Name: Procedura per lAdaptive Laboratorio evoluzione dei microrganismi Utilizzando un chemostat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Impara l'evoluzione adattativa in laboratorio di microrganismi utilizzando un chemostat con E. coli. Questo metodo consente di studiare risposte allo stress e ingegneria metabolica attraverso selezione continua.

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Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dal Ministero coreano della Scienza, delle TIC e della Pianificazione Futura (programma Intelligent Synthetic Biology Center 2012M3A6A8054887). P. Kim è stato supportato da una borsa di studio dell'Università Cattolica della Corea (2015).

1. Preparazione dell&#39;apparecchiatura <ol><li> Ottenere un barattolo chemostat (150-250 ml) o una beuta (250 ml) contenente una luce di ingresso ed una luce di uscita. Collegare le porte con tubo in silicone che consente portate di 10-100 ml / h. Facoltativamente, utilizzare una presa d&#39;aria, una porta di uscita dell&#39;aria, e le porte di ingresso e uscita a temperatura controllata. </li><li> Ottenere un dispositivo adatto per il barattolo chemostat che prevede l&#39;agitazione e la temperatura di controllo (o utilizzare un incubatore agitazione rotante). </li><li> Ottenere due pompe peristaltiche per erogare mezzo fresco e raccogliere la cultura. </li><li> Ottenere un vaso serbatoio (10-20 L) contenente una porta di uscita media e una porta di ingresso dell&#39;aria. </li><li> Ottenere tubo in silicone adatto per il tasso di diluizione (ad esempio, ID 0,8 mm campo di portata 0,06-36 ml / min; L / S 13 tubi). </li></ol> 2. Preparazione medio e sterilizzazione <ol><li> Media iniziale <ol><li> Sciogliere 0,3 g di glucosio, 0,08 g NH 4Cl, 0,05 g di NaCl, 0,75 g di Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, e 0,3 g KH 2 PO 4 in 90 ml di acqua distillata (DW) in un vaso chemostato. </li><li> Sigillare il vaso chemostat insieme con il tubo con fascette. Non sigillare la presa d&#39;aria. </li><li> Sterilizzare il vaso chemostat in autoclave a 121 ° C per 15 min. Dopo la sterilizzazione, conservare il barattolo chemostat a temperatura ambiente. </li><li> Sciogliere 0,02 g MgSO 4 · 7H 2 O, 0,01 g CaCl 2, e 0,1 mg di tiamina in 10 ml DW (soluzione A). </li><li> soluzione Filter A utilizzando una siringa e un filtro a siringa pre-sterilizzato (un filtro da 0,45 micron pori). </li><li> Aggiungere la soluzione A filtra al barattolo chemostat. </li></ol></li><li> Lo stress medio <ol><li> Sciogliere 30 g di glucosio, 8 g di NH 4 Cl, 5 g di NaCl, 75 g di Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 30 g KH 2 PO 4, e 300 g di disodio succinato esaidrato (Na 2 · succinato · 6H &lt;sub&gt; 2 O; il fattore di stress utilizzato in questo esperimento) in 9,9 L DW in un barattolo serbatoio. </li><li> Sigillare il vaso serbatoio con il tubo con fascette. Non sigillare la presa d&#39;aria. </li><li> Sterilizzare il vaso serbatoio in autoclave a 121 ° C per 15 min. Dopo la sterilizzazione, conservare il vaso a temperatura ambiente. </li><li> Sciogliere 2 g MgSO 4 · 7H 2 O, 1 g CaCl 2, e 10 mg di tiamina in 100 ml DW (soluzione A). </li><li> Filtro soluzione A con una siringa e un filtro a siringa pre-sterilizzato (un filtro da 0,45 micron pori). </li><li> Aggiungere la soluzione A filtra al barattolo serbatoio. </li><li> Asetticamente collegare il tubo di silicone sterilizzato al barattolo