Visualizzazione Frequenza Stromule con microscopia a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare e determinare la frequenza delle stromule mediante microscopia a fluorescenza confocale su cellule vive all'interno delle foglie e di osservare le stromule in vitro utilizzando cloroplasti estratti da foglie. Questi metodi sperimentali possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia cellulare vegetale e nella ricerca sui cloroplasti, scoprendo come funzionano le stromule. Il principale vantaggio di queste tecniche consiste nella capacità di produrre dati riproducibili e robusti, anche per strutture cloroplastidiali altamente dinamiche come queste.

L'idea per lo studio sull'isolamento dei cloroplasti è nata dal fatto che alcune ricerche suggerivano che la formazione dei stromuli richiedesse strutture citoplasmatiche, come il citoscheletro, per svilupparsi. Abbiamo quindi deciso di omogeneizzare la cellula e verificare se i stromuli potessero formarsi comunque. Per preparare i campioni di foglia, iniziare utilizzando una lametta molto affilata per tagliare una piccola sezione di una foglia di Nicotiana benthamiana.

Immediatamente dopo aver tagliato la sezione della foglia, immergerla in una siringa da cinque millilitri riempita d'acqua. Successivamente, rimuovere l'aria dalla siringa ed applicare un vuoto coprendo con un dito l'orifizio della siringa, quindi tirare lo stantuffo. Rilasciare delicatamente lo stantuffo per evitare di danneggiare la sezione della foglia.

Quindi ripetere la rimozione dell'aria due o tre volte, o fino a quando l'aria non sarà stata completamente eliminata e la foglia apparirà di un verde scuro. Aggiungere una goccia d'acqua su un vetrino e posizionare il campione di foglia sulla goccia. Successivamente, aggiungere un'altra goccia d'acqua sopra il campione di foglia e applicare un coprioggetto.

Se sono presenti bolle d'aria, battere leggermente sul coprivetrino fino a quando non vengono eliminate. Utilizzando la luce trasmessa e un obiettivo 20x, mettere a fuoco un campo visivo vicino al centro della sezione della foglia, visualizzando contemporaneamente più cloroplasti. Salvare un'immagine con luce trasmessa, in modo che i tipi cellulari possano essere distinti successivamente, se necessario.

Quindi passare all'illuminazione laser con i filtri di eccitazione e di emissione appropriati per il fluorocromo utilizzato e salvare un'altra immagine. Utilizzando il software del microscopio, selezionare il canale GFP e fare clic per regolare l'apertura del diaframma su un'unità airy. Selezionare la scansione laser per iniziare a visualizzare il campione, quindi fare clic sul canale GFP e sul guadagno del rivelatore per minimizzare la potenza del laser pur continuando a visualizzare chiaramente le stromule.

Successivamente, preparare un esperimento con stack Z che acquisirà la serie di immagini attraverso l'epidermide della foglia nel campo visivo. Regolare la velocità di scansione e la risoluzione dell'immagine secondo necessità per assicurare che lo stack Z venga acquisito rapidamente. Quindi salvare lo stack Z per analisi successive.

Utilizzando ImageJ, unire lo stack Z in un'unica immagine mediante l'intensità massima nel software. Quindi identificare e contare manualmente tutti i cloroplasti nell'immagine. Per ciascun cloroplasto, determinare visivamente se uno o più stromuli risultano estesi dal cloroplasto nell'immagine dello stack Z fuso.

Per estrarre cloroplasti integri, preparare un tampone di estrazione freddo utilizzando i seguenti reagenti. Quindi, con NaOH e HCl, regolare il pH a 6,9 e refrigerare prima dell'uso. Preparare il tampone di isolamento e regolare il pH a 7,6.

Se le foglie non esprimono uno stromofluoroforo codificato geneticamente, preparare una soluzione di carbossifluoresceina diacetato, o CFDA. Per isolare i cloroplasti, rimuovere circa 5-10 grammi di foglie da diverse piante e sciacquarli brevemente in acqua fredda. Successivamente trasferire immediatamente le foglie in 50 millilitri di tampone di estrazione freddo.

Utilizzando un frullatore con diversi impulsi brevi, macinare le foglie, quindi filtrare la miscela attraverso due o tre strati di garza per rimuovere i detriti fogliari. Dividere i cloroplasti estratti in due provette da centrifuga da 50 millilitri e centrifugare per un minuto a 750 x g. Scartare il soprannatante e utilizzare 10 millilitri di tampone di isolamento per risospendere i cloroplasti verdi.

Quindi centrifugare nuovamente per un minuto a 750 x g, scartare il soprannatante e utilizzare il buffer di isolamento per risospendere i cloroplasti fino a un volume finale di cinque millilitri. Se i cloroplasti provengono da piante transgeniche che esprimono proteine fluorescenti indirizzate ai plastidi, trasferire 20 microlitri dei cloroplasti su un vetrino e aggiungere un coprioggetto. Quindi eseguire la microscopia.

Per colorare i cloroplasti da piante che non esprimono proteine fluorescenti mirate ai plastidi, aggiungere cinque microlitri di soluzione madre di CFDA 50 millimolare ai cinque millilitri di cloroplasti nel buffer di isolamento. Dopo aver lasciato incubare i cloroplasti per cinque minuti, trasferire un piccolo aliquota su un vetrino, aggiungere un coprioggetto ed eseguire la microscopia. Infine, utilizzare un filtro FITC o GFP e un obiettivo 20x per visualizzare contemporaneamente più cloroplasti.

O un obiettivo più ingrandito per visualizzare un singolo cloroplasto isolato. Qui viene mostrata una sovrapposizione di immagini che illustra la frequenza dei stomuli GFP nella codoledenza di giovani piantine di N. benthamiana. In questo pannello, l'immagine è stata desaturata e invertita in modo che lo stroma appaia nero.

I cloroplasti sono stati etichettati come privi di stromuli oppure come dotati di almeno uno stromulo. Dei 87 cloroplasti epidermici visualizzati, 33 presentano stromuli, con una frequenza del 37,9 percento in questa foglia. Questo grafico rappresenta l'analisi di oltre 23.000 cloroplasti e di diverse centinaia di cellule provenienti da una singola foglia di 21 piante diverse.

La frequenza media delle stromule durante il giorno è stata del 20,8 ± 1,8 percento, e la frequenza media notturna delle stromule è stata del 12,8 ± 0,9 percento, indicando una frequenza diurna significativamente più elevata, come determinato dal test T di Welch. In questa figura, le stromule dei cloroplasti sono state osservate in vitro dopo l'isolamento da N.benthamiana che esprimeva GFP localizzato nei plastidi, oppure dopo l'uso di CFDA per colorare i cloroplasti da N.benthamiana o da Spinachia oleracea. Durante l'analisi in tempo reale delle stromule, è importante lavorare rapidamente e manipolare il tessuto vegetale il meno possibile.

Al termine di questa procedura, altri metodi come il silenziamento genico o trattamenti chimici possono essere utilizzati per identificare ulteriori fattori molecolari o vie coinvolte nella formazione e nella funzione delle stromule. Questa tecnica è stata impiegata da ricercatori nel campo della biologia cellulare vegetale e dell'immunità vegetale per studiare il ruolo delle stromule nelle vie di segnalazione cellulare e nelle risposte delle piante ai patogeni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come calcolare la frequenza delle stromule in una foglia e di come osservare le stromule nei cloroplasti isolati.

Ricordare che i laser e la tensione elettrica che alimentano un microscopio confocale a scansione elettronica possono essere estremamente pericolosi, ed è fondamentale comprendere i requisiti del sistema per l'utilizzo di questa apparecchiatura.