Name: Alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale Zebrafish: Alimentazione, limaging dal vivo, e la quantificazione del cibo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Scopri come preparare pasti lipidici per larve di Danio rerio e utilizzare analoghi lipidici fluorescenti per l'imaging dal vivo. Questo metodo consente di quantificare l'assunzione alimentare e studiare il metabolismo dei lipidi.

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Gli autori ringraziano Meng-Chieh Shen per le immagini, Jennifer Anderson per aver fornito utili commenti sul manoscritto e i membri del laboratorio Farber per i loro contributi nello sviluppo di queste tecniche. Questo studio è stato finanziato da NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F) e F32DK096786 (J.P.O.). Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali di NIH. Un ulteriore sostegno è stato fornito dalla G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation al laboratorio della S.A.F e alla Carnegie Institution for Science endowment.

Questi protocolli sono stati approvati dalla Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care e del Comitato Usa (Protocollo n. 139). 1. Preparazione degli animali <ol><li> Mantenere gli adulti e le larve a 28 ° C su un 14 hr: luce 10 ore: ciclo scuro. Nutrire gli adulti due volte al giorno con Artemia guscio prive (decapsulated, non tratteggio, a partire da 14 DPF) e micropellet commerciali. </li><li> Questi protocolli sono ottimizzati per l&#39;uso di 6-7 dpf larve raccolte dalla riproduzione naturale dello sfondo AB. I protocolli possono essere modificati per le larve di altre età e provenienza. Non fornire cibo esogeno prima del 6 dpf. </li><li> Anestetizzare larve con Tricaine in mezzi dell&#39;embrione (EM) (4,2 ml di 4 mg / ml Tricaine per 100 ml EM) a temperatura ambiente (RT). </li></ol> 2. Preparazione di ricchi di lipidi tuorlo d&#39;uovo feed <ol><li> Preparare e memorizzare i tuorli d&#39;uovo di pollo. Separare il tuorlo e bianco di 12 uova di gallina. Pool i tuorli, aliquota 1 ml in 1,5tubi ml e conservare a -80 ° C fino a 1 anno (12 tuorli faranno ~ 80 aliquote). PISCINA La bianchi, negozio, e usare come, mangimi ricchi di proteine ​​lipidi-poveri. </li><li> Preparare analogico lipide fluorescente (s) da aggiungere al feed tuorlo se desiderato. <ol><li> Sospendere l&#39;acquistato, in polvere analogico lipidi fluorescente in 100% di etanolo o il 100% cloroformio a 0,1 mg / mL (vedi nota seguente discutere solventi), aliquota in tubi di vetro opaco, sigillare con parafilm e conservare il prodotto secondo le istruzioni del produttore. A causa della rapida evaporazione dei solventi organici non utilizzare volumi di aliquote inferiori a ~ 400 microlitri per l&#39;archiviazione a lungo termine. Nota: Se l&#39;analogo lipidico viene sospeso in etanolo, grandi volumi di analogico lipidi saranno utilizzati perché si asciuga velocemente sotto N 2 di cloroformio. Se l&#39;analogo lipidico viene sospeso in etanolo non deve essere essiccato e risospeso prima di aggiungerlo al feed liposomi nel passaggio 2.2.4, ma la concentrazione totale di etanolo non deve superare 0.1% nel feed liposomi per evitare effetti fisiologici potenzialmente confondenti di etanolo. </li><li> Per analoghi di acidi grassi fluorescenti: Preparare un volume totale di 20 ml 5% emulsione di tuorlo d&#39;uovo in EM. Da quel preparare 5 ml aliquote con una concentrazione finale di 6,4 mM 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene (BODIPY C 16) per saggi di imaging confocale vivo e assunzione di cibo o 1 mg / ml BODIPY C 12 per l&#39;imaging stereomicroscopio. Trasferire la quantità desiderata di analogico lipide fluorescente in un tubo di plastica da 1,5 ml. Essiccare il lipide in corrente di N 2, avendo cura di non soffiare il lipide dal tubo. </li><li> Immediatamente, risospendere in 5 ml di etanolo al 100% pipettando un torrente lungo i lati del tubo, aggiungere 95 ml di EM, e mescolare bene. Nota: La miscela deve apparire omogeneo; se lipidi colorato rimane sui lati del tubo o il liquido non appare clumpy, il lipide non ha pienamente solubilizzazione e richiede più etanolo. Proteggere il tubo di from luce e conservare su ghiaccio. </li><li> Per fluorescente analogico colesterolo: preparare una concentrazione finale di colesterolo 2,4 mg / ml in 5 ml 0,5-5% di tuorlo d&#39;uovo emulsione per studi di imaging dal vivo. Trasferire la quantità desiderata del colesterolo in un tubo di plastica da 1,5 ml. Essiccare il lipide in corrente di N 2, avendo cura di non soffiare il lipide dal tubo. </li><li> Immediatamente, risospendere in 15 ml di RT 100% di etanolo pipettando un torrente lungo i lati del tubo e mescolare con 85 ml di RT 1% grassi BSA