serbatoio e collegare le pompe peristaltiche. </li></ol></li><li> -Stress elevato Media <ol><li> Preparare il mezzo come nella sezione 2.2, ma con una maggiore concentrazione di stress (cioè, 3-5 g / L elevato nell&#39;adattamento succinato). Nota: Questo protocollo è per l&#39;adattamento ad una sollecitazione thin possono essere consegnati attraverso il mezzo. Nel caso di stress fisici quali temperatura, agitazione, o l&#39;illuminazione, la coltivazione dovrebbe essere progettato di conseguenza. </li></ol></li></ol> 3. La coltivazione iniziale <ol><li> Inoculare una singola colonia di wild-tipo E. coli in una provetta da 15 ml contenente 4 ml di terreno iniziale. </li><li> Incubare la provetta in un incubatore agitazione per 12 ore a 37 ° C e 220 rpm. </li><li> Trasferire asetticamente 1 ml di precoltura al barattolo chemostat. </li><li> Incubare il vaso chemostat, prevedendo aerazione (aria 50 ml / min) e l&#39;agitazione (200 rpm), a 37 ° C per 6 ore. </li></ol> 4. Lo stress Adattamento <ol><li> Asetticamente collegare l&#39;estremità del tubo in silicone dalle pompe al vaso chemostat. </li><li> Avviare la pompa di scarico (10 ml / h o superiore) e raccogliere la cultura. Nota: La coltura deve essere in fase esponenziale, tipicamente 4-8 ore dopo la coltivazione iniziale. </li><li> Check la densità ottica (600 nm) della cultura dal tubo di uscita. </li><li> Avviare la pompa di aspirazione (10 ml / h, corrispondente ad un tasso di diluizione 0,1 hr -1). </li><li> Controllare la densità ottica della coltura a 600 nm dalla presa tubo ogni 24 ore. </li><li> Azionare il chemostat per 96 ore (fatturato 9,6 volte) o più. Se la densità ottica è stabile, scambiare il serbatoio contenente il mezzo high-stress. Se la densità ottica è inferiore a 0.2, fermare la pompa di aspirazione alimentazione per 6 ore. Riavviare la pompa di aspirazione e verificare che la densità ottica è di 0,2. </li><li> Gradualmente aumentare la concentrazione del fattore stressante cambiando ad un serbatoio contenente una concentrazione di stress elevato. </li><li> Prelevare campioni della cultura adattato ogni volta che raggiunge un traguardo (ad esempio, un ceppo atto a 100 g / L di stress succinato), e memorizzare per ulteriori analisi genomica. </li><li> Per la conservazione del campione, mescolare il campione di coltura (0,5 ml) con un sterilizzato 80% glicerolo solution (0,5 ml) e conservarlo a -80 ° C. Nota: Se il microrganismo acquisisce la capacità di degradare il fattore di stress durante la procedura ALE, la concentrazione di stress nella giara di fermentazione non è la stessa di quella nel serbatoio fresco. </li></ol> 5. Single-colonia isolamento del ceppo stress-adattato <ol><li> Preparare medio piastra di agar (1,6% agar) contenente lo stesso stress e alla stessa concentrazione del mezzo. </li><li> Piatto cultura uscita (0,1 ml) dalla chemostat, e incubare a 37 ° C per 16 ore. </li><li> Raccogliere singole colonie dalla piastra con uno stuzzicadenti sterile e inoculare in provette da 15 ml contenenti la stessa stress e alla stessa concentrazione media come nella chemostato e incubare per 6 ore. </li><li> Trasferire 1 ml di brodo di coltura in un pallone da 250 ml Erlenmeyer contenente 50 ml di terreno. Harvest 0,5 ml di brodo di coltura ogni 1 ora, e misurare la densità ottica a 600 nm. Confrontare il tasso di crescita del strai adattaton a quella del ceppo selvatico dato il fattore di stress. </li></ol>

