Viabilità imaging cellulare su scaffold non trasparenti - con l'esempio di un romanzo a maglia Titanium Implant
7 settembre 2016
Qui presentiamo una tecnica di imaging fluoroforo base per rilevare la vitalità cellulare su uno scaffold di titanio non trasparente nonché per rilevare intravedere le impurità dell'impalcatura. Questo protocollo risolve i l'inconveniente di immaginare interazioni cellula-cellula o cellula-metallo su impalcature non trasparenti.
L'obiettivo generale di questo esperimento è visualizzare la microstruttura e l'adesione cellulare su un impianto nucleare in titanio non trasparente a maglia, utilizzando tecniche di imaging fluorescente. Questo metodo migliora l'analisi dell'ingegneria tissutale con impalcature non trasparenti. Un vantaggio di questa tecnica è la possibilità di tracciare la vitalità cellulare e la proliferazione sull'impalcatura mediante coltura definita ped-air.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la colorazione fluorescente e, successivamente, la visualizzazione risultano complesse. Proprietà individuali del supporto, come la dimensione dei pori, possono influenzare i tempi e/o la fluorescenza del supporto può influire sulla scelta dei fluorocromi da utilizzare. Posizionare fino a cinque supporti dello spessore di sei o sette millimetri in un tubo da 50 millilitri e lavarli con acqua tre volte, per 20 minuti ogni lavaggio.
Eseguire a temperatura ambiente con agitazione delicata. Successivamente, lavare gli scaffold con 30 millilitri di soluzione al 1% di Triton X-100 nelle stesse condizioni. Quindi, effettuare altri due lavaggi con acqua.
Ora, sottoporre in sequenza gli scaffold a sonificazione in acetone al 99% di grado reagente, isopropanolo al 99% e etanolo al 99%. Eseguire ogni passaggio di sonificazione due volte per cinque minuti per ogni sonificazione. Successivamente, sottoporre lo scaffold a ulteriore sonificazione per altre tre volte in acqua per un totale di 15 minuti.
Terminare posizionando gli scaffold su un tessuto senza lanugine ed essiccarli all'aria tutta la notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, sterilizzare gli scaffold in autoclave per 15 minuti a 121 gradi Celsius e 15 PSI. Per verificare che la pulizia sia stata efficace, utilizzare la fluorescenza indiretta.
Caricare un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con 2000 microlitri della soluzione di colorazione appena preparata di zolfo-Rodamina B e, utilizzando pinzette, trasferire un impalcatura in quel pozzetto. Successivamente, acquisire immagini negative dell'impalcatura utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un set di filtri a cubo LED per RFP e cercare impurità ad alta ingrandimento. Utilizzando il cabinet di sicurezza biologica numero uno, trasferire le impalcature pulite nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
Aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura a 37 gradi Celsius in ogni pozzetto e lasciare in ammollo la matrice per 15 minuti. Nel frattempo, preparare 500.000 cellule SEP1 infettate con Ad-GFP per 1 millilitro di mezzo. Dopo 15 minuti, aspirare completamente il mezzo dalle matrici e seminare 100 microlitri della sospensione cellulare.
Quindi, incubarli per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione breve, aggiungere altri 500 microlitri di mezzo di coltura e incubare le impalcature per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire il mezzo di coltura per rimuovere le cellule non aderenti.
Quindi, valutare l'adesione e la diffusione delle cellule sui scaffold, utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un set di filtri LED per GFP. Per una colorazione vitale, piastrare innanzitutto le cellule SEP1 sullo scaffold come in precedenza. Dopo 24-48 ore, aspirare completamente il mezzo di coltura e lavare gli scaffold con DPBS per cinque minuti a temperatura ambiente.
Ora, colorare le cellule utilizzando il mezzo di coltura contenente Calcein AM, Hoechst 33342 ed etidio omodimero. Questi tre fluorocromi sono tutti sensibili alla luce, quindi è fondamentale mantenere le cellule al buio da questo momento in poi. Incubare le cellule per 30 minuti con i fluorocromi per ottenere una distribuzione uniforme all'interno dell'impalcatura.