privi di acido in H 2 O. purificato Proteggere il tubo dalla luce e memorizzare sul ghiaccio. </li></ol></li><li> Preparare tuorlo d&#39;uovo liposomi Feed. <ol><li> Aggiungere un&#39;aliquota scongelato di tuorlo d&#39;uovo EM in una provetta conica da 50 ml. Agitare la miscela di tuorlo diluito per 1-2 minuti; la miscela deve apparire come una emulsione omogenea. </li><li> Versare il composto attraverso un colino a maglia fine per rimuovere conglomerati proteici e raccogliere in un nuovo, da 50 ml tubo conico fresco. </li><li> Sonica PulseTE il composto di uova con un microtip rastremata un quarto di pollice (5 volte (5 x 1 sec su, 1 sec spento), fermandosi 5-10 secondi tra ogni serie; intensità di uscita: 6 W) a temperatura ambiente per creare liposomi. impostazioni di alimentazione sonicator sono strumento dipendente e richiedono pertanto l&#39;ottimizzazione per ogni strumento e microtip. Nota: continuamente il rock miscela liposomi a temperatura ambiente per mantenere l&#39;omogeneità fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Aggiungere l&#39;analogo lipide fluorescente per i liposomi tuorlo d&#39;uovo, se desiderato. Subito dopo sonicazione, pipettare i lipidi preparati nella miscela liposomi e vortex ad alta velocità per 30 secondi per incorporare nei liposomi. Proteggere la miscela dalla luce avvolgendo il tubo in carta stagnola e continuare a dondolo a temperatura ambiente. </li></ol> 3. alimentazione Paradigma <ol><li> Preparare le larve per l&#39;alimentazione. <ol><li> Prima di iniziare il feed, larve schermo per difetti morfologici evidenti che possono ostacolare l&#39;alimentazione. Trasferimento larve di 60 mm x 15 mm piastre Petri o 6 o 12 ben plates, ridurre EM al minimo, e sostituirlo con 5 ml della soluzione di liposomi preparata. </li><li> Se necessario, trasferire digiuni larve di controllo al 5 ml EM e / o 5 ml 5% albume in EM e trattare in parallelo. </li></ol></li><li> Agitare delicatamente le larve in una sedia a dondolo in incubazione (29-31 ° C a 30 giri al minuto) negli alimenti per favorire l&#39;assunzione di cibo, pur continuando a proteggere dalla luce se analoghi lipidici fluorescenti sono presenti. Se necessario le larve di essere esposti alla luce, ridurre al minimo l&#39;esposizione con una copertura in vetro colorato incubatore. </li><li> Alla fine del periodo di alimentazione, risciacquare le larve nuotano liberamente in EM 3 volte. Nota: Le larve può iniziare consumando liposomi in qualsiasi momento durante l&#39;avanzamento. Se è fondamentale che le larve iniziare alimentando contemporaneamente, protezione per l&#39;assunzione di cibo (vedi 3.4) dopo 1 ora di avanzamento e di ritorno solo larve che hanno iniziato alimentando all&#39;emulsione tuorlo d&#39;uovo per completare l&#39;alimentazione. </li><li> Schermo le larve a questo punto per l&#39;assunzione di cibo come un piccolo numero non può EAt (generalmente ~ 0-5%). Esaminate l&#39;intestino delle larve che sono stati anestetizzati o leggermente raffreddati su un blocco di metallo su ghiaccio per determinare se sono alimentati: larve che hanno consumato liposomi avrà un intestino oscurata (Figura 1). </li><li> Immagine o un processo larve per l&#39;assunzione di cibo immediatamente. In alternativa, posto larve in acqua dolce EM e incubare a 28 ° C per permettere l&#39;elaborazione metabolico a verificarsi. </li></ol> 4. Montaggio Le larve per Live Imaging <ol><li> Preparare il supporto di montaggio. <ol><li> Per 3% metilcellulosa: aggiungere 0,75 g metilcellulosa a 25 ml di ebollizione vicino EM, vortice, roccia a temperatura ambiente 2-3 giorni fino a completa dissoluzione, e conservare a 4 ° C per anni a -20 ° C. ripetuti cicli di congelamento e scongelamento a 4 ° C rimuoveranno le bolle d&#39;aria. Conservare 3% metilcellulosa sul ghiaccio durante il montaggio larve. </li><li> Per 1,2% a basso monte agarosio: aggiungere 0,3 g di bassa fondere agarosio a 25 mL EM e sciogliere portando ad ebollizione, un&#39;aliquota in 2 ml tUBE, e mantenere a 26-28 ° C su un blocco di calore. aliquote non utilizzati possono essere conservati a temperatura ambiente oa -20 ° C e bollito di nuovo al momento dell&#39;uso. Assicurarsi che agarosio è abbastanza fresco da gestire prima di esporlo a larve o possono essere riscaldato eccessivamente. </li></ol></li><li> Per basso ingrandimento, medio-throughput imaging dal vivo, inserire un vetrino su un tessuto su un blocco di metallo su ghiaccio e attendere la diapositiva raffreddare. Applicare una generosa quantità del 3% metil cellulosa (che è stata mantenuta a 4 ° C in ghiaccio) sul vetrino, trasferire una larva sul metilcellulosa 3%, utilizzando un poker lenza (lenza diametro 0,41 millimetri incollato al all&#39;estremità di un