<ol><li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476(2014).</li>
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<li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+oxidative+stress-tolerant+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum.</a> AMB Express. 4, 15(2014).</li>
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<li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li>
<li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+dynamics+during+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I microrganismi sono in grado di adattarsi a quasi tutti gli ambienti a causa del loro rapido tasso di crescita e la diversità genetica. Adaptive evoluzione di laboratorio permette di evolvere microrganismi in condizioni progettati, che fornisce un modo di selezionare gli organismi individuali harboring mutazioni spontanee che sono favorevoli nelle condizioni date. La tecnica chemostat è più robusto per realizzare evoluzione artificialmente guidato di tecniche di trasferimento per i seguenti...

I microrganismi possono sopravvivere e di adattarsi ad ambienti diversi. Sotto stress grave, l&#39;adattamento può avvenire attraverso l&#39;acquisizione di fenotipi benefici da mutazioni genomiche casuali e la successiva selezione positiva 1-3. Pertanto, le cellule microbiche in grado di adattarsi cambiando metabolica o reti di regolazione per una crescita ottimale, che viene definito &quot;l&#39;evoluzione adattativa&quot;. Recenti importanti tendenze microbici, come focolai di superbatteri e la comparsa di ceppi microbici resistenti, sono strettamente correlate a adattivo evoluzione in condizioni di stress. In condizioni di laboratorio definite, siamo in grado di studiare i meccanismi di evoluzione molecolare e anche controllare la direzione di evoluzione microbica per varie applicazioni. Diversamente organismi multicellulari, organismi unicellulari sono adatti all&#39;evoluzione laboratorio adattativa (ALE) per i seguenti motivi: si rigenerano rapidamente, mantengono grandi popolazioni, ed è facile per creare e mantenere homambienti ogeneous. In combinazione con i recenti progressi nelle tecniche di sequenziamento del DNA e le tecnologie high-throughput, ALE permette l&#39;osservazione diretta dei cambiamenti genomiche che portano a modifiche normative sistemici. dinamiche mutazionale e una diversità della popolazione sono anche osservabili. Strategie di ingegneria genetica può essere determinata dall&#39;analisi di ceppi ALE 4,5. Cultura chemostat è un metodo utilizzato per ottenere cellule allo stato stazionario e aumentare la produttività nei processi di fermentazione 6. terreno fresco viene aggiunto e brodo di coltura è raccolta durante il processo (quest&#39;ultimo include medio e biomasse). Cultura chemostat A lungo termine, però, cambia la produttività dello stato stazionario della cultura e provoca l&#39;accumulo di mutazioni spontanee e selezione durante la coltura (Figura 1a). Sotto varie pressioni selettive (fattori di stress), l&#39;accumulo di mutazioni è migliorata. Un graduale aumento dello stress in un lungo periodo<html> chemostat prevede una selezione continua di mutazioni che funzionano contro i fattori di stress indicati, quali temperatura, pH, pressione osmotica, nutrienti fame, ossidazione, prodotti tossici, ecc transfer Colony da un supporto solido e trasferimento seriale da un mezzo liquido (ripetuto cultura batch) permettono anche ai ricercatori di ottenere microrganismi evoluti (Figura 1B e 1C). Anche se la cultura chemostat richiede metodi complicati, la piscina della diversità (numero di repliche e dimensione della popolazione) è superiore a quello ottenuto con il trasferimento della colonia e le tecniche di trasferimento seriale. L&#39;esposizione di stress stabile alle singole celle e diminuito variazione di stato cellulare durante la coltura chemostat (stato stazionario) sono altri benefici di ALE rispetto alle tecniche di coltura a base di batch. ALE indotta da stress di Escherichia coli sottoposti a condizioni succinato alto è introdotto in questo articolo. iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Metodi di evoluzione adattativa di laboratorio (A) chemostat;. (B) trasferimento seriale; (C) trasferimento colonia. Le figure principali illustrare il concetto di metodi per ALE, e le figure in basso mostrano il numero di cellule che sono cresciuti durante ALE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Fermentatore mini-chemostat</td><td>Biotron Inc.</td><td>-</td><td>prodotto con</td></tr><tr><td>un tubo in silicone</td> su ordinazione speciale <td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 13</td><td>le dimensioni del tubo possono essere variate a seconda del tasso di diluizione e delle dimensioni del vaso del fermentatore.</td></tr><tr><td>vaso serbatoio</td><td>Bellco</td><td>Media bottiglia di conservazione</td><td>20 L</td></tr><tr><td>sostanze chimiche</td><td>Sigma-Aldrich-reagente</td><td></td> <td>grado</td></tr><tr><td>glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>reagente ACS</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>per la biologia molecolare, adatto per la coltura cellulare, &ge; 99,5%</td></tr> <tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>reagente ACS, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4272</td><td>98,5-101%</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td>reagente ACS, &ge; 99%</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>reagente ACS, &ge; 98%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td>reagente ACS, &ge; 96%</td></tr><tr><td>tiamina&middot; Grado di reagente HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td>, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2&middot; succinato&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>ReagentPlus, &ge; 99%</td></tr></tbody></table>

procedura per l&#39;adaptive laboratorio evoluzione dei microrganismi utilizzando un chemostat