Caratteristiche specifiche del supporto influenzeranno il tempo di incubazione. Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con DPBS utilizzando un millilitro per pozzetto. Eseguire ogni lavaggio per cinque minuti a temperatura ambiente.
Immediatamente dopo i lavaggi, documentare gli scaffold mediante microscopia a fluorescenza. Per misurare la vitalità cellulare nel tempo, utilizzare misurazioni della conversione del resazurina. In primo luogo, aspirare completamente il mezzo di coltura dalle cellule SEP1 posizionate in una piastra a 24 pozzetti e lavare le cellule con 500 microlitri di DPBS per pozzetto.
Quindi, coprire le cellule con il volume richiesto di soluzione lavorativa sterile di resazurina ed includere una pozzetta contenente solo resazurina. Successivamente, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per circa 30 minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire 100 microlitri del sopranatante condizionato da ogni pozzetta in una piastra a 96 pozzetti per misurare la sua fluorescenza come descritto nel protocollo testuale.
Per ulteriori colture, rimuovere il resazurina dal pozzetto e lavare tre volte con un millilitro di DPBS. Eseguire ogni lavaggio per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo il terzo lavaggio, aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura in ogni pozzetto contenente cellule e proseguire l'incubazione per ulteriori misurazioni nel corso del tempo.
Utilizzando una colorazione fluorescente indiretta, le impurità presenti prima della pulizia sono state documentate al fine di ottimizzare il protocollo di pulizia. La significativa riduzione del carico di sostanze sullo scaffold dimostra l'efficacia del protocollo di pulizia descritto. Gli impianti successivi utilizzati per il trattamento di artroplastica sono determinati da eventi che si verificano all'interfaccia tra cellula e materiale.
Dopo 24 ore di adesione con gli scaffold, le cellule SEP1 si erano attaccate. I fluorocromi sono stati quindi applicati per esaminare la morte cellulare e la proliferazione nel tempo sugli scaffold. La colorazione vitale ha mostrato una colorazione nucleare blu con fluorescenza rossa nelle cellule morte e fluorescenza verde nelle cellule vitali.
Inoltre, la vitalità cellulare sullo scaffold è stata quantificata utilizzando il saggio di conversione del resazurina. Nel corso di due settimane, sono stati raccolti dati su cellule coltivate con o senza scaffold. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di regolare i fluorocromi utilizzati in base allo scaffold e al microscopio disponibili.
Al termine di questa procedura, possono essere applicati altri metodi, come la colorazione immunofluorescente, al fine di visualizzare la presenza di proteine o l'attivazione di cascate di segnali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dell'artroplastica, poiché l'interazione della superficie cellulare con il tessuto circostante in vivo ne determinerà la funzione e la durata.
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Panoramica
Questo studio presenta una tecnica di imaging fluorescente per visualizzare l'adesione cellulare e la vitalità su un'impalcatura di titanio non trasparente. Il metodo affronta le sfide legate all'imaging delle interazioni cellulari con materiali non trasparenti, migliorando l'analisi nell'ingegneria tissutale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Ingegneria dei tessuti
Sfondo
- Le impalcature non trasparenti pongono sfide per l'acquisizione di immagini delle interazioni cellulari.
- L'acquisizione di immagini fluorescenti può fornire informazioni sulla vitalità e sulla proliferazione cellulare.
- Le proprietà dell'impalcatura, come la dimensione dei pori, possono influenzare i risultati dell'acquisizione di immagini.
- Una dimostrazione visiva è essenziale a causa della complessità della colorazione fluorescente.
Scopo dello studio
- Visualizzare la microstruttura e l'adesione cellulare sugli impianti in titanio.
- Migliorare i metodi di analisi per scaffold non trasparenti.
- Risolvere i problemi di imaging associati a questi materiali.
Metodi Utilizzati
- Tecniche di imaging fluorescente per la valutazione della vitalità cellulare.