tubo capillare di vetro) creare un troth per drenare l&#39;eccesso EM (in modo che metilcellulosa non diluito) e posizionare le larve come desiderato. </li><li> Per breve termine (&lt;20 min), ad alto ingrandimento di immagini dal vivo con un obiettivo in posizione verticale di emersione olio, montare le larve con il vetrino tettoia metodo. <ol><li> Utilizzare colla a base di cianoacrilato (supercolla) percollegare aa 22 mm x 30 millimetri coprioggetto ad una estremità di un vetrino. Utilizzare un poker per mettere una sottile linea di 3% metilcellulosa sulla diapositiva adiacente al vetrino e trasferire le larve alla slitta con un ampio foro Pasteur pipetta. Rimuovere l&#39;eccesso EM in modo da non diluire la metilcellulosa. </li><li> Utilizzando una mazza, posizionare delicatamente larve in metilcellulosa sui loro lati (lato sinistro fino a un&#39;immagine più del fegato, destra rivolto verso l&#39;alto per l&#39;immagine della cistifellea) con la testa accanto al coprioggetto. </li><li> Spot superglue negli angoli di un secondo vetrino e delicatamente posto un bordo del vetrino sul vetrino montato e l&#39;altra sul vetrino, colmando le larve. Fare attenzione a non applicare una pressione eccessiva durante questo passaggio o con l&#39;obiettivo, mentre per immagini in modo che le larve rimanere illeso. </li></ol></li><li> Per lungo termine, immagini ad alto ingrandimento con un obiettivo ad immersione in posizione verticale, montare le larve in agarosio. Aggiungere una larva di una piccola aliquota di 1,2% bassa temperatura di fusione agarosio quindi trasferire illarva in un piccolo volume di agarosio ad una piastra di Petri. <ol><li> posizionare rapidamente le larve con un poker prima i solidifica agarosio. Lasciare che il agarosio asciugare per 2-3 minuti e coprire l&#39;agarosio pienamente fresca EM per evitare che si secchi. </li></ol></li><li> Per lungo termine, immagini ad alto ingrandimento con un obiettivo invertito, montare larve su un piatto di vetro-bottom in agarosio. <ol><li> Raffreddare un blocco metallico su ghiaccio. Porre la capsula sul blocco metallico separati da un tessuto per impedire il raffreddamento eccessivo e larvale congelamento. Trasferire una larva al piatto e rimuovere la EM wicking con un tessuto. </li><li> Mettere una goccia di 28 ° C bassofondente agarosio (1,2%) al di sopra della larva e subito posizionare con una mazza (lato sinistro verso il basso per migliore immagine fegato, lato destro verso il basso per l&#39;immagine della cistifellea). Rimuovere piatto dal blocco freddo, lasciare asciugare per 2-3 minuti, e aggiungere un volume sufficiente di EM fresco per coprire l&#39;agarosio (~ 2-5 ml). </li></ol></li></ol> Intake 5. Il cibosaggio <ol><li> Al termine di un feed liposomi tuorlo contenente 6,4 mM BODIPY C 16, in comune un minimo di 10 larve lavato in un tubo di plastica da 1,5 o 2 ml, togliere EM, e scattare congelamento. I campioni possono essere conservati a -80 ° C al riparo dalla luce per diversi mesi. Nota: Se possibile, raccogliere più replicati. È importante raccogliere larve unfed in questa fase per normalizzare per sfondo lipidi fluorescenza (idealmente larve della frizione stessa vengono utilizzati). </li><li> Eseguire una versione modificata Bligh-Dyer estrazione del grasso 3,21. <ol><li> Aggiungere 100 microlitri tampone di omogeneizzazione (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) per il campione sul ghiaccio (H 2 O in alternativa purificata può essere utilizzato). Omogeneizzare su ghiaccio con un sonicatore microtip (5 sec totale: 1 sec su 1 sec spento). Verificare che le larve sono completamente omogeneizzato; in caso contrario ripetere. Trasferire in una provetta di vetro cultura usa e getta ml 13 (altri tubi di vetro possono essere utilizzate). Nota: Il cloroformio è pericoloso; eseguire tutte le successive ex lipidifasi di trazione a temperatura ambiente in una cappa chimica. </li><li> Per ogni 100 ml di tampone di omogeneizzazione utilizzati, aggiungere 375 ml di 1: 2 (cloroformio: metanolo). Vortex 30-60 sec, incubare 10 minuti, aggiungere 125 ml di cloroformio per 100 buffer di omogeneizzazione microlitri usato, e vortex 30 sec. </li><li> Aggiungere 125 ml di 200 mM Tris pH 7.5 a 100 buffer di omogeneizzazione microlitri utilizzato, vortice 30 sec, e centrifugare (2.000 x g, 5 min, RT, protetto dalla luce). Rimuovere con attenzione i campioni dalla centrifuga. Verranno separati in due fasi: una fase acquosa superiore è, un&#39;interfaccia di detriti larvale, e una fase organica inferiore (contiene lipidi). </li><li> Con una pipetta di vetro pulita raccogliere fondo, fase organica e trasferirlo in una provetta pulita di vetro 13 ml. Nota: Fare attenzione ad evitare la fase acquosa e detriti