Viabilità imaging cellulare su scaffold non trasparenti - con l'esempio di un romanzo a maglia Titanium Implant

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di visualizzare la microstruttura e l'adesione cellulare su un impianto di nucleo in titanio lavorato a maglia non trasparente, utilizzando tecniche di imaging fluorescente. Questo metodo fa progredire l'analisi dell'ingegneria tissutale con scaffold non trasparenti. Un vantaggio di questa tecnica è che si può tracciare la vitalità cellulare e la proliferazione sullo scaffold con una coltura definita a pedale.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la colorazione fluorescente e, successivamente, la visualizzazione sono impegnative. Le proprietà individuali dell'impalcatura, come la dimensione dei pori, possono influenzare la tempistica e/o la fluorescenza dell'impalcatura può influenzare la scelta dei fluorofori che si stanno utilizzando. Metti fino a cinque impalcature spesse sei o sette millimetri in un tubo da 50 millilitri e lavale con acqua tre volte per 20 minuti per lavaggio.

Fallo a temperatura ambiente con una leggera agitazione. Successivamente, lavare gli scaffold in 30 millilitri di soluzione Triton X-100 all'1% nelle stesse condizioni. Quindi, eseguire altri due lavaggi con acqua.

Ora, sonicare in sequenza gli scaffold in reagenti di grado 99% acetone, 99% isopropanolo ed etanolo 99%. Eseguire ogni fase di sonicazione due volte per cinque minuti per sonicazione. Quindi, sonicare l'impalcatura altre tre volte in acqua per un totale di 15 minuti.

Termina posizionando gli scaffold su un fazzoletto privo di lanugine e asciugandoli all'aria per una notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, autoclavare gli scaffold per 15 minuti a 121 gradi Celsius e 15 PSI. Per confermare che la pulizia ha funzionato, utilizzare la fluorescenza indiretta.

Caricare un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con 2000 microlitri della soluzione colorante zolfo-rodamina B appena preparata e, utilizzando una pinza, trasferire un'impalcatura in quel pozzetto. Quindi, acquisisci immagini negative dell'impalcatura utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un set di filtri a cubo LED RFP e cerca le impurità ad alto ingrandimento. Utilizzando la cabina di biosicurezza, trasferire gli scaffold puliti nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.

Aggiungi 500 microlitri di terreno di coltura a 37 gradi Celsius a ciascun pozzetto e lascia in ammollo l'impalcatura per 15 minuti. Nel frattempo, preparare 500.000 cellule SEP1 infette da Ad-GFP per 1 millilitro di terreno. Dopo 15 minuti, aspirare completamente il terreno dagli scaffold e posizionarli con 100 microlitri di sospensione cellulare.

Quindi, incubarli per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la breve incubazione, aggiungere altri 500 microlitri di terreno di coltura e incubare gli scaffold per 24 ore. Il giorno successivo, cambiare il terreno di coltura per rimuovere le cellule non aderenti.

Quindi, valutare l'aderenza e la diffusione delle cellule sugli scaffold, utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un set di filtri a cubo LED GFP. Per una colorazione vivo-morto, prima piastrate le cellule SEP1 sull'impalcatura come prima. Dopo 24-48 ore, aspirare completamente il terreno di coltura e lavare gli scaffold con DPBS per cinque minuti a temperatura ambiente.

Ora, colorare le cellule utilizzando un terreno di coltura contenente Calceina AM, Hoechst 33342 e omodimero di etidio. Questi tre fluorofori sono tutti sensibili alla luce, quindi è fondamentale mantenere le cellule al buio in avanti. Incubare le cellule per 30 minuti con i fluorofori per ottenere una distribuzione uniforme in tutta l'impalcatura.

Le caratteristiche specifiche dell'impalcatura influenzeranno questo tempo di incubazione. Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con DPBS utilizzando un millilitro per pozzetto. Eseguire ogni lavaggio per cinque minuti a temperatura ambiente.

Subito dopo i lavaggi, documentare gli scaffold utilizzando la microscopia a fluorescenza. Per misurare la vitalità cellulare nel tempo, utilizzare le misure di conversione della resazurina. Innanzitutto, aspirare completamente il terreno di coltura dalle cellule SEP1 posizionate in una piastra da 24 pozzetti e lavare le cellule con 500 microlitri di DPBS per pozzetto.

Quindi, coprire le cellule con il volume richiesto di soluzione di lavoro sterile di resazurina e includere un pozzetto con solo resazurina. Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per circa 30 minuti. Dopo l'incubazione, trasferire 100 microlitri di surnatante condizionato da ciascun pozzetto in una piastra da 96 micropozzetti per misurarne la fluorescenza come descritto nel protocollo di testo.

Per un'ulteriore coltivazione, rimuovere la resazurina dal pozzo e lavare tre volte con un millilitro di DPBS. Eseguire ogni lavaggio per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo il terzo lavaggio, aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto di cellule e continuare la loro incubazione per ulteriori misurazioni nel tempo.

Utilizzando la colorazione fluorescente indiretta, sono state documentate le impurità pre-pulizia per ottimizzare il protocollo di pulizia. Una significativa riduzione del carico di sostanze sull'impalcatura mostra l'efficienza del protocollo di pulizia descritto. Gli impianti successivi utilizzati per il trattamento dell'artroplastica sono determinati dagli eventi che si verificano all'interfaccia del materiale cellulare.

Dopo 24 ore di aderenza con gli scaffold, le cellule SEP1 si erano attaccate. I fluorofori sono stati quindi applicati per esaminare la morte cellulare e la proliferazione per un periodo di tempo sugli scaffold. La colorazione vivo-morto ha mostrato una colorazione nucleare blu con fluorescenza rossa nelle cellule morte e fluorescenza verde nelle cellule vitali.

Inoltre, la vitalità cellulare sullo scaffold è stata quantificata utilizzando il saggio di conversione della resazurina. Nell'arco di due settimane, sono stati raccolti dati su cellule coltivate con o senza scaffold. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di regolare i fluorofori che si stanno utilizzando in base all'impalcatura e al microscopio che si hanno a disposizione.

Seguendo questa procedura, possono essere applicati altri metodi, come la colorazione immunofluorescente, per visualizzare la presenza di proteine o l'attivazione di cascate di segnalazione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia dell'artroplastica perché l'interazione della faccia cellulare con il tessuto circostante in vivo ne definirà la funzione e la durata.