- Preparazione di scaffold in titanio per l'imaging.
- Protocolli di lavaggio per garantire chiarezza nei risultati dell'imaging.
- Valutazione delle proprietà dello scaffold che influenzano la scelta del fluorocromo.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita dell'adesione cellulare su scaffold in titanio.
- Dimostrata capacità di tracciare la vitalità e la proliferazione cellulare.
- Individuato l'impatto delle proprietà dello scaffold sull'imaging.
- Fornito un protocollo affidabile per studi futuri.
Conclusioni
- La tecnica migliora la comprensione delle interazioni tra cellule e materiali.
- Offre una soluzione alle difficoltà di imaging associate a scaffold non trasparenti.
- Applicazioni future potrebbero migliorare i risultati nell'ingegneria tissutale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione dell'viabilità cellulare su scaffold non trasparenti, come impianti in titanio tricotati, affronta un collo di bottiglia critico nella ricerca e sviluppo di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa. Questa capacità consente una valutazione diretta delle interazioni tra cellule e materiale, supportando la previsione dell'idoneità biologica dello scaffold e della sua integrazione funzionale. Il metodo è strategicamente posizionato per guidare la fase iniziale della scoperta, la validazione degli obiettivi e l'avanzamento mirato alla riduzione dei rischi di nuovi materiali impiantabili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette la visualizzazione diretta dell'adesione cellulare e della vitalità su biomateriali opachi, chiarificando i meccanismi all'interfaccia cellula-materiale.
- Supporta la validazione funzionale del bersaglio quantificando la proliferazione e la sopravvivenza cellulare su impalcature candidate.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico di nuovi materiali per impianti prima di studi in vivo.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un protocollo standardizzato per la preparazione e l'analisi di scaffold non trasparenti in vitro.
- Fornisce risultati quantitativi riproducibili sulla vitalità e proliferazione cellulare mediante saggi basati sulla fluorescenza.
- Consente un confronto affidabile tra protocolli di pulizia degli scaffold e modifiche della superficie ai fini dello screening successivo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati di biocompatibilità in vitro ai requisiti translazionali per dispositivi impiantabili.
- Supporta la continuità dalla valutazione dello scaffold nella fase di scoperta alla selezione dei modelli preclinici.
- Riduce il rischio biologico consentendo un rilevamento precoce di interazioni avverse tra cellule e materiale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di imaging si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica per i biomateriali impiantabili, collegando la verifica delle ipotesi iniziali alla validazione traslazionale.
- Biologia della scoperta: Quantifica l'adesione, la vitalità e la proliferazione cellulare su impalcature candidate per guidare la selezione dei materiali.
- Screening: Standardizza i saggi di vitalità e proliferazione per materiali non trasparenti, favorendo riproducibilità e scalabilità.
- Analisi: Fornisce letture quantitative basate sulla fluorescenza per confronti tra diverse condizioni e nel corso del tempo.
- Ricerca traslazionale: Allinea i dati in vitro sulle interazioni cellula-materiale con i requisiti preclinici per gli impianti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro riutilizzabile per la valutazione di svariate piattaforme di impalcature non trasparenti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella biocompatibilità e nell'integrazione funzionale dello scaffold.
- Valore operativo: Fornisce protocolli standardizzati e riproducibili per l'imaging e la quantificazione di materiali opachi.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di avanzamento o interruzione per nuovi candidati impiantabili, riducendo il rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione degli scaffold tecnologici da avanzare, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza e tecniche di coltura cellulare.
- Necessita l'accesso a fluorofori appropriati e a strumentazione per imaging compatibile con le proprietà del supporto.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo le procedure di pulizia e colorazione, al fine di garantire riproducibilità.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse geometrie del supporto, dimensioni dei pori o composizioni del materiale.
- La scelta del fluoroforo e dei parametri di imaging devono essere ottimizzati per ogni tipo di supporto al fine di evitare interferenze nel segnale.
