Patterning microfluidico e tracciamento basato sulla fluorescenza della crescita batterica di singole cellule

Inizia con una coltura batterica marcata in fluorescenza aggiunta a un tampone privo di carbonio.

Centrifugare per pellettare i batteri e scartare il surnatante.

Risospendere il pellet in un tampone fresco privo di carbonio contenente un detergente delicato.

La mancanza di una fonte di carbonio arresta la crescita, mentre il detersivo previene la formazione di grumi e mantiene le cellule sospese.

Caricare la sospensione batterica in una siringa e collegarla a una pompa.

Iniettare la sospensione nell'ingresso di un chip microfluidico contenente un canale con trappole incorporate nel pavimento.

Estrarre lentamente il liquido dall'uscita del canale.

Quando il liquido si ritira, le forze capillari guidano i batteri verso l'uscita.

In questo processo, singole cellule batteriche si depositano nelle trappole, dando luogo alla formazione di pattern batterici.

Sciacquare continuamente il canale con un brodo preriscaldato e ricco di sostanze nutritive.

I batteri riprendono la crescita e formano microcolonie all'interno delle trappole.

Utilizza la microscopia a fluorescenza per acquisire immagini time-lapse e analizzare la crescita batterica in un ambiente controllato.

Pipettare un millilitro di terreno MOPS in una fiala da centrifuga e aggiungere 10 microlitri di fosfato di potassio 0,132 molari.

Aliquotare 100 microlitri della coltura notturna nella fiala della centrifuga e centrifugare la coltura a 2.300 volte g per due minuti. Scartare delicatamente il surnatante per risospendere il pellet in un millilitro di terreno MOPS fresco con lo 0,015% di Tween 20 e lo 0,01% di fosfato di potassio e caricare la sospensione batterica in una siringa da un millilitro. Per fissare la siringa e il collegamento del tubo, inserire direttamente un ago nel tubo.

Ora monta la siringa sulla pompa a siringa e inietta la sospensione nel chip microfluidico attraverso l'ingresso situato nella parte a monte del canale fino a quando la sospensione copre la regione del modello con trappole. Impostare la pompa a siringa a una portata compresa tra 0,07 e 0,2 microlitri al minuto per prelevare la sospensione batterica e monitorare il processo di patterning tramite il software del microscopio. Una volta che il modello è stato modellato con le cellule, aumentare la portata di prelievo per svuotare rapidamente il canale microfluidico e lavarlo con LB fresco precedentemente degassato per almeno 30 minuti e preriscaldato a 30 gradi Celsius.

Ora imposta la pompa a siringa a una portata di due microlitri al minuto per lavare delicatamente il canale. Una volta riempito il canale, aumentare nuovamente la portata. Acquisisci immagini di batteri in crescita all'ingrandimento e all'intervallo di tempo desiderati.