Procedura per l'Adaptive Laboratorio evoluzione dei microrganismi Utilizzando un chemostat

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire a un microrganismo di evolversi in condizioni di laboratorio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia, come le relazioni tra la funzione surrenalica, le risposte allo stress, l'ingegneria metabolica e, naturalmente, l'evoluzione. Il vantaggio principale di questa tecnica è la selezione continua del discendente più persuaso in specifiche condizioni di laboratorio.

Iniziare questa procedura con la preparazione dell'attrezzatura, nonché del mezzo iniziale, del medio di stress e del medium di stress elevato, come descritto nel protocollo di testo. Inoculare una singola colonia o E.coli di tipo selvatico in una provetta da 15 millilitri contenente quattro millilitri di terreno iniziale. Incubare la provetta in un'incubatrice agitata per 12 ore a 37 gradi Celsius e 220 giri/min.

Incubare il barattolo di chemostat provvedendo all'aerazione e all'agitazione a 37 gradi centigradi per sei ore. Dopo l'incubazione, collegare asetticamente l'estremità del tubo di silicone dalle pompe al barattolo del chemostat. Trasferire asetticamente un millilitro di pre-coltura nel barattolo del chemostat.

Avviare la pompa di uscita e raccogliere la coltura nella fase esponenziale. Controllare la densità ottica a 600 nanometri della coltura dal tubo di uscita. Quindi, avviare la pompa di aspirazione.

Controllare la densità ottica della coltura a 600 nanometri dal tubo di uscita ogni 24 ore. Dopo aver fatto funzionare il chemostato per 96 ore, che è un fatturato completo di 9,6, sostituire il serbatoio alla concentrazione più bassa di mezzo ad alto stress. Quando si sostituisce il serbatoio con un mezzo di stress più elevato, le cellule possono essere scioccate.

Se la densità cellulare è troppo bassa, interrompere l'alimentazione con il mezzo di stress più elevato per un po' di tempo per ripristinare la densità cellulare. Se la densità ottica è inferiore a 0,2, arrestare la pompa di ingresso di alimentazione per sei ore. Riavviare la pompa di aspirazione e verificare che la densità ottica sia superiore a 0,2.

Aumentare gradualmente la concentrazione del fattore di stress passando in modo incrementale a un serbatoio contenente una concentrazione di fattore di stress più elevata. Prelevare campioni della coltura adattata ogni volta che raggiunge una fase di adattamento a fattori di stress e conservarli per ulteriori analisi genomiche. Per la conservazione del campione, mescolare il campione di coltura da 0,5 millilitri con 0,5 millilitri di una soluzione sterilizzata di glicerolo all'80% e conservarlo a 80 gradi Celsius.

Preparare un terreno su piastra all'1,6% contenente lo stesso fattore di stress alla stessa concentrazione del mezzo. Piastra 0,1 millilitri della coltura di sbocco dal chemostatico e incuba a 37 gradi Celsius per 16 ore. Dopo l'incubazione, prelevare singole colonie dalla piastra utilizzando uno stuzzicadenti sterile e inocularle in provette da 15 millilitri contenenti lo stesso fattore di stress e alla stessa concentrazione media del chemiostato.

Incubare per sei ore. Trasferire un millilitro di brodo di coltura in un pallone da 250 millilitri contenente 50 millilitri di terreno. Raccogli 0,5 millilitri di brodo di coltura ogni ora e misura la densità ottica a 600 nanometri.

Confrontare il tasso di crescita del ceppo adattato con quello del ceppo wild type dato il fattore di stress. Il ceppo selvatico di E.coli si è evoluto in una condizione di stress ad alto succinato per 270 giorni, che corrisponde a quasi 930 generazioni. Ogni volta che veniva aggiunto uno stress succinato più elevato, la concentrazione di biomassa veniva immediatamente abbassata e quindi ripristinata.

Qui è mostrato un diagramma schematico del chemostato con un mutante che è tollerante contro l'elevato stress succinato. La maggior parte delle cellule di tipo selvatico vengono lavate via in condizioni di stress e il mutante cresce di più. Alla fine, la popolazione del discendente mutante aumenta.

La seconda e la terza mutazione vengono continuamente selezionate e alla fine dominano il chemiostato. Questa cifra mostra che il ceppo adattato è cresciuto senza indugio in condizioni di stress ad alto contenuto di succinato, mentre il ceppo wild type non lo ha fatto. Una strategia simile può essere applicata all'evoluzione di laboratorio adattiva utilizzando un chemostato con una variazione di fattori di stress.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire ed evolvere il microrganismo in una condizione specifica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un paio di mesi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non lavare via le cellule chemostatico aggiungendo troppo stress in una volta sola e ricordarsi di controllare la densità ottica ogni giorno.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi come l'analisi del genoma e l'analisi del trascrittoma per rispondere a ulteriori domande come quale mutazione contribuisce all'evoluzione tollerante allo stress?