Name: Caratterizzazione di trasporto dellelettrone attraverso biofilm vivente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Scopri come misurare la conduttività elettrica di biofilm microbici viventi in condizioni fisiologiche. Questo metodo utilizza elettrodi interdigitati per studiare il trasporto elettronico extracellulare e le sue implicazioni nell'elettrochimica microbica.

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M.D.Y, S.M.G-S. e LMT riconosce l'Office of Naval Research (premio #N0001415WX01038 e N0001415WX00195), il laboratorio di ricerca navale e l'Istituto di Nanoscienze di laboratorio di ricerca navale; M.Y.E.-N. è supportato da l'US Dipartimento di energia Grant DE-FG02-13ER16415.

1. preparazione di interdigitating microelettrodo matrice (IDA)
<ol><li>Ottenere IDA commercialmente disponibile elettrodi modellati su un substrato non conduttivo o sintetizzarli utilizzando metodi standard litografici. 28 Nota: IDA dimensioni e/o materiali possono essere variate sulla base desiderate condizioni per diversi esperimenti. IDAs qui utilizzati sono stati ottenuti in commercio e consisteva di due interdigitating microelettrodo oro modellato su un substrato di vetro collegato ad elettrodi grandi alle estremità opposte della matrice. Gli elettrodi sono esposti mentre le linee di autobus collegamento degli elettrodi per le grandi pastiglie di contatto sono rivestite con materiale isolante sottile. IDAs utilizzati qui sono costituiti da due set di 10 bande di lunga oro microelettrodo µm-wide e 2 mm (source e drain) distanziati di 5 µm apart modellato su una superficie di vetro piano. IDAs utilizzato qui aveva 65 paia di elettrodi (130 totale interdigitating bande). Alternanza di fasce è collegati ad elettrodi alle estremità opposte della matrice.</li>
	<li>Filo e isolare IDA<ol>
<li>Collegare un cavo per ogni pad elettrodo grande utilizzando resina epossidica conduttrice d'argento.<ol>
<li>Preparare la resina epossidica conduttrice secondo le istruzioni del produttore per la resina epossidica specifica in uso con una punta di asta o pipetta miscelazione (istruzioni possono variare dal produttore).</li>
			<li>Posizionare un filo su ogni pad oro, sicuro in posizione con del nastro di laboratorio. Coprire il filo e il pad con epossidica argento usando una punta di asta o pipetta di miscelazione.</li>
			<li>Muovere con cautela per un forno a 80 ° C per 1 h a cura o cura sulla base delle raccomandazioni del produttore per l'epossidica argento conduttiva specifica utilizzato.</li>
			<li>Dopo la resina epossidica cure, è possibile utilizzare un multimetro per garantire connettività elettrica tra la fine del filo e le pastiglie. La resistenza tra il filo e il tampone dovrebbe essere &lt; 5 Ω. Inoltre, è possibile utilizzare il multimetro per verificare che nessun epossidico conduttivo è connessione elettrodi multipli, come questo può breve la matrice. Se la resina epossidica conduttrice è più cavi di collegamento, utilizzare un graffietto per isolare i cavi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Isolare la connessione epoxied rivestendo la connessione con una termica, elettrica e impermeabile materiale isolante. Ritardante di fiamma resine poliuretaniche sono spesso adatte.<ol>
<li>Rimuovere la punta di una provetta conica per centrifuga 15 mL (a circa il marchio di 2,5 mL) come uno stampo per il materiale isolante. Fare due piccoli fori nella parte inferiore per i cavi a sporgere attraverso l'utilizzo di un ago 21G.</li>
			<li>Inserire l'IDA il fili attraverso i fori nella parte inferiore della muffa e della muffa.</li>
			<li>Preparare il materiale isolante specifico. Seguire le istruzioni fornite con la resina specifica ottenuta.</li>
			<li>Pipettare l'isolante nello stampo in modo che la resina epossidica argento è completamente coperto (~2.5 mL) e lasciare per asciugare secondo le specifiche del produttore.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. elettrochimica reattore installazione, collaudo e inoculazione
<ol><li>Impostare la cella elettrochimica.<ol>
