Visualizzazione Frequenza Stromule con microscopia a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare e determinare la frequenza degli stromuli utilizzando la microscopia a fluorescenza confocale su cellule vive all'interno delle foglie e per visualizzare gli stromuli in vitro utilizzando cloroplasti estratti dalle foglie. Questi metodi sperimentali possono aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia delle cellule vegetali e nella ricerca sui cloroplasti, scoprendo come funzionano gli stromuli. Il vantaggio principale di queste tecniche è che producono dati riproducibili e robusti, anche di queste strutture di cloroplasti altamente dinamiche.

Abbiamo avuto l'idea per lo studio sull'isolamento dei cloroplasti perché alcune ricerche suggerivano che la formazione di stromuli richiedeva la formazione di strutture citosoliche, come il citoscheletro. Così abbiamo deciso di fondere la cellula e vedere se gli stromuli potevano ancora formarsi. Per preparare campioni di foglie, inizia usando una lama di rasoio molto affilata per tagliare una piccola sezione di una foglia di Nicotiana benthamiana.

Subito dopo aver tagliato la sezione fogliare, immergerla in una siringa da cinque millilitri piena d'acqua. Quindi, rimuovere l'aria dalla siringa e applicare un vuoto usando un dito per coprire l'orifizio della siringa, prima di tirare lo stantuffo. Rilasciare delicatamente lo stantuffo per evitare di danneggiare la sezione dell'anta.

Quindi ripetere la rimozione dell'aria due o tre volte, o fino a quando l'aria non è stata rimossa e la foglia appare di un verde intenso. Aggiungi una goccia d'acqua a uno scivolo e posiziona la sezione della foglia sulla goccia. Quindi aggiungi un'altra goccia d'acqua sulla parte superiore della foglia e aggiungi un vetrino coprioggetti.

Se sono presenti bolle d'aria, picchiettare delicatamente il vetrino coprioggetto fino a quando non vengono rimosse. Con la luce trasmessa e un obiettivo 20x, è possibile concentrarsi su un campo visivo vicino al centro della sezione fogliare, visualizzando più cloroplasti contemporaneamente. Salvare un'immagine con luce trasmessa, in modo da poter distinguere i tipi di cella in un secondo momento, se necessario.

Quindi passare all'illuminazione laser con i filtri di eccitazione ed emissione appropriati per il fluoroforo in uso e salvare un'altra immagine. Utilizzando il software del microscopio, selezionare il canale GFP e fare clic per regolare l'apertura del foro stenopeico su un'unità ariosa. Selezionare la scansione laser per iniziare a visualizzare il campione, quindi fare clic sul canale GFP e sul guadagno del rivelatore per ridurre al minimo la potenza del laser pur visualizzando chiaramente gli stromuli.

Successivamente, prepara un esperimento Z stack che raccoglierà la serie di immagini attraverso l'epidermide fogliare nel campo visivo. Regolare la velocità di scansione e la risoluzione dell'immagine in base alle esigenze per assicurarsi che la pila Z venga raccolta rapidamente. Quindi salva lo stack Z per un'analisi successiva.

Utilizzando l'immagine J, unisci la pila Z in un'unica immagine utilizzando l'intensità massima nel software. Quindi identifica e conta manualmente tutti i cloroplasti nell'immagine. Per ogni cloroplasto, determinare visivamente se si vedono uno o più stromuli estendersi dal cloroplasto nell'immagine della pila Z unita.

Per estrarre i cloroplasti intatti, preparare il tampone di estrazione a freddo utilizzando i seguenti reagenti. Quindi, con NaOH e HCl, regolare il pH a 6,9 e conservare in frigorifero prima dell'uso. Preparare il tampone di isolamento e regolare il pH a 7,6.

Se le foglie non esprimono uno stromofluoroforo geneticamente codificato, preparare il diacetato di carbossifluoresceina o la soluzione di CFDA. Per isolare i cloroplasti, rimuovere circa 5-10 grammi di foglie da diverse piante e sciacquare brevemente in acqua fredda. Quindi trasferire immediatamente le foglie in 50 millilitri di tampone di estrazione a freddo.

Usando un frullatore con diversi impulsi brevi, macina le foglie, quindi filtra il composto attraverso due o tre strati di garza per rimuovere i detriti delle foglie. Dividere il cloroplasto estratto in due provette da centrifuga da 50 millilitri e centrifugare per un minuto a 750 x g. Scartare il surnatante e utilizzare 10 millilitri di tampone isolante per risospendere i cloroplasti verdi.

Quindi centrifugare di nuovo per un minuto a 750 x g, scartare il surnatante e utilizzare il tampone di isolamento per risospendere i cloroplasti fino a un volume finale di cinque millilitri. Se i cloroplasti provengono da piante transgeniche che esprimono proteine fluorescenti mirate ai plastidi, trasferire 20 microlitri di cloroplasti su un vetrino e aggiungere un vetrino coprioggetti. Quindi eseguire la microscopia.

Per colorare i cloroplasti di piante che non esprimono proteine fluorescenti mirate ai plastidi, aggiungere cinque microlitri di stock CFDA da 50 millimolari ai cinque millilitri di cloroplasti in tampone di isolamento. Dopo aver lasciato incubare i cloroplasti per cinque minuti, trasferire una piccola aliquota su un vetrino, aggiungere un vetrino coprioggetti ed eseguire la microscopia. Infine, utilizzare un set di filtri FITC o GFP e un obiettivo 20x per visualizzare più cloroplasti contemporaneamente.

O un obiettivo più alto per visualizzare un singolo cloroplasto isolato. Qui è mostrata una pila unita che mostra la frequenza degli stomuli GFP nella dodoledenza di giovani piantine di N.Benthamiana. In questo pannello, l'immagine è stata desatura e invertita in modo che lo stroma appaia nero.

I cloroplasti sono stati etichettati come privi di stromuli o con almeno uno stromule. Degli 87 cloroplasti epidermici visualizzati, 33 hanno stromuli, per una frequenza del 37,9 per cento in questa foglia. Questo grafico rappresenta l'analisi di oltre 23.000 cloroplasti e diverse centinaia di cellule da una singola foglia di 21 piante diverse.

La frequenza media degli stromuli durante il giorno era di 20,8 più o meno l'1,8 per cento, e la frequenza media degli stromuli notturni era di 12,8 più o meno lo 0,9 per cento, indicando una frequenza diurna significativamente più alta, come determinato dal test T di Welch. In questa figura, sono stati osservati stromuli di cloroplasti in vitro dopo l'isolamento da N.benthamiana che esprime GFP mirata ai plastidi, o dopo l'uso di CFDA per colorare i cloroplasti di N.benthamiana o Spinachia oleracea. Durante l'esecuzione dell'imaging di stromuli su cellule vive, è importante lavorare rapidamente e manipolare il meno possibile il tessuto vegetale.

Seguendo questa procedura, altri metodi come il silenziamento genico o i trattamenti chimici possono essere utilizzati per scoprire ulteriori attori molecolari o percorsi coinvolti nella formazione e nella funzione degli stromuli. Questa tecnica è stata utilizzata dai ricercatori nel campo della biologia cellulare delle piante e dell'immunità delle piante per studiare il ruolo degli stromuli nelle vie di segnalazione cellulare e nelle risposte delle piante ai patogeni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come calcolare la frequenza degli stromuli in una foglia e di come osservare gli stromuli nei cloroplasti estratti.

E ricorda che i laser e la tensione elettrica che alimenta un microscopio confocale elettronico a scansione possono essere estremamente pericolosi ed è importante comprendere i requisiti di sistema per l'utilizzo di questa apparecchiatura.