Un metodo di imaging ottico compatibile con microscopia elettronica a scansione per la mappatura mesoscopica del cervello di tutte le cellule

La nostra ricerca si concentra sulla connettomica. Sviluppiamo metodologie di acquisizione ottica o di immagini elettroniche ad alto rendimento, che permettono l'analisi di un neurocircuito e di una connettività sinaptica per decifrare la logica fondamentale di connessione dei neurocircuiti. La connettomica originale ad alta rivoluzione è limitata a piccoli volumi cerebrali a causa della costosa acquisizione di dati e della precisione, mentre l'analisi microscopica rapida e lo studio microscopico mirati offrono potenziale per la connettomica dell'intero cervello.

Rispetto ad altri approcci microscopici, come vari microscopi Larsens, OMLIT cattura immagini di tutti i neuroni con informazioni di preoccupazione su dendrite e assoni. Oltre alla sua compatibilità con il microscopio elettronico, esistono ulteriori immagini a risoluzione nanometrica sotto EF. OMLIT aiuta a costruire modelli cerebrali completi, mappando tutte le proiezioni a lungo raggio, inclusa direzione, intensità e tipo, insieme ai microcircuiti locali in combinazione con il tema seriale. Offre una visione dell'architettura strutturata e del flusso di informazioni in tutto il cervello.

Stiamo sviluppando imaging automatizzato OMLIT e acquisizione dati EM guidati da RI definiti da OMLIT, consentendo una raccolta e un'analisi efficiente dei dati connettomici su volumi cerebrali grandi o interi. Per cominciare, si seleziona pellicola capton o D50 con uno spessore di 50 micrometri e montata sul sistema di avvolgimento motorizzato. Utilizzando un sistema di sputtering a doppia testa magnetron, deposita un film uniforme sottile di cromo o altri metalli come alluminio, argento o rame sulla superficie del nastro.

Posiziona il nastro a una distanza di 80 millimetri dal bersaglio in sputtering. Esegui il processo con corrente continua e a una pressione di un pascal regolata dal 99,99% di gas argon. Ora, imposta la velocità di avvolgimento del nastro a 0,6 millimetri al secondo per ottenere uno spessore del rivestimento metallico di 50 nanometri.

Dopo la deposizione, rimuovi il nastro dal sistema una volta che si è raffreddato a temperatura ambiente. Valuta lo spessore e l'uniformità del rivestimento, utilizzando un profilatore a stilo, una microscopia a forza atomica o una microscopia elettronica a scansione. Per una strategia a bassa riflettività, pulire e rendere il nastro idrofilo usando un detergente al plasma a 80 watt di potenza mentre si muove il nastro a sette millimetri al secondo.

Dopo il trattamento, posiziona gocce d'acqua sulla superficie del nastro per verificare che si diffondano rapidamente in un film sottile. Utilizzando una piccola smerigliatrice o uno strumento da taglio simile, rifila grezzamente la resina sul lato del campione per rimuovere la resina bianca circostante ed esporre l'area del campione. Posiziona il blocco in resina incorporato nel portacampioni e stringilo per fissare saldamente il blocco.

Monta il portacampioni sul braccio mobile del microtomo. Installa un coltello da vetro o un coltello da taglio diamantino a un angolo di 45 gradi sul portacoltelli. Al microscopio, rifila la superficie del campione in una forma piramidale e levigala, poi rifila e leviga i quattro lati del blocco del campione per rimuovere l'eccesso di resina.

Ruota la manopola per allineare i bordi anteriore e posteriore del blocco in posizione orizzontale. Rimuovi il coltello da taglio e sostituiscilo con un coltello diamantato, disposto a un angolo di 45 gradi. Imposta l'angolo di inclinazione della base del microtomo a sei gradi e muovi lentamente il portacoltello usando la manopola finché il bordo anteriore del coltello non si trova da uno a due millimetri dalla superficie del campione.

Osserva la banda luminosa tra la superficie del campione e il bordo del coltello, e regola l'angolo di inclinazione in modo che la banda sia uniforme dall'alto verso il basso e da un lato all'altro. Ora, inietta acqua distillata nella scanalatura del coltello diamantato per bagnare la lama. Rimuovi un po' d'acqua con una siringa finché il livello del liquido non scende e il riflesso appare argentato.