<li>Inserire la cella elettrochimica IDA, controelettrodo ed elettrodo di riferimento. Nota: Il reattore elettrochimico utilizzato può variare notevolmente, fino a quando tutti gli elettrodi forma all'interno. Una considerazione è che l'elettrodo di riferimento dovrebbe essere più vicino possibile all'elettrodo di lavoro dato i limiti pratici del reattore. Qui, usiamo un reattore monocamera con il riferimento dell'elettrodo ~ 2-3 cm dagli elettrodi di lavoro. Inoltre, l'elettrodo contatore deve essere più grande l'elettrodo di lavoro per garantire che non è limitante nel sistema.</li>
		<li>Se si lavora con una coltura pura, sterilizzare il reattore con il controelettrodo all'interno. Sterilizzare l'elettrodo di riferimento in ammollo nella candeggina per 10 min e acqua deionizzata sterile per 10 min. sterilizzare l'IDA mediante immersione in candeggina per 5 s seguita da acqua deionizzata sterile per 10 s prima dell'inserimento nel reattore.</li>
		<li>Riempire la cella elettrochimica con mezzo sterile adatto per la crescita di biofilm. Per g. sulfurreducens17,18, usare acqua dolce mezzo escluse fumarato. Per biocathode MCL,9 usare mezzo artificiale con acqua di mare. 9
</li>
		<li>Collegare gli elettrodi di un bipotentiostat. Collegare un elettrodo di IDA al cavo del lavoro 1, l'altro elettrodo IDA al cavo del lavoro 2, l'elettrodo di riferimento per la Guida di riferimento e il controelettrodo al cavo del contatore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Test elettrochimici di IDAs. Nota: L'obiettivo principale di questo test è quello di assicurarsi che i due elettrodi sono separati galvanicamente. Tutte le tecniche elettrochimiche sono disponibili nel software utilizzato per controllare il bipotentiostat.<ol>
<li>Eseguire test di conducibilità di controllo (prima crescita di biofilm) per garantire il corretto funzionamento di IDA utilizzando un bipotentiostat.<ol>
<li>Misura il potenziale del circuito aperto di ciascun elettrodo per 1 min. Nota: Su alcuni strumenti, circuito aperto potenziale deve essere raggiunto utilizzando il programma di raccolta di galvanostatici e impostazione della corrente a 0 mA.</li>
			<li>Misura il potenziale del circuito aperto di elettrodo 2 durante l'esecuzione di voltammetria ciclica sull'elettrodo 1 tra + 0,2 V a + 0,6 V (vs lei) a 20 mV/s. Nota: Altri limiti e la frequenza delle analisi per CV può essere utilizzato se lo si desidera. Tuttavia, evitare potenziali che comporterà la generazione di idrogeno o ossigeno.</li>
			<li>Verificare che il circuito aperto potenziali misurato a elettrodo 2 non rispecchiano il potenziale dell'elettrodo 1 durante il CV usando il software potenziostato. Nota: Il potenziale del circuito aperto di elettrodo 2 può cambiare, ma dovrebbe essere indipendente del potenziale di elettrodo 1.</li>
			<li>Ripetere i passaggi da 2.2.1.1 attraverso 2.2.1.3 tranne controllo il potenziale di elettrodo 2 e misura il potenziale del circuito aperto dell'elettrodo 1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Impostare il potenziale di elettrodi di lavoro il potenziale di crescita desiderata del biofilm elettroattivi pertinenti utilizzando il software bipotentiostat. Ad esempio, è possibile utilizzare + 0.5 V (vs lei) per Geobacter sulfurreducens o +0.31 V (vs lei) per biocathode MCL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crescere pertinenti elettroattivi biofilm<ol>
<li>Inoculare il reattore elettrochimico da un magazzino cultura/arricchimento dei microrganismi elettrochimicamente attivi desiderati utilizzando le tecniche microbiologiche asettiche standard. Per prove standard, inoculare in un 01:20 rapporto (inoculo al volume del reattore) di un OD600 = 0,5 cultura.</li>
		<li>Impostare l'agitazione nel reattore al livello desiderato (~ 200 giri/min) e l'incubatore / bagno di acqua alla temperatura desiderata in base alle condizioni di crescita del biofilm di interesse. Per g. sulfurreducens, utilizzare 30 ° C per una crescita ottimale.</li>
		<li>Incubare il sistema in base a specifici requisiti di microorganism(s) di interesse finché il biofilm colma il divario che separa i due elettrodi. Per stazionario biofilm g. sulfurreducens , incubare per ~ 7-10 giorni. Per biocathode MCL, incubare ~ 7 giorni. In ogni caso, controllare la temperatura a 30 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. elettrochimici esperimenti gating
<ol><li>Selezionare i parametri sperimentali che verranno utilizzati per determinare la dipendenza di corrente-potenziale per le misurazioni di Gate.
