Tridimensionale Super Resolution Microscopia di filamenti di F-actina da interferometrico fotoattivati ​​localizzazione Microscopy (iPALM)

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare il citoscheletro di actina in cellule di mammifero aderenti a livello ultrastrutturale, utilizzando un metodo di microscopia tridimensionale a super risoluzione chiamato iPALM. L'imaging iPALM fornisce una risoluzione spaziale nanometrica inferiore all'andamento in tutte e tre le dimensioni. Ciò consente di visualizzare le ultrastrutture utilizzando sonde a florescenza, consentendo un'elevata specificità di marcatura.

La procedura presentata in questo video dovrebbe essere rapidamente adattabile e istruttiva per visualizzare altre caratteristiche ultrastrutturali nelle cellule mediante la localizzazione di singole molecole basata sulla microscopia a super risoluzione. Iniziare questa procedura preparando le cellule su bicchieri di copertura in una piastra a sei pozzetti. Per assemblare il campione di imaging, utilizzare una pinza fine per rimuovere delicatamente il vetro di copertura del campione dal pozzetto tampone.

Quindi picchiettare rapidamente e delicatamente il tampone in eccesso toccando il bordo del vetro di copertura con carta assorbente piegata. Posizionare il lato della cella di vetro di copertura rivolto verso l'alto su un pezzo di carta per lenti pulita. Sciacquare il campione posizionando da 30 a 50 microlitri di tampone di imaging sul campione.

Rimuovere il tampone in eccesso inclinandolo e picchiettando con carta assorbente piegata. Dopo aver ripetuto la fase di risciacquo alcune volte, posizionare da 30 a 50 microlitri di tampone di imaging sul campione. Asciugare il bordo del vetro di copertura e posizionare più piccoli punti di resina epossidica a polimerizzazione rapida sull'area asciutta.

Abbassare lentamente un altro vetro di copertura numero 1.5 pre-pulito al centro della cella contenente un vetro di copertura da 22 millimetri. Lasciare che il tampone di imaging bagni entrambi i vetri di copertura mediante azione capillare. I piccoli punti di resina epossidica a indurimento rapido dovrebbero aderire a entrambi i vetri di copertura.

Premere delicatamente sul campione assemblato utilizzando carta assorbente piegata per distribuire uniformemente la pressione. Esercitare una pressione sufficiente per rendere la cella del campione sottile e uniforme, ma non così tanto da schiacciare le cellule. Misura lo spessore corretto osservando il modello degli anelli di Newton.

Assicurati di eseguire questo passaggio delicatamente per ridurre al minimo le bolle d'aria. Se necessario, esercitarsi con i bicchieri vuoti più volte in anticipo. Quindi, sigillare il campione con vaselina lanolina paraffina fusa.

Quindi sciacquare il campione sigillato con acqua deionizzata. Asciugare il campione con aria compressa per prepararlo al montaggio sul microscopio. Spostare la lente dell'obiettivo superiore caricata a molla verso l'alto per consentire la rimozione del portacampioni.

Posizionare il campione sigillato sul supporto del campione e fissarlo con diversi piccoli magneti in terre rare. Applicare olio da immersione su entrambi i lati del campione di imaging. Riposizionare il portacampioni nel percorso ottico e abbassare delicatamente la lente dell'obiettivo superiore.

Accendi i laser di eccitazione. Accendere anche le telecamere EMCCD in modalità di trasferimento fotogrammi. Quindi, ruotare i filtri di emissione appropriati.

Attiva un otturatore meccanico per bloccare il percorso del raggio superiore e aprire il percorso del raggio inferiore. Mettere a fuoco la lente dell'obiettivo inferiore mediante traslazione con piccoli incrementi utilizzando l'attuatore piezoelettrico. Una volta che il fiduciale è a fuoco, aprire il percorso del raggio superiore bloccando il percorso del raggio inferiore e mettere a fuoco la lente dell'obiettivo superiore in modo simile.

Monitora la larghezza del fiduciale sul display del computer per una messa a fuoco ottimale. Per una corretta centratura, aprire sia il percorso della trave superiore che quello inferiore. Regolare manualmente la lente dell'obiettivo superiore mentre l'obiettivo inferiore viene mantenuto costante utilizzando un paio di viti di fermo microfini fino a quando le immagini fiduciali non vengono sovrapposte il più fedelmente possibile, idealmente entro un pixel.

Successivamente, eseguire regolazioni fini in modo che le immagini fiduciali si sovrappongano entro un decimo di pixel EMCCD. Regolare gli specchi piezoelettrici superiori a due assi tramite il software di controllo, tenendo costanti entrambe le lenti dell'obiettivo e gli specchi riflettenti inferiori. Confronta i centri dei fiduciali delle viste dell'obiettivo superiore e inferiore tramite il display del computer per guidare il processo.