larvale a livello di interfaccia; in caso di contaminazione, ripetere il passaggio centrifugazione e Rammentare. Eliminare la fase superiore, acquosa; può essere utile per rimuovere ed eliminare questofase prima di raccogliere la fase organica. Il campione può essere conservato a -80 ° C per un massimo di 1 mese. </li><li> Essiccare la fase organica sotto vuoto (0,12 atm) mentre protegge dalla luce. Non continuare ad asciugare i campioni dopo che il liquido è evaporato quanto ridurrà liposolubilità. Risospendere i lipidi in 2: 1 (cloroformio: metanolo) e memorizzare sul ghiaccio. Il volume ottimale del cloroformio: metanolo soluzione dipende dal metodo di rilevamento utilizzato; iniziare a bassa e continuare a diluire in base alle esigenze. Una linea guida generale è di usare 10 ml per 10 larve in pool. </li></ol></li><li> Trova le interi volumi di esempio in intervalli regolari su un piatto TLC incanalata e la scansione del piatto con uno scanner laser solitamente usata per l&#39;imaging biomolecolare (ad esempio, un lettore di piastre a fluorescenza). Per gli analoghi lipidici fluorescenti inclusi nella lista dei materiali che hanno un massimi di eccitazione 500-650 nm ed emissione massimi 510-665 nm, utilizzare un laser 488 nm e con la raccolta di emissione a 520 nm. <ol><li> Quantificare la fluorescenza totale di ogni spot con software di imaging. Nota: corretto per naturale sfondo lipidi fluorescenza sottraendo la fluorescenza di appaiati, campioni larvali digiuni. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le tecniche qui descritte permettono ai ricercatori di trattare zebrafish larvale con mangimi ricchi di lipidi, visualizzare trasformazione dei lipidi nella dieta in larve vive, e quantificare l&#39;assunzione di cibo larvale. Per garantire il successo, particolare attenzione deve essere data a diversi passaggi critici. uova di gallina commerciali variano; Per minimizzare la variabilità potenziale eseguiamo tutti i saggi su uova biologiche da polli privi di gabbia che non sono stati arricchiti per gli acidi grassi omega...

I meccanismi mediante i quali l&#39;intestino regola l&#39;elaborazione lipidico dietetico, fegato controlla complesso metabolismo sintesi dei lipidi e lipoproteine, e come questi organi funzionano con il sistema nervoso centrale per controllare l&#39;assunzione di cibo non sono completamente compresi. È di interesse biomedico per chiarire questo biologia alla luce delle epidemie attuali di obesità, malattie cardiovascolari, diabete e malattie del fegato grasso non-alcolica. Studi in colture cellulari e topi hanno fornito la maggior parte della nostra comprensione delle relazioni meccanicistiche tra lipidi alimentari e malattie, e zebrafish (Danio rerio) stanno emergendo come un modello ideale per completare questo lavoro. Zebrafish hanno gastrointestinale simile (GI) gli organi, il metabolismo dei lipidi, e il trasporto delle lipoproteine a vertebrati superiori a 1,2, si sviluppano rapidamente, e sono geneticamente trattabili. La chiarezza ottica del pesce zebra larvale facilita studi in vivo, una particulaR vantaggio per lo studio del sistema gastrointestinale come il suo ambiente extracellulare (vale a dire, la bile, microbiota, endocrino segnalazione) è praticamente impossibile per modellare ex vivo. In accordo, un corpo di ricerca che unisce la trattabilità genetica e conduciveness di vivere l&#39;imaging di larve di zebrafish con una varietà di manipolazioni dietetiche (alto contenuto di grassi, 3,4 -cholesterol 5, e diete -carbohydrate 6,7), e modelli di malattia cardiovascolare 8, diabete 9,10, steatosi epatica 11-13, 14-16 e l&#39;obesità, stanno emergendo per fornire una serie di approfondimenti metabolici. Un aspetto essenziale della transizione del pesce zebra larvale nella ricerca metabolica è l&#39;ottimizzazione delle tecniche sviluppate in altri animali modello per il pesce zebra e lo sviluppo di nuovi test che sfruttano i punti di forza del pesce zebra. Questo protocollo presenta le tecniche sviluppati e ottimizzati per alimentare zebrafish larvale un Lipiricco d-pasto, visualizzare trasformazione alimentare di lipidi da tutto il corpo per la risoluzione subcellulare, e misurare l&#39;assunzione di cibo. tuorlo d&#39;uovo di gallina è stato scelto per comporre il pasto ricco di lipidi in quanto contiene livelli elevati di grassi e colesterolo (lipidi compongono ~ 58% di tuorlo d&#39;uovo di gallina, di cui ~ 5% è il colesterolo, il 60% sono i trigliceridi, e il 35% sono fosfolipidi ). Tuorlo d&#39;uovo di gallina fornisce più grasso di prodotti tipici commerciali zebrafish micropellet (~ 15% di lipidi) e il vantaggio che si tratta di un feed standardizzato con percentuali note di specifiche specie di acidi grassi, come le diete zebrafish e reggimenti di alimentazione non sono stati standardizzati attraverso laboratori 17. Inoltre, analoghi lipidici fluorescenti fornite nel tuorlo d&#39;uovo visualizzare trasporto e accumulo di lipidi alimentari 18, componenti cellulari di immagine tra goccioline lipidiche agendo sia coloranti vitali 3 e attraverso covalente incorporazione in lipidi complessi, indagare metabolismo attraverso cromatografia su strato sottile (TLC) 19 </sup&gt; E la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) (SAF dati non pubblicati), e di fornire un metodo quantitativo per una totale assunzione di cibo 20.