	<ol>
<li>Determinare la portata dei potenziali di cancello che verrà applicato per l'IDA per ottenere la corrente condotta (ISD) contro curva (EG) potenziale di cancello per il sistema. Nota: La gamma dei potenziali cancello esaminato dovrebbe coprire tutti i potenziali con attività redox possibile. Se nessuna informazione circa il sistema di interesse è disponibile, una gamma ampia potenziale dovrebbe essere usato (-da 0,55 a + 0,6 V vs lei). Un approccio di prova ed errore può essere utilizzato per mettere a punto la gamma basata sul sistema oggetto di studio. Cancello di potenziale è definita come: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq1.jpg"> dove ED è il potenziale dell'elettrodo scarico ed ES è il potenziale dell'elettrodo di origine. La gamma dei potenziali cancello utilizzato è vincolata dai requisiti e limitazioni del sistema specifico di interesse. 18 Nota: Source e drain potenziali che si tradurrà in evoluzione di ossigeno e idrogeno dovrebbero essere evitati come questi processi possono danneggiare il biofilm.</li>
		<li>Determinare la tensione di fonte-drain (VSD) che verrà utilizzata come forza motrice per trasporto di elettroni attraverso la pellicola dall'origine allo scarico. Tensione drain-source è definito come: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq2.jpg"> Nota: La tensione di fonte-scarico deve essere sufficientemente piccola affinché ISD scalabilità lineare con VSD. 17
</li>
		<li>Scegliere una velocità di scansione (v) a cui EG viene modificato linearmente con il tempo che è indipendente iSD in modo che il sistema può essere approssimato per essere allo stato stazionario per ogni cancello potenziale. Nota: Una velocità di scansione di inferiore a 0,002 V/s viene spesso utilizzata per sistemi biologici. 29 , 30
</li>
		<li>Impostare il software bipotentiostat per eseguire le misurazioni Gate (cioè spazzare il cancello potenziali) sopra l'intervallo selezionato, alla tensione selezionato origine-scarico e alla velocità di scansione desiderata basato sulle considerazioni di cui sopra. Nota: per le misurazioni Gate precedente con g. sulfurreducens,17,19 EG =-da 0,55 V a 0,6 V (vs lei), VSD = 0.01 V o 0,1 V, v = 0.001 V/s. Per Biocathode MCL, EG = 0.25 V a 0.7 V (vs lei), VSD = 0,002 V, v = 0.0002 V/s.<ol>
<li>Inoltre, eseguire una misurazione di base con VSD = 0.000 V (cioè, un CV a ciascun elettrodo individuo effettuato simultaneamente) al v stesso scelto nel passaggio 3.1.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire misurazioni Gate utilizzando le condizioni in 3.1.4 sotto entrambi fatturato (con donatore dell'elettrone solubile o accettore presente) e non-fatturato (senza solubile elettrone donatore o accettore). Nota: Non fatturato condizioni sono vantaggiose perché misurazioni non disturbino l'ossidazione o la riduzione dei composti solubili per il metabolismo cellulare, anche se risultati simili dovrebbero essere ottenuti indipendentemente da quale condizione viene utilizzata dopo sottraendo le correnti di fondo (dettagliate in 3.1.8).<ol>
<li>Ottenere condizioni di fatturato utilizzando lo stesso mezzo di reattore come quello usato per la crescita batterica sull'elettrodo. Questa sostanza contiene un donatore di elettroni solubili, quali acetato per g. sulfurreducens,17 o accettore, come l'ossigeno per Biocathode MCL.</li>
			<li>Ottenere condizioni di non-fatturato facendo lo stesso mezzo di reattore utilizzato per la crescita batterica sull'elettrodo, salvo omettere il donatore dell'elettrone solubile o accettore. Dopo aver verificato che il potenziostato è spento, rimuovere asetticamente il mezzo e aggiungere in mezzo fresco senza il donatore dell'elettrone per sistemi anodiche o accettore per sistemi catodica. In alternativa, può istituire un sistema a flusso continuo per sostituire lentamente il mezzo con il mezzo desiderato per nonturnover condizioni. Nota: Se l'ossigeno è l'accettore di elettroni solubile (per quanto riguarda biocathode MCL), sparge il sistema con una miscela di ~ 15% CO2 e 85% N2 (o una miscela di gas che manterrà il pH corretto nel mezzo).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dopo il completamento delle misurazioni Gate, è possibile utilizzare il software potenziostato per impostare il potenziale di ciascun elettrodo torna alla crescita potenziale per consentire al sistema di ri-stabilizzare (utilizzando gli stessi valori 2.2.2).</li>
		<li>Se sono soddisfatte tutte le condizioni sopra descritte (ISD è indipendente di v e scalabilità lineare con VSD), convertire I valoriSD conducibilità utilizzando le seguenti equazioni come descritto in precedenza31 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq4.jpg">