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

L'evoluzione naturale coinvolge la diversità genetica come il cambiamento ambientale e una selezione tra piccole popolazioni. L'evoluzione di laboratorio adattiva (ALE) si riferisce alla situazione sperimentale in cui l'evoluzione viene osservata utilizzando organismi viventi in condizioni controllate e fattori di stress; Gli organismi sono quindi artificialmente costretti a fare cambiamenti evolutivi. I microrganismi sono soggetti a una varietà di fattori di stress nell'ambiente e sono in grado di regolare alcune proteine inducibili dallo stress per aumentare le loro possibilità di sopravvivenza. Le mutazioni spontanee presenti in natura provocano cambiamenti nel genoma di un microrganismo che influiscono sulle sue possibilità di sopravvivenza. L'esposizione a lungo termine alla coltura chemostataria provoca un accumulo di mutazioni spontanee e rende dominante il ceppo più adattabile. Rispetto ai metodi di trasferimento di colonie e di trasferimento seriale, la coltura di chemostat comporta il maggior numero di divisioni cellulari e, quindi, il maggior numero di popolazioni diverse. Sebbene la coltura chemostatica per l'ALE richieda dispositivi di coltura più complicati, è meno laboriosa una volta iniziata l'operazione. Le analisi comparative genomiche e del trascrittoma del ceppo adattato forniscono indizi evolutivi su come i fattori di stress contribuiscano alle mutazioni che superano lo stress. L'obiettivo del presente articolo è quello di accelerare l'evoluzione dei microrganismi in condizioni di laboratorio controllate.

Per l&#39;alta-succinato adattamento stress, la wild-type E. coli W3110 ceppo è stato coltivato in un chemostato a D = 0,1 hr -1 per 270 giorni (figura 2). <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> Figura 2: High-succinato sforzo di adattamento di E. coli W3110 con la cultura chemostat. frecce sottili indicano l&#39;ora in cui è stata aumentata la concentrazione di st...

Qui, vi presentiamo un protocollo per ottenere adattativa evoluzione laboratorio di microrganismi in condizioni che utilizzano la cultura chemostat. Inoltre, l&#39;analisi genomica del ceppo evoluto è discusso.

Procedura per l&#39;Adaptive Laboratorio evoluzione dei microrganismi Utilizzando un chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

