Caratterizzazione di trasporto dell'elettrone attraverso biofilm vivente

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è determinare la quantità di corrente che può essere condotta attraverso un materiale vivente in situ, nonché il meccanismo impiegato dal materiale vivente per trasportare la corrente. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'elettrochimica microbica come: come possono alcuni biofilm spostare gli elettroni per centinaia di micron per supportare il metabolismo cellulare? Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli elettrodi interdigitati forniscono un rapporto segnale/rumore molto elevato e possono essere scalati per adattarsi a molte configurazioni di reattori diverse.

Questi metodi possono fornire informazioni sul trasporto di elettroni extracellulari di lunghezza multicellulare nei biofilm. Può essere applicato anche ad altri sistemi, come i film polimerici elettricamente conduttivi. I ricercatori nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché richiede un bipotenziostato per impostare separatamente i potenziali di entrambi gli elettrodi e misurare la corrente su ciascun elettrodo separatamente.

Per iniziare, è necessario ottenere elettrodi IDA disponibili in commercio modellati su un substrato non conduttivo o sintetizzarli utilizzando metodi litografici standard. Preparare la resina epossidica d'argento conduttiva secondo le istruzioni del produttore con un'asta di miscelazione o un puntale per pipetta. Quindi, posiziona un filo su ciascun cuscinetto d'oro e fissali in posizione usando del nastro adesivo.

Coprire il filo e il tampone con resina epossidica d'argento utilizzando un'asta di miscelazione o un puntale per pipetta. Spostare con cautela l'apparecchio in un forno a 80 gradi Celsius per un'ora per indurire. Dopo l'indurimento della resina epossidica, utilizzare un multimetro per garantire la conduttività elettrica tra l'estremità del filo e i cuscinetti.

La resistenza tra il filo e le piazzole deve essere inferiore a cinque ohm. Inoltre, utilizzare il multimetro per verificare che nessuna resina epossidica conduttiva stia collegando più elettrodi, in quanto ciò può cortocircuitare l'array. Se la resina epossidica conduttiva collega più cavi, utilizzare il graffietto per isolare i cavi.

Quindi, rimuovere la punta di una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri da utilizzare come stampo per il materiale isolante. Usa un ago calibro 21 per fare due piccoli fori sul fondo dello stampo attraverso i quali i fili devono sporgere. Inserire l'IDA nello stampo e inserire i fili attraverso i fori sul fondo dello stampo.

Successivamente, preparare un materiale isolante termico, elettrico e impermeabile. Le resine poliuretaniche ritardanti di fiamma sono spesso adatte. Pipettare l'isolante nello stampo in modo che la resina epossidica d'argento sia completamente coperta e lasciare asciugare l'isolante secondo le specifiche del produttore.

Per configurare la cella elettrochimica, inserire l'IDA, il controelettrodo e l'elettrodo di riferimento nella cella elettrochimica. Riempire la cella elettrochimica con un terreno sterile adatto alla crescita del biofilm. Per il Geobacter sulfurreducens, utilizzare un mezzo di acqua dolce escluso il fumarato.

Quindi, collegare gli elettrodi a un bipotenziostato. Collegare un elettrodo IDA al cavo di lavoro, l'altro elettrodo IDA al cavo di lavoro, due, l'elettrodo di riferimento al cavo di riferimento e il controelettrodo al controelettrodo. Eseguire un esperimento di controllo eseguendo la voltammetria ciclica sull'elettrodo uno e tenendo l'elettrodo due a circuito aperto per assicurarsi che gli elettrodi non siano collegati.

Per far crescere il biofilm elettroattivo pertinente, inoculare il reattore elettrochimico da una coltura madre o dall'arricchimento dei microrganismi elettrochimicamente attivi desiderati utilizzando tecniche microbiologiche asettiche standard. Per i test standard, inoculare in un rapporto da 1 a 20 tra il volume dell'inoculo e il reattore. Impostare l'agitazione nel reattore al livello desiderato e impostare l'incubatrice o il bagno d'acqua alla temperatura desiderata in base alle condizioni di crescita del biofilm di interesse.

Incubare il sistema in base alle esigenze specifiche del microrganismo di interesse fino a quando il biofilm non colma lo spazio che separa i due elettrodi. Per il biofilm Stazionario Geobacter sulfurducens, incubare per sette-dieci giorni a 30 gradi Celsius. Iniziare l'impostazione dei parametri sperimentali che verranno utilizzati per determinare l'attuale dipendenza dal potenziale per le misure di gating come descritto nel protocollo di testo.

Impostare il software bipotenziostato per eseguire le misure di gating nell'intervallo selezionato alla tensione di drain della sorgente selezionata e alla velocità di scansione desiderata. Inoltre, eseguire una misurazione di base come descritto nel protocollo di testo. Eseguire misure di gating utilizzando le stesse condizioni in caso di turnover con donatore o accettore di elettroni solubili presente in non-turnover senza condizioni di donatore o accettore di elettroni solubili.

Procurarsi un reattore di controllo per garantire che il set point e la temperatura effettiva del fluido siano gli stessi. Metti un termometro o una termocoppia in un reattore di controllo dove si troverebbe l'IDA. Quindi, effettuare misurazioni della corrente di deformazione della sorgente nell'intervallo di temperature selezionate in condizioni di turnover e non turnover utilizzando il bipotenziostato.

A tale scopo, impostare e tenere premuto l'IDA sul potenziale di gate che produce la massima corrente condotta utilizzando il bipotenziostato. Registrare la corrente massima condotta utilizzando il bipotenziostato mentre la temperatura viene ciclica tra l'intervallo di temperature selezionato utilizzando i comandi integrati del bagno d'acqua o dell'incubatrice. Passare la temperatura da un set point all'altro e viceversa utilizzando i comandi di bordo dell'incubatrice o del bagnomaria.

Questo determina la reversibilità della reazione per garantire che il ciclo di temperatura non danneggi il biofilm. Infine, reimpostare la temperatura alla normale temperatura di crescita e consentire al sistema di stabilizzarsi. Qui sono mostrati i risultati rappresentativi di un IDA che funziona correttamente in un mezzo di acqua dolce.

Rispetto a uno in cui gli elettrodi sono stati cortocircuitati. Le misure di gating elettrochimico rappresentative eseguite su un biofilm di Geobacter sulfur riducono in condizioni di non turnover con una tensione di deformazione della sorgente di 10 millivolt mostrano la corrente condotta a forma di picco rispetto alla curva del potenziale di gate caratteristica della conducibilità redox. Qui, i dati grezzi rappresentativi mostrano la dipendenza della corrente condotta dalla temperatura del mezzo del reattore.

La diminuzione della corrente condotta al diminuire della temperatura è un'altra caratteristica dei conduttori redox. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di assicurarsi che le bande IDA non siano in cortocircuito prima di inoculare il reattore.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia quando viene applicata per studiare come interrompere il metabolismo cellulare dei patogeni che formano biofilm. Questa procedura può essere applicata a qualsiasi materiale vivente in grado di trasportare elettroni al fine di affrontare ulteriori questioni, come la correlazione tra refologia del biofilm e conducibilità.