<table><tbody><tr><td>Tricaina (sale di etile 3-amminobenzoato metanosulofnato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Anestesia per larve di pesce zebra</td></tr><tr><td>Uova di gallina</td><td>N/A</td><td>N/A Uova</td><td>biologiche, senza gabbia, non arricchite per acidi grassi omege-3</td></tr><tr><td>Processore ad ultrasuoni 3000 sonicatore</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>Per fare liposomi di tuorlo d'uovo</td></tr><tr><td>Custodia acustica Sonabox</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>Per fare liposomi di tuorlo d'uovo</td></tr><tr><td>1/8" microtip conico</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>Per fare liposomi di tuorlo d'uovo</td></tr><tr><td>Fiale di ambra (4 ml, vetro)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>Conservazione dei lipidi; include fiale, tappi aperti e setti per tappi</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini</td><td>Benchmark</td><td>1222U12</td><td>Agitatore incubato per mangimi</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>Analogo lipidico fluorescente; (acido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-esadecanoico)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>Analogo lipidico fluorescente; (acido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-dodecanoico)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>Analogo lipidico fluorescente; (acido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-pentanoico)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>Analogo lipidico fluorescente; (acido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionico)</td></tr><tr><td>Colesterolo TopFluor&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>810255</td><td>Analogo lipidico fluorescente; 23-(dipirrometenboro difluoruro)-24-norcolesterolo</td></tr><tr><td>BSA senza acidi grassi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>Per la solubilizzazione del colesterolo TopFluor</td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>Terreni di montaggio per imaging larvale dal vivo; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Terreni di montaggio per larve vive Imaging; Vetrini per microscopio VWR 22 x 30</td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td>Montaggio di larve per l'imaging dal vivo</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti&nbsp;</td><td>Vetro di copertura</td><td>12-544A</td><td>Larve di montaggio per imaging dal vivo</td></tr><tr><td>Super colla</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>Larve di montaggio per imaging dal vivo</td></tr><tr><td>FluoroDish (piatto con fondo in vetro)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>FD35-100</td><td>Montaggio di larve per imaging dal vivo; piatto da 35 mm, vetro da 23 mm, spessore del vetro da 0,17 mm. &nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica Microsytems</td><td>SP-2, SP-5</td><td>Microscopio per imaging dal vivo ad alto ingrandimento</td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>Nikon</td><td>SM21500</td><td>Microscopio per imaging dal vivo a basso ingrandimento</td></tr><tr><td>Provette per coltura in vetro&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>73500-13100</td><td>Estrazione dei lipidi; (13 x 100 mm; 13 ml)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Plus&nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A</td><td>Estrazione lipidica</td></tr><tr><td>Piastre TLC canalizzate</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821</td><td>Saggio di assunzione di cibo; LK5D Gel di silice 150 A, 20 x 20 cm, spessore 250 um; Fuori produzione</td></tr><tr><td>Piastre TLC canalizzate</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>Saggio di assunzione di cibo; Sostituzione diretta delle piastre TLC di Whatman Scientific</td></tr><tr><td>Imager a modalità variabile Typhoon 9410</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>Lettore di piastre fluorescenti per il test di assunzione di alimenti</td></tr><tr><td>Software ImageQuant</td><td>GE Healthcare</td><td>29000605</td><td>Analisi del test di assunzione di alimenti</td></tr><tr><td>5 3/4' Pipette pasteur monouso in borosilicato a foro largo&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>Larve di trasferimento</td></tr></tbody></table>

alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale zebrafish: alimentazione, l&#39;imaging dal vivo, e la quantificazione del cibo

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

I pesci zebra stanno emergendo come modello di elaborazione dei lipidi alimentari e di malattie metaboliche. Questo protocollo descrive come nutrire il pesce zebra larvale con un pasto ricco di lipidi, che consiste in un'emulsione di liposomi di tuorlo d'uovo di gallina creata sonicando il tuorlo d'uovo in terreni embrionali. Vengono fornite istruzioni dettagliate per lo screening delle larve per il consumo di tuorlo d'uovo in modo che le larve che non riescono a nutrirsi non confondano i risultati sperimentali. I liposomi del tuorlo d'uovo di gallina possono essere addizionati con analoghi lipidici fluorescenti, inclusi acidi grassi e colesterolo, consentendo la visualizzazione sia sistemica che subcellulare dell'elaborazione dei lipidi nella dieta. Vengono descritti diversi metodi per montare le larve che favoriscono l'imaging dal vivo a breve e lungo termine con obiettivi sia verticali che invertiti ad alto e basso ingrandimento. Viene inoltre presentato un test per quantificare l'assunzione di cibo larvale estraendo i lipidi di larve alimentate con analoghi lipidici fluorescenti, individuando i lipidi su una piastra cromatografica a strato sottile e quantificando la fluorescenza. Infine, vengono discussi gli aspetti critici delle procedure, i controlli importanti, le opzioni per modificare i protocolli per affrontare specifiche questioni sperimentali e le potenziali limitazioni. Queste tecniche possono essere applicate non solo a indagini mirate e basate su ipotesi, ma anche a una varietà di schermi e tecniche di imaging dal vivo per studiare il metabolismo lipidico alimentare e il controllo dell'assunzione di cibo.

Quando alimentato su una sedia a dondolo a 29-31 ° C, la maggior parte delle larve sane (≥95%) si mangia entro 1 ora. Al momento di consumare l&#39;emulsione di tuorlo d&#39;uovo, l&#39;intestino delle larve scurisce a colori. Molto intestini scuri possono essere osservati a 2 ore (Figura 1). Se larve sono digiuni o non vengono alimentate, l&#39;intestino rimane chiaro. Le larve d&#39;uovo alimentato mostra bianco un dilatate lume intestinale che non oscurano a colori. <p class="jove_content" fo:kee...

I pesci zebra stanno emergendo come un valido modello di elaborazione dei lipidi alimentari e di malattie metaboliche. Vengono descritti i protocolli di mangimi larvali ricchi di lipidi, l'imaging dal vivo di analoghi lipidici fluorescenti dietetici e la quantificazione dell'assunzione di cibo. Queste tecniche possono essere applicate a una varietà di tecniche di screening, imaging e indagine basata su ipotesi.

Alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale Zebrafish: Alimentazione, l&#39;imaging dal vivo, e la quantificazione del cibo

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è nutrire larve di pesce zebra con un pasto ricco di lipidi che può essere arricchito con un analogo fluorescente dei lipidi, al fine di osservare in vivo la dinamica dell'assorbimento lipidico e quantificare l'ingestione di lipidi attraverso la dieta. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi del metabolismo e della biologia gastrointestinale, ad esempio su come i lipidi alimentari vengano metabolizzati e su come venga regolata l'assunzione di cibo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che analoghi fluorescenti dei lipidi possono essere efficacemente somministrati tramite liposomi alimentari.La trasparenza ottica dello Zebrafish larvale consente la microscopia per rivelare l'elaborazione lipidica a livello subcellulare. Per iniziare, sospendere un milligrammo di analogo lipidico fluorescente in polvere in due millilitri di cloroformio al 100% per ottenere una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per microlitro. Aliquotare l'analogato in provette di vetro ambrate con tappi a vite compatibili con il solvente e dotate di guarnizione in teflon.Conservare queste soluzioni in congelatore. Aggiungere 10,4 microlitri della soluzione madre di analogo lipidico fluorescente a 0,5 microgrammi per microlitro in un tubo da 1,5 millilitri ed essiccare sotto un flusso di azoto, avendo cura di non far uscire il lipide dal tubo. Riportare immediatamente in sospensione il lipide essiccato in cinque microlitri di etanolo al 100% prelevando con la pipetta un flusso lungo le pareti del tubo.Quindi, aggiungere 95 microlitri di mezzo per embrioni e mescolare accuratamente aspirando e