</li>
		<li>dove G è la conduttanza e S è un fattore di scala che dipende dal sistema e fattori variabili come la dimensione degli elettrodi, spaziatura e altezza del biofilm. Per alcuni sistemi, S può essere determinato dalle equazioni predeterminati. 31 in alternativa, S può essere calcolata numericamente utilizzando un software di modellazione, come descritto in precedenza. 17
</li>
		<li>Sottrarre le correnti di fondo per identificare la forma e la grandezza della condotta corrente. O sottrarre la corrente generata a VSD = 0.00 V dalla corrente generata a VSD = 0,01 V o sottrarre lo scolo corrente dall'origine corrente generato con una VSD = 0,01 V. entrambi metodo rimuove correnti di fondo, lasciando solo l'attuale condotta.</li>
	</ol></li>
	<li>Misure di gating elettrochimiche dipendente dalla temperatura
	<ol>
<li>Determinare l'intervallo di temperature di interesse. Questa gamma è altamente dipende dal sistema in fase di studio, tuttavia fisiologicamente rilevanti temperature devono essere utilizzate. Nota: Gli studi precedenti hanno usato una gamma di temperatura di 10 ° C a 30 ° C per lo studio di trasporto dell'elettrone in condizioni fisiologicamente rilevanti per i microrganismi mesofili. 17
</li>
		<li>Ottenere un ricircolo bagnomaria o dall'incubatore per regolare la temperatura del reattore e un reattore di controllo per garantire che il set point e la temperatura effettiva del mezzo è lo stesso.<ol>
<li>Inserire un termometro o la termocoppia in un reattore di controllo dove sarebbe l'IDA.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Io fare misurazioni diSD (vedere 3.1.4) sopra la gamma di temperature selezionate sotto fatturato e nonturnover (descritto al punto 3.1.5) condizioni utilizzando il bipotentiostat seguendo una delle due procedure descritte di seguito.<ol>
<li>Generare ISD contro le curve EG , come descritto in precedenza (Vedi 3.1), per ogni temperatura sopra la gamma di temperature di interesse. Per i materiali che esibiscono conducibilità redox, come g. sulfurreducens e Biocathode MCL, la corrente di picco da ogni temperatura viene utilizzato per determinare ISD vs dipendenza da T. Nota: Questo metodo è utilizzato per generare un completo hoSD vs EG curva per ogni temperatura, ma richiede più tempo che la seconda opzione.</li>
			<li>In alternativa, impostare e tenere premuto l'IDA al cancello potenziale che produce massimo condotto corrente utilizzando il bipotentiostat (ottenuti da ISD curva di vs EG , punto 3.1.4) e registrare la massima corrente condotta utilizzando il bipotentiostat mentre la temperatura è in bici tra la gamma di temperature selezionato mediante i comandi a bordo del bagnomaria o dall'incubatore. Nota: con la geometria dell'elettrodo/reattore utilizzata qui, ISD e T sono autorizzati a stabilizzare per almeno 20 min e una media stabile hoSD viene utilizzato per ogni temperatura. Più o meno tempo di stabilizzazione può essere richiesto sulla base del sistema specifico. Questo metodo è più veloce rispetto alla prima e provoca meno stress per il biofilm. Tuttavia, non vengono generate curve piene di Gate.</li>
			<li>La temperatura del ciclo da un set point a altro e viceversa utilizzando nuovamente i controlli a bordo di incubatore o bagnomaria per determinare la reversibilità della reazione per garantire che la temperatura in bicicletta non danneggia il biofilm.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ripristinare la temperatura la temperatura di crescita normale utilizzando i controlli a bordo dell'incubatore o bagnomaria e consentire al sistema di stabilizzare. Nota: Per un conduttore di redox, laSD rispetto a dati di 1/T posso essere misura con l'espressione tasso di Arrhenius, che permette il calcolo dell'energia di attivazione come segue: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/54671/54671eq6.jpg"> dove Euna è l'energia di attivazione per il trasferimento di elettroni tra cofattori redox adiacente e k è la costante di Boltzmann.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Durante l'installazione di IDA, è fondamentale per verificare che l'origine e lo scarico non sono corto insieme prima misure elettrochimiche di Gate, come questo altererà ISD vs curva EG e potrebbe portare a interpretazioni e risultati errati. È anche fondamentale per selezionare VSD e v tale che la corrente è linearmente dipendente da VSD e indipendente di v. Se questo non è il caso, le equazioni descritte sopra non possono essere utilizzate per calcolare la conduttività.