L'obiettivo generale di questa procedura è consentire a un microorganismo di evolvere in condizioni di laboratorio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della microbiologia, come le relazioni con la funzione surrenale, le risposte allo stress, l'ingegneria metabolica e, naturalmente, l'evoluzione. Il vantaggio principale di questa tecnica è la selezione continua del discendente più adatto alle specifiche condizioni di laboratorio.Iniziare questa procedura preparando l'attrezzatura, nonché il mezzo iniziale, il mezzo di stress e il mezzo di alto stress, come descritto nel protocollo testuale. Inoculare una singola colonia o un ceppo selvatico di E.coli in un tubo da prova da 15 millilitri contenente quattro millilitri di mezzo iniziale. Incubare il tubo da prova in un incubatore agitato per 12 ore a 37 gradi celsius e 220 rpm.Incubare il barattolo del chemostato fornendo aerazione e agitazione a 37 gradi Celsius per sei ore. Al termine dell'incubazione, collegare in modo asettico l'estremità del tubo di silicone delle pompe al barattolo del chemostato. Trasferire asetticamente un millilitro di precoltura nel barattolo del chemostato.Avviare la pompa di uscita e raccogliere la coltura in fase esponenziale. Verificare la densità ottica a 600 nanometri della coltura prelevata dal tubo di uscita. Successivamente, avviare la pompa di ingresso.Verificare la densità ottica della coltura a 600 nanometri dal tubo di uscita ogni 24 ore. Dopo aver fatto funzionare il chemostato per 96 ore, pari a 9,6 volumi di ricambio completi, sostituire il serbatoio con il mezzo ad alta tensione alla concentrazione più bassa. Quando si sostituisce il serbatoio con un mezzo ad alta tensione più concentrato, le cellule potrebbero subire uno shock.Se la densità cellulare è troppo bassa, interrompere l'alimentazione con il mezzo ad alto stress per un certo periodo al fine di ripristinare la densità cellulare. Se la densità ottica è inferiore a 0,2, fermare la pompa di alimentazione in ingresso per sei ore. Riavviare la pompa in ingresso e verificare che la densità ottica sia superiore a 0,2.Aumentare gradualmente la concentrazione dello stressore modificando in modo incrementale il serbatoio con una concentrazione maggiore dello stressore. Prelevare campioni della coltura adattata ogni volta che raggiunge un traguardo di adattamento allo stressore e conservarli per ulteriori analisi genomiche. Per la conservazione dei campioni, mescolare 0,5 millilitri di campione di coltura con 0,5 millilitri di una soluzione sterilizzata di glicerolo all'80% e conservare a 80 gradi Celsius.Preparare un mezzo solido al 1,6% contenente lo stesso stressor alla stessa concentrazione presente nel mezzo. Piastrare 0,1 millilitri della coltura proveniente dall'outlet del chemostato e incubare a 37 gradi Celsius per 16 ore. Al termine dell'incubazione, selezionare singole colonie dalla piastra utilizzando un bastoncino sterile e inoculare ciascuna in provette da 15 millilitri contenenti lo stesso stressor e alla stessa concentrazione del mezzo utilizzato nel chemostato.Incubare per sei ore. Trasferire un millilitro del brodo di coltura in un matraccio erlenmeyer da 250 millilitri contenente 50 millilitri di mezzo. Raccogliere 0,5 millilitri del brodo di coltura ogni ora e misurare la densità ottica a 600 nanometri.Confrontare la velocità di crescita della ceppa adattata con quella della ceppa di tipo selvatico in presenza dell'agente di stress. La ceppa di E.coli di tipo selvatico è stata evoluta in condizioni di stress elevato da succinato per 270 giorni, pari a circa 930 generazioni. Ogni volta che è stato aggiunto uno stress maggiore da succinato, la concentrazione di biomassa è stata immediatamente ridotta e successivamente ripristinata.Qui è mostrato un diagramma schematico del chemostato con un mutante tollerante allo stress elevato di succinato. La maggior parte delle cellule di tipo selvatico viene lavata via in condizioni di stress e il mutante cresce maggiormente. Alla fine, la popolazione del discendente mutante aumenta.Le seconda e terza mutazione vengono selezionate continuamente e alla fine dominano il chemostato. Questa figura mostra che il ceppo adattato è cresciuto senza ritardi in condizioni di elevato stress da succinato, mentre il ceppo di tipo selvatico non lo ha fatto. Una strategia simile può essere applicata all'evoluzione adattativa in laboratorio utilizzando un chemostato con variazioni di agenti stressanti.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire ed evolvere il microorganismo in una condizione specifica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in un paio di mesi. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di non eliminare le cellule del chemostato aggiungendo troppo stress contemporaneamente e di ricordarsi di controllare la densità ottica ogni giorno.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire analisi del genoma e analisi del trascrittoma per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio quale mutazione contribuisce all'evoluzione della tolleranza allo stress?

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Genetics

Genetica

Fonte: Jian, X., et al., Coltivazione microbica automatizzata ed evoluzione adattiva utilizzando il sistema di coltura di microgoccioline microbiche (MMC). J. Vis. Exp. (2022).Questo video mostra l'uso di un sistema di coltura di microgoccioline microbiche per guidare l'evoluzione adattativa dei batteri verso la tolleranza al metanolo. Mescolando colture batteriche ingegnerizzate con un mezzo di stress ad alto contenuto di metanolo e segmentandole in microgoccioline, il sistema seleziona i...

Evoluzione adattiva dei batteri utilizzando un sistema di coltura microbica a microgocce

Fonte: Jeong, H., et al. Procedura per l'evoluzione adattiva in laboratorio dei microrganismi utilizzando un chemostato. J. Vis. Esp. (2016).Questo video dimostra l'isolamento selettivo e la crescita di batteri adattati allo stress provenienti da una coltura esposta a condizioni di stress prolungate. La coltura viene placcata su agar contenente stressore e viene selezionata una singola colonia per inoculare un mezzo liquido con lo stressore. L'assorbanza viene misurata a intervalli regolari per...