dispensando più volte finché il composto appare omogeneo. Proteggere il tubo dalla luce e conservarlo sul ghiaccio fino al momento dell'utilizzo. Per preparare una soluzione di liposomi fluorescenti di colesterolo, aggiungere una quantità sufficiente di soluzione madre di analogo fluorescente del colesterolo in un tubo da 1,5 millilitri in modo da ottenere una concentrazione finale di 2,5 microgrammi per millilitro quando viene aggiunta all'emulsione di tuorlo d'uovo.Asciugare il stock di colesterolo sotto un flusso di azoto, come in precedenza. Ri-sospendere immediatamente l'analoghi fluorescente del colesterolo in 15 microlitri di etanolo al 100% a temperatura ambiente, pipettando un flusso lungo la parete del tubo. E mescolare con 85 microlitri di BSA priva di acidi grassi al 1% e acqua.È essenziale solubilizzare completamente l'analoglo lipidico fluorescente in etanolo e nel mezzo per embrioni prima di aggiungerlo all'emulsione di tuorlo d'uovo, per garantire una distribuzione omogenea del lipide nel mangime e una disponibilità uniforme per tutte le larve. Proteggere il tubo dalla luce avvolgendolo con della stagnola e conservarlo sul ghiaccio. Per preparare la soluzione alimentare, aggiungere 19 millilitri di mezzo per embrioni in un tubo conico da 50 millilitri, quindi aggiungere un'aliquote di un millilitro di tuorlo d'uovo.Vortexare la miscela per uno o due minuti per ottenere un'emulsione omogenea. Versare la miscela attraverso un setaccio fine per rimuovere i conglomerati proteici e raccoglierla in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, sottoporre la miscela d'uovo a sonica a impulsi per cinque volte, con impulsi di un secondo acceso e un secondo spento, utilizzando una microsonda conica da 1/4 di pollice a sei watt.Ripetere il programma di sonificazione altre quattro volte. Questo crea i liposomi, che ora devono essere mantenuti in agitazione continua fino all'uso per preservarne l'omogeneità. Aggiungere la quantità appropriata di analoghi lipidici fluorescenti a cinque millilitri della miscela di liposomi immediatamente dopo la sonificazione.Agitare a velocità elevata per 30 secondi per incorporare gli analoghi lipidici fluorescenti nei liposomi. Proteggere la miscela dalla luce avvolgendo il tubo nella stagnola e rimetterlo sul rocker. Aggiungere cinquanta larve a una piastra per l'alimentazione, rimuovere il mezzo embrionale e aggiungere 5 millilitri di alimento.Per favorire l'assunzione di cibo, agitare delicatamente le larve in un agitatore termoregolato e proteggerle dalla luce se si utilizzano analoghi lipidici fluorescenti. Al termine del periodo di alimentazione, lavare le larve con cinque millilitri di mezzo embrionale per tre volte. Per immobilizzare le larve, posizionare un blocco di metallo sul ghiaccio, ricoprirlo con un tessuto per evitare un raffreddamento eccessive, quindi collocare le larve nel piatto contenente il mezzo embrionale in cima al blocco per raffreddarle.Osservare le larve a 10x al microscopio stereoscopico e determinare quali di esse hanno ingerito l'alimento a base di liposomi. Le larve che hanno ingerito liposomi presenteranno un intestino scurito. È fondamentale determinare se le larve si sono alimentate verificando la presenza di un intestino scurito.Tipicamente, dall'uno al cinque percento delle larve non si nutrirà, e potrebbe alterare i risultati sperimentali se non identificato e rimosso. Per l'analisi in tempo prolungato con ingrandimento elevato mediante un obiettivo invertito, raffreddare innanzitutto le larve su un blocco di metallo posto sul ghiaccio. Trasferire una larva in una piastra con fondo in vetro e rimuovere il mezzo embrionale asciugandolo con un fazzoletto di carta.Posizionare una goccia di agarosio al 1,2% a basso punto di fusione a 42 gradi Celsius sopra la larva e allineare immediatamente con un bastoncino. Rimuovere la piastra dal blocco freddo e lasciare riposare l'agarosio per due o tre minuti. Infine, aggiungere un volume sufficiente di mezzo embrionale fresco per coprire l'agarosio e prevenire la disidratazione.I campioni sono ora pronti per l'acquisizione delle immagini. Alla fine di un'alimentazione con liposomi, raccogliere almeno 10 larve lavate in una provetta da 1,5 millilitri. Rimuovere il mezzo per embrioni e quindi congelare rapidamente le larve.Ripetere in un tubo separato con 10 larve non alimentate come controllo. Mantenendo il campione sul ghiaccio, aggiungere 100 microlitri di buffer di omogeneizzazione a ciascun tubo, quindi omogeneizzare con un sonicatore a micropunta. Trasferire il tessuto in un tubo da coltura da 13 millilitri.Aggiungere 375 microlitri di cloroformio in metanolo (da uno a due volumi) a ogni sospensione di tampone di omogeneizzazione. Eseguire il vortex