Con i laser accesi, le telecamere in continuo streaming e i percorsi del fascio superiore e inferiore aperti, fanno oscillare il piezo Z del supporto del campione utilizzando una forma d'onda di tensione sinusoidale generata dal software di controllo per un'oscillazione continua dell'asse Z su una grandezza di 400 nanometri. Traslare manualmente il gruppo divisore di fascio motorizzato verso l'alto o verso il basso fino a quando l'intensità del fiduciale oscilla. A causa dell'effetto di interferenza del singolo fotone desiderato, ciò significa la stretta corrispondenza delle lunghezze del percorso ottico.

In casi ottimali è possibile ottenere un rapporto picco/valle superiore a 10. Per garantire che sia l'ampiezza che la fase su ciascuna superficie siano il più uniformi possibile su tutto il campo, regolare lo specchio inferiore del gruppo divisore di fascio a piccoli passi per regolare con precisione la distanza e gli angoli di inclinazione. Eseguire l'allineamento di precisione del beam splitter traslando il campione in passi Z di otto nanometri su 800 nanometri.

Monitora l'intensità del fiduciale tra le telecamere da una a tre. Regolare l'altezza, la posizione e l'inclinazione dello specchio inferiore all'interno del gruppo divisore di fascio a piccoli passi in modo tale che la fase di oscillazione della telecamera uno rispetto alla telecamera due sia massimizzata, idealmente a 120 gradi. Una volta completato l'allineamento iniziale, tradurre il campione per cercare un campo visivo adatto che contenga sia le cellule da visualizzare che più fiduciali nelle vicinanze.

Posizionare un involucro intorno al sistema per bloccare la luce diffusa e le perturbazioni ambientali. Una volta individuata l'area di imaging, traslare nuovamente il campione e registrare la curva di calibrazione per l'utilizzo nelle successive estrazioni delle coordinate Z. Utilizzando il comando acquisisci scansioni di calibrazione rispetto alla posizione piezoelettrica del campione nell'interfaccia principale.

Una volta individuata l'area desiderata e ottenuta la curva di calibrazione, inserire i nomi dei file appropriati nel software. Apri sia il percorso del fascio superiore che quello inferiore, quindi aumenta al massimo la potenza di eccitazione del laser a 642 nanometri. Per Alexa Fluor 647, potrebbe essere necessario un periodo iniziale di spegnimento del Fluor-4.

Esporre con un'eccitazione costante di 642 nanometri per cinque minuti, o più a lungo se necessario, fino a quando non si osserva il lampeggiamento di una singola molecola. Il software consente un aumento automatico della fotoattivazione a 405 nanometri durante il corso dell'acquisizione. Di solito è necessario un gran numero di fotogrammi di acquisizione affinché le caratteristiche filamentose siano chiaramente visibili.

Quando si è pronti, avviare l'acquisizione di set di immagini grezze utilizzando il comando start iPALM acquisition nell'interfaccia principale. Durante l'acquisizione, regolare il livello di attivazione fotografica regolando l'intensità del laser a 405 nanometri per mantenere la corretta densità di lampeggio secondo necessità. Quando il vetrino coprioggetto del campione è assemblato correttamente, gli anelli di Newton possono essere osservati ad occhio nudo sotto la luce ambientale o l'illuminazione fluorescente standard.

L'estrazione delle posizioni assiali degli emettitori di fluorescenza richiede un'interferenza multifase simultanea nell'imaging iPALM, che viene calibrata dalle variazioni di intensità di un dato fiduciale in tre EMCCD. Le intensità vengono quindi normalizzate e adattate per determinare le differenze di fase. Ecco l'immagine iPALM di ricostruzione con ogni coordinata di localizzazione renderizzata da una gaussiana 2D con la larghezza corrispondente all'incertezza di localizzazione.

La coordinata Z viene colorata in base alla barra dei colori. Si possono osservare aree di caratteristiche filamentose dense e radi. Qui sono mostrate le immagini iPALM di ricostruzione del citoscheletro di actina delle cellule HUVEC marcate con Alexa Fluor 647 falloidina.

Il colore dell'immagine indica le coordinate Z in base alla barra dei colori. L'istogramma della sezione trasversale viene generato dalle coordinate di localizzazione XY lungo l'asse lungo dell'area riquadro. L'adattamento gaussiano mostra l'intera larghezza a metà massimo di 43,88 nanometri associati alla sezione trasversale.

Questo istogramma rappresenta la posizione Z delle coordinate di localizzazione nell'area riquadro. L'adattamento gaussiano mostra l'intera larghezza a metà massimo di 17,50 nanometri. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 90 minuti se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione di come visualizzare il citoscheletro di actina all'ultrastrutturale utilizzando iPALM attraverso una semplice preparazione e montaggio, allineamento ottico, acquisizione di dati grezzi e la successiva analisi per la ricostruzione di immagini a super risoluzione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alle ricerche nel campo della biologia cellulare per esplorare l'architettura su scala nanometrica del citoscheletro di actina, nonché le strutture di adesione cellulare come le aderenze focali.