Procedura per l'Adaptive Laboratorio evoluzione dei microrganismi Utilizzando un chemostat

L'obiettivo generale di questa procedura è consentire a un microorganismo di evolvere in condizioni di laboratorio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della microbiologia, come le relazioni con la funzione surrenale, le risposte allo stress, l'ingegneria metabolica e, naturalmente, l'evoluzione. Il vantaggio principale di questa tecnica è la selezione continua del discendente più adatto alle specifiche condizioni di laboratorio.

Iniziare questa procedura preparando l'attrezzatura, nonché il mezzo iniziale, il mezzo di stress e il mezzo di alto stress, come descritto nel protocollo testuale. Inoculare una singola colonia o un ceppo selvatico di E.coli in un tubo da prova da 15 millilitri contenente quattro millilitri di mezzo iniziale. Incubare il tubo da prova in un incubatore agitato per 12 ore a 37 gradi celsius e 220 rpm.

Incubare il barattolo del chemostato fornendo aerazione e agitazione a 37 gradi Celsius per sei ore. Al termine dell'incubazione, collegare in modo asettico l'estremità del tubo di silicone delle pompe al barattolo del chemostato. Trasferire asetticamente un millilitro di precoltura nel barattolo del chemostato.

Avviare la pompa di uscita e raccogliere la coltura in fase esponenziale. Verificare la densità ottica a 600 nanometri della coltura prelevata dal tubo di uscita. Successivamente, avviare la pompa di ingresso.

Verificare la densità ottica della coltura a 600 nanometri dal tubo di uscita ogni 24 ore. Dopo aver fatto funzionare il chemostato per 96 ore, pari a 9,6 volumi di ricambio completi, sostituire il serbatoio con il mezzo ad alta tensione alla concentrazione più bassa. Quando si sostituisce il serbatoio con un mezzo ad alta tensione più concentrato, le cellule potrebbero subire uno shock.

Se la densità cellulare è troppo bassa, interrompere l'alimentazione con il mezzo ad alto stress per un certo periodo al fine di ripristinare la densità cellulare. Se la densità ottica è inferiore a 0,2, fermare la pompa di alimentazione in ingresso per sei ore. Riavviare la pompa in ingresso e verificare che la densità ottica sia superiore a 0,2.

Aumentare gradualmente la concentrazione dello stressore modificando in modo incrementale il serbatoio con una concentrazione maggiore dello stressore. Prelevare campioni della coltura adattata ogni volta che raggiunge un traguardo di adattamento allo stressore e conservarli per ulteriori analisi genomiche. Per la conservazione dei campioni, mescolare 0,5 millilitri di campione di coltura con 0,5 millilitri di una soluzione sterilizzata di glicerolo all'80% e conservare a 80 gradi Celsius.

Preparare un mezzo solido al 1,6% contenente lo stesso stressor alla stessa concentrazione presente nel mezzo. Piastrare 0,1 millilitri della coltura proveniente dall'outlet del chemostato e incubare a 37 gradi Celsius per 16 ore. Al termine dell'incubazione, selezionare singole colonie dalla piastra utilizzando un bastoncino sterile e inoculare ciascuna in provette da 15 millilitri contenenti lo stesso stressor e alla stessa concentrazione del mezzo utilizzato nel chemostato.

Incubare per sei ore. Trasferire un millilitro del brodo di coltura in un matraccio erlenmeyer da 250 millilitri contenente 50 millilitri di mezzo. Raccogliere 0,5 millilitri del brodo di coltura ogni ora e misurare la densità ottica a 600 nanometri.

Confrontare la velocità di crescita della ceppa adattata con quella della ceppa di tipo selvatico in presenza dell'agente di stress. La ceppa di E.coli di tipo selvatico è stata evoluta in condizioni di stress elevato da succinato per 270 giorni, pari a circa 930 generazioni. Ogni volta che è stato aggiunto uno stress maggiore da succinato, la concentrazione di biomassa è stata immediatamente ridotta e successivamente ripristinata.

Qui è mostrato un diagramma schematico del chemostato con un mutante tollerante allo stress elevato di succinato. La maggior parte delle cellule di tipo selvatico viene lavata via in condizioni di stress e il mutante cresce maggiormente. Alla fine, la popolazione del discendente mutante aumenta.

Le seconda e terza mutazione vengono selezionate continuamente e alla fine dominano il chemostato. Questa figura mostra che il ceppo adattato è cresciuto senza ritardi in condizioni di elevato stress da succinato, mentre il ceppo di tipo selvatico non lo ha fatto. Una strategia simile può essere applicata all'evoluzione adattativa in laboratorio utilizzando un chemostato con variazioni di agenti stressanti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire ed evolvere il microorganismo in una condizione specifica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in un paio di mesi. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di non eliminare le cellule del chemostato aggiungendo troppo stress contemporaneamente e di ricordarsi di controllare la densità ottica ogni giorno.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire analisi del genoma e analisi del trascrittoma per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio quale mutazione contribuisce all'evoluzione della tolleranza allo stress?