Isolamento dei batteri adattati allo stress tramite selezione di una singola colonia

Il tasso di crescita delle cellule è un processo regolato e un determinante fondamentale della fisiologia cellulare. Coltura continua utilizzando chemostati consente il controllo estrinseco di crescita cellulare mediante limitazione nutritiva facilitare lo studio delle reti molecolari che controllano la crescita cellulare e come tali reti evolvono per ottimizzare la crescita cellulare.

L&#39;uso di chemostati in Biologia microbica Sistemi

Abbiamo sviluppato e validato un piccolo ingombro serie di chemostati in miniatura costruito da prontamente parti disponibili per basso costo. Risultati evoluzione fisiologiche e sperimentali sono stati simili a chemostati volumi più grandi. La matrice Ministat fornisce una piattaforma compatta, poco costoso, e accessibile per gli esperimenti chemostato tradizionali, genomica funzionale, e le applicazioni di screening chimici.

Progettazione e utilizzo di matrici chemostato multiplexing

Descriviamo un morbidostat configurabile a basso costo che consente la caratterizzazione della resistenza ai farmaci antibiotici regolando dinamicamente la concentrazione del farmaco. Il dispositivo può essere integrato con una piattaforma microfluidica multiplexata. L'approccio può essere ampliato per studi di laboratorio sulla resistenza ai farmaci antibiotici.

Progettazione e l&#39;uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci

Il Framework eVOLVER consente una coltura microbica continua ad alta produttività con alta risoluzione e controllo dinamico sui parametri sperimentali. Questo protocollo illustra come applicare il sistema per condurre un esperimento di fitness complesso, guidando gli utenti a programmare il controllo automatizzato su molte culture individuali, misurando, raccogliendo e interagendo con i dati sperimentali in tempo reale.

Progettare esperimenti di crescita cellulare automatizzati, ad alta produttività e continui utilizzando eVOLVER

Questo protocollo descrive come utilizzare il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC) per condurre la coltivazione microbica automatizzata e l'evoluzione adattativa. MMC può coltivare e sub-coltivare microrganismi automaticamente e continuamente e monitorare online la loro crescita con una produttività relativamente elevata e una buona parallelizzazione, riducendo il consumo di manodopera e reagenti.

Coltivazione microbica automatizzata ed evoluzione adattiva utilizzando il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC)

Questo protocollo descrive come mantenere l'esperimento di evoluzione a lungo termine (LTEE) di Escherichia coli eseguendo i suoi trasferimenti giornalieri e congelamenti periodici e come condurre test di competizione per misurare i miglioramenti della forma fisica nei batteri evoluti. Queste procedure possono servire come modello per i ricercatori che iniziano i propri esperimenti di evoluzione microbica.

Trasferimenti giornalieri, archiviazione delle popolazioni e misurazione dell'idoneità nell'esperimento di evoluzione a lungo termine con Escherichia coli

Qui, presentiamo un protocollo di evoluzione sperimentale per l'adattamento nei termofili che utilizzano termomiscelatori da banco a basso costo ed efficienti dal punto di vista energetico come incubatori. La tecnica è dimostrata attraverso la caratterizzazione dell'adattamento alla temperatura in Sulfolobus acidocaldarius, un archeone con una temperatura di crescita ottimale di 75 °C.

Adattamento agli estremi della vita: evoluzione sperimentale con l'estremofilo Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

Presentiamo un protocollo per il dispositivo di coltura millifluidica continua (MCCD), che consente la coltivazione di popolazioni batteriche in condizioni costanti di bassi nutrienti (fino a centinaia di concentrazioni nanomolari) o fluttuazioni temporali dei nutrienti su una scala temporale di tempo.

Un dispositivo millifluidico in coltura continua per lo studio di Escherichia coli in condizioni nutritive basse e fluttuanti

Impara l'evoluzione adattativa in laboratorio di microrganismi utilizzando un chemostat con E. coli. Questo metodo consente di studiare risposte allo stress e ingegneria metabolica attraverso selezione continua.

Procedura per l'Adaptive Laboratorio evoluzione dei microrganismi Utilizzando un chemostat

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