per 30-60 secondi, quindi incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere ulteriori 125 microlitri di cloroformio e sottoporre nuovamente a vortex per 30 secondi.Successivamente, aggiungere 125 microlitri di TRIS 200 millimolare a pH 7,5, vortexare per 30 secondi, quindi centrifugare a 2000 ×g per cinque minuti proteggendo dalla luce. Rimuovere con attenzione i campioni dalla centrifuga per evitare di disturbare le fasi separate. Utilizzando una pipetta in vetro pulita, raccogliere la fase organica inferiore e trasferirla in un tubo in vetro pulito da 13 millilitri.Evitare con attenzione di trasferire qualsiasi parte delle fasi superiore acquosa o intermedia di detriti larvali e scartarle. Asciugare la fase organica sotto vuoto a una pressione di 0,12 atmosfere, proteggendola dalla luce e avendo cura di interrompere l'operazione non appena il liquido si è evaporato. Ri-sospendere un singolo campione in 10 microlitri di cloroformio:metanolo in rapporto 2:1 ed applicare l'intero volume del campione su una piastra cromatografica a strato sottile cannelata.Ripetere con i campioni rimanenti, applicando le soluzioni a intervalli regolari. Infine, scansionare la piastra con un lettore fluorimetrico. L'esame dei larvati alimentati su rocker in condizioni sperimentali mostra intestini scuriti, tipici di pesci che hanno ingerito l'emulsione di tuorlo d'uovo.I larvi non nutriti hanno generalmente intestini trasparenti, quindi quelli che non hanno ingerito la formula dietetica durante il periodo di alimentazione sono facilmente distinguibili. Un larva alimentato con un analogo fluorescente dei lipidi permette di visualizzare il trasporto e l'accumulo di questo lipide alimentare. Qui, il segnale fluorescente è visibile in tutti gli organi digestivi dopo otto ore di alimentazione.Vengono incorporati vari analoghi lipidici, che quindi permettono la visualizzazione di specifici insiemi di strutture cellulari, poiché vengono metabolizzati in modo differenziale in lipidi complessi. In questo caso, gli analoghi Fluorescent-C16 e C12 marcano le goccioline lipidiche. L'analogoo Fluorescent-C5 etichetta i dotti epatici e pancreatici, le goccioline lipidiche, le membrane cellulari e le reti arteriose.E le etichette analoghe Fluorescent-C2 marcano i dotti epatici e pancreatici e le membrane cellulari. Sono stati utilizzati saggi sull'assunzione di cibo nei larve per studiare l'alimentazione di larve di tipo selvatico rispetto a larve transgeniche che overesprimono l'Apolipoproteina A4B1, e hanno mostrato che durante alimentazioni di quattro ore le larve transgeniche mangiavano meno rispetto alle larve di tipo selvatico. Gli accoppiamenti sono stati normalizzati utilizzando larve controllo a digiuno accoppiate.La quantificazione della fluorescenza di larve wild-type e transgeniche, che sovraesprimono Apo A4 dopo l'alimentazione, mostra un'ingestione significativamente ridotta nelle larve transgeniche rispetto alle wild-type. Una volta acquisita la tecnica, la preparazione del marcatore fluorescente lipidico nell'albume d'uovo richiede circa 15 minuti. L'assunzione di cibo può essere quantificata da 10 a 12 campioni raggruppati in circa quattro ore.Nel corso di questa procedura, è importante ricordare di esaminare i larvi alla ricerca di difetti dello sviluppo che potrebbero compromettere l'assunzione di cibo, come una mascella malformata, un intestino sottosviluppato o una ridotta mobilità. Metodi come trattamenti farmacologici o l'ingegneria del genoma possono essere integrati in questo protocollo sperimentale per rispondere ad ulteriori quesiti, ad esempio su come specifiche proteine e vie di segnalazione cellulare regolino l'assunzione di cibo e il metabolismo dei lipidi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nei settori della fisiologia gastrointestinale e della biologia cellulare per visualizzare il trasporto e l'accumulo di lipidi alimentari nei larvi di Zebrafish.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare un alimento ricco di lipidi per larve di Zebrafish, schermare le larve per valutare l'assunzione di cibo, montare le larve per imaging a breve e lungo termine e quantificare l'assunzione di cibo. Non dimenticare che lavorare con un sonicatore può essere pericoloso. Si dovrebbe indossare protezione per le orecchie durante l'esecuzione di questa procedura.

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Alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale Zebrafish: Alimentazione, limaging dal vivo, e la quantificazione del cibo (Video) | JoVE Journal

Alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale Zebrafish: Alimentazione, l'imaging dal vivo, e la quantificazione del cibo

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