Successivamente, imposta lo spessore della sezione, la velocità di taglio e la finestra di taglio nell'unità di controllo. Regolare la velocità di sezionamento a 0,6 millimetri al secondo e lo spessore della sezione a 60 nanometri, a seconda della qualità del campione. Inizia a sezionare con il microtomo.

Una volta che sono state prodotte sezioni stabili e uniformi, si interrompe il processo. Poi usa un pennello fine per rimuovere le sezioni tagliate e i detriti. Ora installa sia il mulinello del nastro rivestito che un mulinello vuoto sul sistema automatico di raccolta a sezione ultra sottile.

Fissare il meccanismo di bloccaggio ed eseguire una prova per confermare un movimento regolare del nastro a velocità costante e la corretta raccolta sulla bobina di ritiro. Immergi la testa di raccolta del dispositivo di raccolta con nastro adesivo nel bagno d'acqua del coltello diamantato e regola la testa per farla parallela al bordo del coltello a 1,5 volte la lunghezza della fetta del campione. Mettere in sicurezza il dispositivo di raccolta e riprendere la sezionazione, mentre contemporaneamente si utilizza il dispositivo di raccolta del nastro.

Dopo aver raccolto un numero sufficiente di sezioni continue, interrompere la sezionazione. Taglia il nastro in un'area senza sezioni. Fai funzionare il dispositivo di raccolta del nastro finché tutto il nastro non è avvolto sulla bobina.

Successivamente, rimuovi la bobina e mettila in un forno elettronico per asciugare. Pulisci il dispositivo di raccolta del nastro e il microtomo e rimetti tutti gli accessori al loro posto corretto. Per il montaggio su una wafer di silicio, rimuovere la pellicola protettiva trasparente dal nastro conduttivo a doppia faccia.

Applica il nastro parallelo al nastro conduttivo a doppia faccia, posizionando fino a tre segmenti di nastro su ciascun pezzo. Posiziona la wafer di silicio sul palco del microscopio ottico e fissala con un nastro adesivo non residuo. Usa una lente obiettivo a cinque X per ottenere un'immagine panoramica della wafer di silicio, del nastro e del campione.

Nell'immagine panoramica, delinea ogni sezione e ordinala, poi aggiungi punti di messa a fuoco ed esposizione per eseguire immagini automatiche a un ingrandimento 20 o 50X su tutta la wafer. Dopo l'immagini, salva le immagini e controlla la loro qualità, rifocalizzando e rifotografando se alcune sono fuori fuoco o di scarsa qualità. Importa lo stack di immagini TIFF in VAST 22 selezionando importa, seguito da importa il volume delle immagini dal file VSV.

Collega un tablet esterno e usa lo strumento pennello e disegna la modalità segmentazione per segmentare e tracciare manualmente le strutture. Usa i tasti scorciatoie A e Z per muoverti tra le fette dell'immagine. Ora, visualizza la struttura segmentata in tre dimensioni selezionando finestra, seguita da visualizzatore 3D, visualizza e aggiorna.

Infine, salva i risultati della segmentazione dopo aver selezionato file e salvato segmentazione. Nelle immagini ad alta riflettività, le regioni del lumen citoplasmatico e vascolare mostravano un'intensità più elevata rispetto alle aree circostanti, mentre nelle immagini a bassa riflettività, le regioni del lumen citoplasmatico e vascolare mostravano un'intensità inferiore. I risultati quantificati hanno dimostrato che le strategie ad alta e bassa riflettività.

Ognuno aveva vantaggi in termini di contrasto ed entropia informativa. L'imaging microscopico ottico OMLIT permise l'identificazione di assoni, vasi sanguigni, corpi cellulari e dendriti. La segmentazione manuale delle immagini delle omelette, utilizzando VAST, mostrava numerosi corpi cellulari, dendriti e assoni disposti strettamente.

I risultati segmentati sono stati combinati con l'immagine originale per produrre una visualizzazione tridimensionale. Le immagini OMLIT ingrandite hanno mostrato una risoluzione insufficiente per rivelare strutture più fine. Le immagini microscopiche elettroniche della stessa regione hanno rivelato sinapsi, mitocondri, nuclei cellulari e vescicole.