriormente un esperimento per il singolo ricercatore. Con questo importante strumento sperimentale, i ricercatori possono esplorare i complessi meccanismi connessi con regolazione post-trascrizionale del gene, nonché le interazioni ribonucleoproteina altri.

Un passo dal protocollo passo per isolare e identificare complessi RNA associati attraverso RIP-Chip.

Metodo per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

Grazie allo sviluppo del sequenziamento ad alta resa e dell'efficiente analisi tramite microarray, l'analisi dell'espressione genica globale è diventata un procedimento semplice e...

Lo scopo di questo video è dimostrare il metodo per l'isolamento e l'identificazione di componenti a RNA e proteici di complessi ribonucleoproteici da estratti cellulari mediante tecniche di immunoprecipitazione. Salve, mi chiamo Garrett Dom e sono uno studente laureato nel dipartimento di Microbiologia Molecolare e Immunologia presso l'Università del Missouri, dove studio sotto la supervisione del Dott. Eli Sso. Grazie ai progressi nel sequenziamento ad alto rendimento e nell'analisi efficiente di microarray, lo studio globale dell'espressione genica e la sua analisi sono diventati una forma semplice e facilmente accessibile di raccolta dati in molti modelli di ricerca e di malattia.Tuttavia, lo studio dei livelli di stato stazionario dell'mRNA del gene bersaglio non sempre si correla direttamente con i livelli stazionari delle proteine. Una probabile spiegazione della divergenza tra i due è la regolazione genica post-trascrizionale, guidata dalle interazioni delle proteine leganti l'RNA.La regolazione post-trascrizionale influisce sul localizzazione, stabilità e traduzione dell'mRNA formando un complesso ribonucleoproteico con gli mRNA bersaglio. Identificare questi sconosciuti bersagli mRNA De novo da estratti cellulari all'interno di questo complesso è fondamentale per comprendere i meccanismi e le funzioni della proteina legante l'RNA e il loro effetto risultante sull'output proteico. Questo protocollo descrive un metodo denominato ribo proteina, immunoprecipitazione immuno o RIP, che permette l'identificazione di specifici mRNA associati al complesso ribonucleoproteico.Prima di iniziare l'esperimento, è fondamentale disporre di tutti i reagenti, contenitori e utensili. Trattare le attrezzature in vetro libere da RNA con un inibitore di Rnasi, come RNA ZAP di ambion, seguito da risciacquo con acqua trattata al dpci, e assicurarsi che tutti i reagenti siano confermati privi di RNA. Il primo passo della procedura consiste nel raccogliere il complesso ribonucleoproteico dal lisato cellulare: raccogliere cellule tessutali in crescita esponenziale per produrre da due a cinque milligrammi di proteina totale per ogni campione utilizzato; in genere, due piastre da P uno 50 sono sufficienti.Qui stiamo raccogliendo le linee cellulari di carcinoma mammario umano MB 2 31 e MC sette e stiamo analizzando le interazioni ribonucleo della proteina legante l'RNA. È importante notare che, per ogni proteina legante l'RNA in esame, il numero totale di cellule e le quantità di proteina devono essere ottimizzati per massimizzare le interazioni appropriate tra l'mRNA bersaglio e la proteina legante l'RNA. Raccogliere le cellule in pellet mediante centrifugazione a 1000 giri/min per circa otto-dieci minuti a quattro gradi Celsius, quindi lavare tre volte con PBS freddo. Dopo l'ultimo lavaggio, agitare delicatamente il fondo del tubo e risospendere il pellet cellulare in volumi uguali di buffer di lisi polisomale preparato, contenente inibitori di RNasi e proteasi.Si consiglia di misurare con precisione il volume esatto del pellet cellulare, pipettare delicatamente la miscela per rompere gli aggregati cellulari e incubare il lisato sul ghiaccio per cinque minuti. Centrifugare a 13.000 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti; trasferire immediatamente il soprannatante chiarificato in provette microcentrifuga pre-raffreddate per RNA Free, mantenere sul ghiaccio e conservare a meno 80 gradi Celsius.Questo lisato può essere conservato fino a sei mesi a meno 80 gradi Celsius. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento poiché possono causare degradazione delle proteine e/o dell'mRNA. È preferibile eseguire l'IP immediatamente.Eseguire una rapida quantificazione della concentrazione di proteina e del lisato utilizzando il saggio proteico di Bradford standard. Successivamente, dovremo preparare i materiali per l'isolamento della nostra proteina specifica di interesse. Inizialmente prerigenerare la proteina.Ipernottare perline Sphero in tampone N NT due supplementato con BSA al 5% a quattro gradi Celsius. Utilizzare il tampone NT due in rapporto quattro a uno con le perline PAS. È possibile una conservazione a lungo termine fino a diversi mesi a quattro gradi Celsius.Quando si integra con il 0,1% di azida di sodio prima dell'uso, rimuovere l'eccesso di tampone NT due in modo che il rapporto finale tra perle e tampone sia uno a uno. Utilizzando provette microcentrifuga da 1,5 millilitri prive di RNA, prelevare 100 microlitri di sospensione SRO e aggiungere 30 microgrammi di anticorpo per ogni singola reazione di immunoprecipitazione. Ad esempio, nel nostro esperimento utilizziamo un anticorpo who are, che è un anticorpo IgG di topo uno.Pertanto, anche il nostro anticorpo di controllo è un IgG. Successivamente, aggiungere da 100 a 200 microlitri di tampone NT2 alla miscela di anticorpi e microsferette. Inoltre, un anticorpo con isotipo abbinato o siero normale intero della stessa specie deve essere utilizzato in parallelo come controllo anticorpale contro l'RNA di fondo.Aggiungere l'anticorpo appropriato alla miscela di perle e incubare per tutta la notte in rotazione su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius. Preparare le perle rivestite con anticorpo immediatamente prima dell'uso, lavandole con un millilitro di tampone NT2 freddo di ghiaccio per cinque volte; lavare le perle mediante centrifugazione a 13.000 ×g per uno o due minuti a quattro gradi. Rimuovere con attenzione il sopranatante con una pipetta manuale o un aspiratore.Questo lavaggio aiuta a rimuovere l'anticorpo non legato e i contaminanti di RNA dalla miscela di anticorpi. Una volta completato l'ultimo lavaggio, risospendere le perle in 700 microlitri di tampone T due freddo di ghiaccio, seguito dal trattamento con vari inibitori di RNA per proteggere gli mRNA bersaglio, inclusi 10 microlitri di RNAs, 10 microlitri di DTT 100 millimolare e 15 microlitri di EDTA. Portare il volume a 900 microlitri con tampone NT due.Successivamente, immunoprecipiteremo il complesso bersaglio. Raccomandiamo vivamente di utilizzare un passaggio di pre-pulizia per ridurre il segnale di fondo nell'analisi dell'RNA dopo la procedura di rip. Effettuare la pre-pulizia con 15 microgrammi di controllo di isotipo per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere 50 microlitri di perline PAS previamente gonfiate, non rivestite con anticorpo.Incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius con rotazione e successivamente centrifugare a 10.000 ×g a quattro gradi Celsius. Due pellet. Conservare il soprannatante per ip.Successivamente, aggiungere 100 microlitri di lisato isolato e chiarificato contenente circa due-cinque milligrammi di proteina alla miscela di anticorpi preparata. Diluire il lisato aiuterà a ridurre il fondo. Avvolgere il tubo con parafilm per garantire una chiusura ermetica e incubare a quattro gradi Celsius per quattro ore in rotazione lenta, quindi centrifugare il pellet successivo a 5.