Microfabbricazione di ottiche impiantabili integrate in una finestra di imaging microstrutturato per l'imaging avanzato in vivo

Potenzieremo lo studio dei processi biologici negli animali viventi attraverso la visualizzazione in tempo reale, impiantando un chip miniaturizzato, prodotto mediante stampa laser 3D di un materiale biocompatibile.

La sfida principale è la messa a punto dei parametri di fabbricazione, come la potenza e la velocità, considerando le diverse condizioni di scrittura, mentre la microstruttura in entrambe le superfici dello stesso sottoinsieme con precisione e coerenza. Il risultato accurato è la creazione di un protocollo versatile per la fabbricazione di uno strumento di imaging ottico innovativo e impiantabile, che accoppia direttamente micro lenti di grandi dimensioni alla regione target della microstruttura 3D per varie applicazioni biologiche.

Ora che il protocollo di fabbricazione è stato ottimizzato, stiamo lavorando all'impianto e alla dimostrazione delle capacità di imaging del chip. Ad esempio, per i test in vivo sui miomateriali.

[Istruttore di intelligenza artificiale] Per iniziare, accendi la sorgente laser a infrarossi vicini a femtosecondi. Allineare il percorso ottico del raggio laser fino a raggiungere l'obiettivo del microscopio attraverso una serie di ottiche e specchi montati su supporti per specchi cinematici. Ruota iterativamente gli specchi per centrare il raggio all'interno dell'allineamento nel vicino infrarosso. I fori stenopeici dirigono il raggio laser perpendicolarmente al portacampioni allineandolo utilizzando il centraggio della riflessione posteriore. Per montare il campione sul portacampioni, utilizzare del nastro adesivo per fissare il vetrino di copertura a doppia caduta sul supporto del campione con la seconda goccia depositata rivolta verso il basso. Quindi montare il portacampione sui tavolini di traslazione, montare manualmente il portacampioni, quindi montare l'obiettivo del microscopio a lunga distanza di lavoro sul supporto dedicato alla fine del percorso ottico, vicino al campione, e centrare il campione con l'obiettivo. Impostare la potenza del laser sul valore minimo, circa cinque milliwatt, sufficiente per visualizzare la riflessione del raggio sul software della telecamera CCD. Focalizzare il raggio laser sulla superficie superiore della prima goccia di resist. Seguire il profilo curvo della goccia per individuare i bordi del campione lungo le direzioni x e y. Impostare il centro della goccia come riferimento per lo zero assoluto utilizzando il software. Focalizzare il raggio laser sull'interfaccia tra la superficie superiore del vetrino coprioggetto e la base della prima goccia di fotoresist al centro del campione. Impostarlo come riferimento zero sull'asse z. Spostarsi sulla posizione del bordo nella direzione negativa dell'asse x per circa 3,5 millimetri per un vetrino coprioggetto da 12 millimetri e concentrarsi sulla stessa interfaccia. Impostarlo come riferimento per lo zero assoluto lungo la direzione z. Ripetere la stessa operazione per la direzione positiva dell'asse x per circa 3,5 millimetri e concentrarsi sulla stessa interfaccia. Quindi inclinare il campione per correggere le deviazioni nella direzione z tra gli assi x negativo e positivo. Eseguire la stessa procedura illustrata in precedenza lungo l'asse x per l'asse y. Una volta bilanciato su entrambi gli assi x e y, torna in posizione centrale e concentrati sull'interfaccia tra il vetro e il resist. Impostare il nuovo valore z della messa a fuoco come riferimento zero sull'asse z. Accendere il sistema di illuminazione a LED rossi per il monitoraggio in tempo reale del processo di polimerizzazione. Con il laser spento, spostare l'obiettivo lungo la direzione z sotto il vetrino coprioggetto per individuare la seconda interfaccia tra la superficie inferiore del vetro e la base della goccia inferiore di resist. Aumentare la potenza del laser a 100 milliwatt per avviare la polimerizzazione a due fotoni. Regolare la posizione focale aumentando z fino a polimerizzare una semplice struttura di riferimento. Impostare questa posizione focale iniziale come riferimento zero lungo l'asse z. Impostare le potenze di polimerizzazione tra 100 e 200 milliwatt ed eseguire il codice macchina come un programma di controllo numerico computerizzato per le fasi di traslazione per fabbricare la struttura tridimensionale desiderata. Quindi, spostati lungo l'asse z per tornare alla prima interfaccia tra la superficie superiore del vetro e la goccia superiore del fotoresist. Polimerizzare una semplice struttura di riferimento per individuare l'interfaccia. Impostare la prima linea di polimerizzazione come riferimento zero lungo l'asse z. Regolare la potenza di polimerizzazione tra 15 e 20 milliwatt ed eseguire il programma guidando i movimenti della fase di traslazione. Con il laser spento, disabilitare gli assi di traslazione x, y e z e rimuovere il portacampione dalla configurazione di fabbricazione sperimentale. Guarire il nastro adesivo e staccare il campione dal supporto. Dopo lo sviluppo del campione, posizionare il vetrino coprioggetto su un supporto per campioni sospeso dal piano di massa, posando il campione con le micro lenti rivolte verso il basso. Posizionare il campione sotto la sorgente UV orientata perpendicolarmente rispetto alla superficie del vetrino coprioggetto. Esporre il campione ai raggi UV. Impostare a 300 milliwatt per 120 secondi. Inclinare la sorgente UV a più e meno 45 gradi rispetto alla posizione normale del piano del campione e ripetere la procedura di esposizione. Posizionare il campione di vetro sul supporto con un angolo di 45 gradi rispetto all'orientamento della telecamera SEM. Ripetere il processo di acquisizione per entrambe le superfici del vetrino coprioggetto per raccogliere immagini SEM tridimensionali dei micro scaffold e delle micro lenti. La procedura presentata consente la polimerizzazione di microstrutture 3D di entrambe le superfici dello stesso dispositivo, garantendo un'eccellente risoluzione e stabilità. L'imaging in vitro ha mostrato una crescita riuscita delle cellule all'interno del micro scaffold, ripreso attraverso le micro lenti, rappresentando un esempio di applicazione finale del dispositivo proposto.