...

Extracellulare di trasporto dell'elettrone (EET) è un processo che consente alcuni microrganismi per il trasporto di elettroni tra processi metabolici intracellulari e insolubile accettori o donatori che risiedono all'esterno della cella, che vanno da minerali naturali per elettrodi. In alcuni casi, EET consente microrganismi formare elettricamente conduttivo della multi-cellula spesse biofilm su superfici di elettrodo, in cui le cellule non a diretto contatto con l'elettrodo possono utilizzare ancora come un ricettore dell'elettrone metabolica o donatore. C'è un notevole interesse in tali biofilm come catalizzatori di elettrodo per varie applicazioni, come elettrosintesi microbica, rilevamento/rimozione di contaminanti e generazione di energia a distanza e stoccaggio,7,8,9 ,10,11,12,13,14 a causa della diversità dei processi metabolici, eseguita da microrganismi e la durevolezza di biofilm microbici rispetto a base di enzima bioelettrodi. 15 , 16 inoltre, EET vie possono potenzialmente essere utilizzate per modifiche elettricamente controllo o segnale di naturali o geneticamente microbici processi metabolici coinvolti, ad esempio, nella produzione di un prodotto desiderato o rilevamento di un analita o stimolo. La conduttività elettrica di elettrocatalitica biofilm, che li distingue da altri materiali biologici, è un aspetto centrale della loro proprietà elettrocatalitiche, ancora poco è capito circa il processo di EET fondo nell'ambiente dell'elettrodo, e ciò che è noto è fortemente contestata. 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Qui descritto è un metodo di 2 elettrodi per misurare la conducibilità attraverso biofilm living, elettrodo-coltivate utilizzando matrici interdigitating elettrodo (IDAs). IDAs consistono di elettrodi rettangolari paralleli modellati sulla superficie di vetro piano in modo tale che ogni altra band è collegata ai lati opposti della matrice risultante in 2 elettrodi (la fonte e scolo). L'esame attento di una IDA (Vedi ad esempio, la figura 6.12b di ref #1) rivela che il divario che separa le bande adiacenti è anche collegati in modo tale da formare un singolo spacco che intreccia avanti e indietro attraverso la matrice che separa i due elettrodi. Il risultato è un lungo e stretto che separa gli elettrodi di source e drain, ottenendo molto alta fonte-scarico correnti quando un materiale conduttivo è formato, il cast, polimerizzato o cresciuto (nel caso del tipo di biofilm considerato qui) la matrice. Inoltre, le piccole dimensioni degli elettrodi si traduce in piccolo sfondo corrente a causa della capacità di carica e di cambiare in stato di ossidazione del materiale conduttivo con cambio a cancello potenziale, poiché la quantità di materiale necessario per rendere la conducibilità le misurazioni con IDAs sono così piccole. La tecnica di base di IDA gating elettrochimico descritto qui, sviluppato per caratterizzare i polimeri conduttivi a film sottile,2,3,4,25 solo recentemente è stata applicata ai sistemi viventi. 18 un'altra tecnica utilizzata per misurare la conducibilità dei biofilm vivente utilizzato un grande formato split elettrodi di source e drain e metri di origine per impostare la porta potenziali. 26 , 27 tuttavia, preoccupazioni per questi metodi sono state dettagliate in precedenza. 18
Incapsula il protocollo qui sotto la nostra esperienza con effettuare accurate misure di conduttività del vivere biofilm MCL Geobacter sulfurreducens e biocathode. G. sulfurreducens è un elettrodo di modello riducendo l'organismo in grado di utilizzare materiali insolubili, compresi gli elettrodi, come il ricettore dell'elettrone metabolica suola. Inoltre, forma biofilm spesse che sono in grado di trasportare elettroni su più celle di lunghezza, che lo rende un organismo modello ideale per studiare il trasferimento di elettroni a distanza extracellulare anodica. Includiamo anche dettagli per lo studio della biocathode MCL, un biofilm aerobica, autotrofi comunità mista isolato dal catodo di una cella a combustibile microbica bentonico. Biocathode MCL (così chiamato per i tre costituenti primari – Marinobacter, Chromatiaceaea e Labrenzia) è in grado di ossidanti un elettrodo come suo unico elettrone donatore e trasporto di elettroni su più celle di lunghezza, rendendo ha un interessante sistema di catodico per studiare. Inoltre, biocathode MCL ha la più alta conducibilità segnalata per un sistema vivente fino ad oggi utilizzando questi metodi. L'inclusione di questi biofilm elettroattivi diversificata in questo protocollo è destinato per evidenziare che questa tecnica è applicabile al trasporto di elettroni attraverso qualsiasi biofilm vivente in grado di interagire elettricamente con elettrodi di misura.