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e conservare il soprannatante per un'eventuale analisi mediante stoccaggio a meno 80 gradi Celsius come descritto in precedenza. Lavare le perle cinque volte con un millilitro di tampone T2 freddo di ghiaccio mediante centrifugazione.Quindi rimuovere il surnatante con una pipetta manuale o un aspiratore. Possono essere utilizzati metodi più rigorosi per ridurre il fondo, aggiungendo al buffer NT2 desossicolato di sodio, urea o SDS. Mantenere i campioni sul ghiaccio il più possibile e lavorare rapidamente per minimizzare la degradazione dell'mRNA bersaglio.Infine, utilizzeremo trattamenti con DNA e proteinasi K seguiti da precipitazione dell'RNA per isolare gli RNA dei ribonucleoproteine nucleari dopo aver lavato e risospeso le perle in 100 microlitri di buffer N NT due, integrato con cinque microlitri di DNAsi priva di RNAsi. Mantenere i campioni a 37 gradi Celsius per cinque-dieci minuti. Aggiungere un millilitro di buffer N NT due e centrifugare a 5.000 ×g per cinque minuti.Scartare il sopranatante e aggiungere al pellet di proteine SROs 100 microlitri di tampone NT2 con 5 microlitri di proteinasi K a 10 milligrammi per millilitro e 1 microlitro di SDS al 10%. Incubare la sospensione di perle per 30 minuti in un bagno d'acqua a 55 gradi Celsius, agitando delicatamente ogni 10 minuti. La proteinasi K favorirà il rilascio dei componenti ribonucleoproteici. Centrifugare per raccogliere le perle.Centrifugare a 5.000 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente, raccogliere il soprannatante, il cui volume dovrebbe essere di circa 100 microlitri. Successivamente, aggiungere due perle e 200 microlitri di tampone NT2, quindi centrifugare a 5.000 ×g per due minuti. Raccogliere circa 200 microlitri di soprannatante e scartare le perle.Combinare super natin e aggiungere 300 microlitri di fenolo acido del livello inferiore, quindi vortexare per un minuto a temperatura ambiente. Centrifugare alla velocità massima per un minuto a temperatura ambiente. Raccogliere 250 microlitri del livello superiore.Si abbia molta cura a non disturbare l'interfaccia, poiché ciò causerebbe contaminazione. Aggiungere al campione di RNA 25 microlitri di acetato di sodio a pH 5,2, 625 microlitri di etanolo al 100% refrigerato e cinque microlitri di glyco blue; mescolare bene e conservare tutta la notte a meno 20 gradi Celsius.In aggiunta, per garantire un corretto recupero dell'RNA. L'aggiunta di glico blu aumenterà la visibilità del pellet di RNA agendo da molecola vettore il giorno successivo, mescolare i tubi capovolgendoli da tre a cinque volte, quindi centrifugare a 12.000 ×g a quattro gradi Celsius per 30 minuti e scartare il soprannatante. Aggiungere un millilitro di etanolo al 70% freddo al pellet blu e mescolare per inversione o mediante vortex, quindi centrifugare.Campionare a 12.000 G a quattro gradi Celsius per due minuti. Eliminare il soprannatante e centrifugare a 12.000 G per un minuto a quattro gradi Celsius. Rimuovere con una pipetta qualsiasi residuo di etanolo al 70% e lasciare asciugare all'aria il pellet.Aggiungere a temperatura ambiente per cinque minuti. Ri-sospendere in 20-40 microlitri di acqua libera da RNA e DNA. Il campione è ora pronto per la quantificazione mediante spettrometria NanoDrop e ulteriori applicazioni a valle, come la PCR quantitativa in tempo reale o l'analisi con microarray, dopo che l'isolamento dell'RNA, il microarray e la PCR quantitativa in tempo reale sono stati eseguiti per rivelare i bersagli mRNA della proteina legante l'RNA who, e il loro conseguente arricchimento ottenuto dall'immunoprecipitazione.La conferma mediante blotting western rivela un isolamento pulito della proteina d'interesse. La PCR quantitativa dimostra l'arricchimento in termini di copie dell'mRNA bersaglio beta-actina rispetto ai controlli con IgG. Mentre l'analisi con microarray rivela profili genetici unici tra le linee cellulari di carcinoma mammario MC7 e MB231, l'immunoprecipitazione della ribonucleoproteina si è affermata come un eccellente strumento utilizzato dal nostro gruppo, così come da molti altri gruppi di ricerca, per isolare e studiare le interazioni tra le proteine leganti l'RNA e i loro bersagli mRNA. Sebbene questa procedura sia sensibile per natura ed esecuzione, una corretta esecuzione permetterà l'isolamento di questi complessi ribonucleoproteici, che fino a tempi recenti erano inaccessibili per la scoperta e l'analisi.

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