<table><tbody><tr><td>IDAs</td><td>CH Instruments</td><td>012125</td><td>Prodotto da ALS-Japan; venduto da CH Instruments</td></tr><tr><td></td><td>Filo Digikey</td><td>W7-ND</td><td></td></tr><tr><td>Argento conduttivo epossidico</td><td>Microscopia elettronica scienze 12670-EE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiale isolante</td><td>3M</td><td>2131-B</td><td>Composto ritardante di fiamma Scotchast</td></tr><tr><td>15 mL provetta da centrifuga conica</td><td>VWR</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>ago da 21 g</td><td>VWR</td><td>BD-305165</td><td></td></tr><tr><td>puntali per pipette da 5 mL</td><td>VWR</td><td>82018-842</td><td></td></tr><tr><td>pipettatore da 5 mL</td><td>VWR</td><td>89079-976</td><td></td></tr><tr><td>Componenti del mezzo d'acqua dolce</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Tutti i prodotti chimici</td><td></td> di laboratorio standard</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Cloruro</td><td></td><td></td><td></td> di ammonio</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Sodio fosfato monobasico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Bicarbonato</td><td></td><td></td><td></td>di sodio</tr><tr><td>Componenti medi artificiali per acqua di mare</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Tutti i prodotti chimici</td><td></td> di laboratorio standard</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Cloruro di</td><td></td><td></td><td></td> sodio</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Cloruro di magnesio esaidrato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; Solfato di magnesio eptaidrato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; Cloruro di</td><td></td><td></td><td></td> potassio</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Bicarbonato</td><td></td><td></td><td></td> di sodio</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Cloruro di calcio diidrato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; Cloruro</td><td></td><td></td><td></td> di ammonio</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Elettrodo</td> di riferimento Ag/AgCl bibasico <td></td><td></td><td></td>fosfato di potassio</tr><tr><td></td><td>Basi</td><td>MF-2079</td><td></td></tr><tr><td>Controelettrodo a barre in grafite</td><td>Microscopia elettronica</td><td>scienze 70230</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua a ricircolo</td><td>Thermo Scientific</td><td>152-5256</td><td></td></tr><tr><td>Bipotenziostato</td><td>Pine Instruments</td><td>WD-20</td><td>http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user</td></tr><tr><td>Ancorette</td><td>VWR</td><td>58947-114</td><td></td></tr><tr><td>G. sulfurreducens coltura</td><td>ATCC</td><td>51573</td><td></td></tr><tr><td>Reattore incamiciato</td><td>Pine Instruments</td><td>RRPG085</td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione di trasporto dell'elettrone attraverso biofilm vivente

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

Qui dimostriamo che il metodo di gating elettrochimico utilizzato per caratterizzare la conduttività elettrica di biofilm microbici elettrodo-coltivate in condizioni fisiologicamente rilevanti. 1 queste misurazioni vengono eseguite su biofilm vivente in mezzo acquoso utilizzando origine e scarico elettrodi modellati su una superficie di vetro in una configurazione specializzata indicata come un array di elettrodi interdigitating (IDA). Un biofilm è coltivato che si estende attraverso il gap che collega la fonte e scolo. I potenziali sono applicati agli elettrodi (ES ed ED) generando una corrente di fonte-scarico (ISD) attraverso il biofilm tra gli elettrodi. La dipendenza della conducibilità elettrica sul potenziale del cancello (la media delle potenzialità di source e drain, EG = [ED + ES] / 2) è determinata sistematicamente cambiando il cancello potenziale e misurando il conseguente drenaggio di origine corrente. La dipendenza della conducibilità sul cancello potenziale fornisce meccanicistici informazioni sul processo di trasporto extracellulare dell'elettrone sottostante la conduttività elettrica del biofilm specifico sotto inchiesta. Il metodo di misurazione gating elettrochimico qui descritto si basa direttamente su quello utilizzato dal M. S. Wrighton2,3 e colleghi e R. W. Murray4,5,6 e colleghi in il 1980 è indagare su polimeri conduttivi a film sottile.

IDAs erano cablata, isolate e testate per garantire che i due elettrodi erano elettricamente isolati da altro (Figura 1). Reattori sono stati assemblati, inoculati con g. sulfurreducense incubate fino a quando un biofilm colmato il divario tra gli elettrodi. Il biofilm di g. sulfurreducens può essere visto visivamente per coprire la matrice. Altri biofilm possono richiedere al ricercatore di fare un gating misure elettrochimiche per vedere s...

Un protocollo per la misurazione di conduttività elettrica di biofilm microbici viventi in condizioni fisiologicamente rilevanti è presentato.

Caratterizzazione di trasporto dell'elettrone attraverso biofilm vivente

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è determinare la quantità di corrente che può essere condotta attraverso un materiale vivente in situ, nonché il meccanismo impiegato dal materiale vivente per trasportare la corrente. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'elettrochimica microbica come: come possono alcuni biofilm spostare gli elettroni per centinaia di micron per supportare il metabolismo cellulare? Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli elettrodi interdigitati forniscono un rapporto segnale/rumore molto elevato e possono essere scalati per adattarsi a molte configurazioni di reattori diverse.Questi metodi possono fornire informazioni sul trasporto di elettroni extracellulari di lunghezza multicellulare nei biofilm. Può essere applicato anche ad altri sistemi, come i film polimerici elettricamente conduttivi. I ricercatori nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché richiede un bipotenziostato per impostare separatamente i potenziali di entrambi gli elettrodi e misurare la corrente su ciascun elettrodo separatamente.Per iniziare, è necessario ottenere elettrodi IDA disponibili in commercio modellati su un substrato non conduttivo o sintetizzarli utilizzando metodi litografici standard. Preparare la resina epossidica d'argento conduttiva secondo le istruzioni del produttore con un'asta di miscelazione o un puntale per pipetta. Quindi, posiziona un filo su ciascun cuscinetto d'oro e fissali in posizione usando del nastro adesivo.Coprire il filo e il tampone con resina epossidica d'argento utilizzando un'asta di miscelazione o un puntale per pipetta. Spostare con cautela l'apparecchio in un forno a 80 gradi Celsius per un'ora per indurire. Dopo l'indurimento della resina epossidica, utilizzare un multimetro per garantire la conduttività elettrica tra l'estremità del filo e i cuscinetti.La resistenza tra il filo e le piazzole deve essere inferiore a cinque ohm. Inoltre, utilizzare il multimetro per verificare che nessuna resina epossidica conduttiva stia collegando più elettrodi, in quanto ciò può cortocircuitare l'array. Se la resina epossidica conduttiva collega più cavi, utilizzare il graffietto per isolare i cavi.Quindi, rimuovere la punta di una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri da utilizzare come stampo per il materiale isolante. Usa un ago calibro 21 per fare due piccoli fori sul fondo dello stampo attraverso i quali i fili devono sporgere. Inserire l'IDA nello stampo e inserire i fili attraverso i fori sul fondo dello stampo.Successivamente, preparare un materiale isolante termico, elettrico e impermeabile. Le resine poliuretaniche ritardanti di fiamma sono spesso adatte. Pipettare l'isolante nello stampo in modo che la resina epossidica d'argento sia completamente coperta e lasciare asciugare l'isolante secondo le specifiche del produttore.Per configurare la cella elettrochimica, inserire l'IDA, il controelettrodo e l'elettrodo di riferimento nella cella elettrochimica. Riempire la cella elettrochimica con un terreno sterile adatto alla crescita del biofilm. Per il Geobacter sulfurreducens, utilizzare un mezzo di acqua dolce escluso il fumarato.Quindi, collegare gli elettrodi a un bipotenziostato. Collegare un elettrodo IDA al cavo di lavoro, l'altro elettrodo IDA al cavo di lavoro, due, l'elettrodo di riferimento al cavo di riferimento e il controelettrodo al controelettrodo. Eseguire un esperimento di controllo eseguendo la voltammetria ciclica sull'elettrodo uno e tenendo l'elettrodo due a circuito aperto per assicurarsi che gli elettrodi non siano collegati.Per far crescere il biofilm elettroattivo pertinente, inoculare il reattore elettrochimico da una coltura madre o dall'arricchimento dei microrganismi elettrochimicamente attivi desiderati utilizzando tecniche microbiologiche asettiche standard. Per i test standard, inoculare in un rapporto da 1 a 20 tra il volume dell'inoculo e il reattore. Impostare l'agitazione nel reattore al livello desiderato e impostare l'incubatrice o il bagno d'acqua alla temperatura desiderata in base alle condizioni di crescita del biofilm di interesse.Incubare il sistema in base alle esigenze specifiche del microrganismo di interesse fino a quando il biofilm non colma lo spazio che separa i due elettrodi. Per il biofilm Stazionario Geobacter sulfurducens, incubare per sette-dieci giorni a 30 gradi Celsius. Iniziare l'impostazione dei parametri sperimentali che verranno utilizzati per determinare l'attuale dipendenza dal potenziale per le misure di gating come descritto nel protocollo di testo.Impostare il software bipotenziostato per eseguire le misure di gating nell'intervallo selezionato alla tensione di drain della sorgente selezionata e alla velocità di scansione desiderata. Inoltre, eseguire una misurazione di base come descritto nel protocollo di testo. Eseguire misure di gating utilizzando le stesse condizioni in caso di turnover con donatore o accettore di elettroni solubili presente in non-turnover senza condizioni di donatore o accettore di elettroni solubili.Procurarsi un reattore di controllo per garantire che il set point e la temperatura effettiva del fluido siano gli stessi. Metti un termometro o una termocoppia in un reattore di controllo dove si troverebbe l'IDA. Quindi, effettuare misurazioni della corrente di deformazione della sorgente nell'intervallo di temperature selezionate in condizioni di turnover e non turnover utilizzando il bipotenziostato.A tale scopo, impostare e tenere premuto l'IDA sul potenziale di gate che produce la massima corrente condotta utilizzando il bipotenziostato. Registrare la corrente massima condotta utilizzando il bipotenziostato mentre la temperatura viene ciclica tra l'intervallo di temperature selezionato utilizzando i comandi integrati del bagno d'acqua o dell'incubatrice. Passare la temperatura da un set point all'altro e viceversa utilizzando i comandi di bordo dell'incubatrice o del bagnomaria.Questo determina la reversibilità della reazione per garantire che il ciclo di temperatura non danneggi il biofilm. Infine, reimpostare la temperatura alla normale temperatura di crescita e consentire al sistema di stabilizzarsi. Qui sono mostrati i risultati rappresentativi di un IDA che funziona correttamente in un mezzo di acqua dolce.Rispetto a uno in cui gli elettrodi sono stati cortocircuitati. Le misure di gating elettrochimico rappresentative eseguite su un biofilm di Geobacter sulfur riducono in condizioni di non turnover con una tensione di deformazione della sorgente di 10 millivolt mostrano la corrente condotta a forma di picco rispetto alla curva del potenziale di gate caratteristica della conducibilità redox. Qui, i dati grezzi rappresentativi mostrano la dipendenza della corrente condotta dalla temperatura del mezzo del reattore.La diminuzione della corrente condotta al diminuire della temperatura è un'altra caratteristica dei conduttori redox. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di assicurarsi che le bande IDA non siano in cortocircuito prima di inoculare il reattore.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia quando viene applicata per studiare come interrompere il metabolismo cellulare dei patogeni che formano biofilm. Questa procedura può essere applicata a qualsiasi materiale vivente in grado di trasportare elettroni al fine di affrontare ulteriori questioni, come la correlazione tra refologia del biofilm e conducibilità.

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