Alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale Zebrafish: Alimentazione, l'imaging dal vivo, e la quantificazione del cibo

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è quello di somministrare al pesce zebra larvale un pasto ricco di lipidi che può essere addizionato con un analogo lipidico fluorescente per montare le larve alle dinamiche visive di assorbimento dei lipidi e per quantificare l'assunzione di lipidi nella dieta. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del metabolismo e della biologia gastrointestinale, come ad esempio come vengono metabolizzati i lipidi alimentari e come viene regolata l'assunzione di cibo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli analoghi lipidici fluorescenti possono essere erogati in modo efficiente nei liposomi alimentari.

La chiarezza ottica della larva di pesce zebra consente alla microscopia di rivelare l'elaborazione dei lipidi subcellulari. Per iniziare, sospendere un milligrammo di analogo lipidico fluorescente in polvere in due millilitri di cloroformio al 100% per una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per microlitro. Aliquotare l'analogo in tubi di vetro ambrato con tappi a vite compatibili con il solvente che contengono una guarnizione in teflon.

Conserva queste scorte nel congelatore. Aggiungere 10,4 microlitri di 0,5 microgrammi per microlitro di analogo lipidico fluorescente in una provetta da 1,5 millilitri e asciugare sotto un flusso di azoto, facendo attenzione a non soffiare il lipide fuori dalla provetta. Risospendere immediatamente il lipide essiccato in cinque microlitri di etanolo al 100% pipettando un getto lungo i lati della provetta.

Quindi, aggiungere 95 microlitri di terreno embrionale e mescolare accuratamente pipettando su e giù fino a quando la miscela appare omogenea. Proteggi il tubo dalla luce e conservalo nel ghiaccio fino al momento del bisogno. Per preparare una soluzione di liposomi fluorescenti per il colesterolo, aggiungere una quantità sufficiente di analogo del colesterolo fluorescente in un tubo da 1,5 millilitri per ottenere una concentrazione finale di 2,5 microgrammi per millilitro quando viene aggiunto all'emulsione di tuorlo d'uovo.

Asciugare il brodo di colesterolo sotto un getto di azoto, come prima. Risospendere immediatamente l'analogo fluorescente del colesterolo in 15 microlitri di etanolo al 100% a temperatura ambiente pipettando un getto lungo il lato della provetta. E mescolare con 85 microlitri di BSA senza acidi grassi all'1% e acqua.

È essenziale solubilizzare completamente l'analogo lipidico fluorescente in etanolo e terreno embrionale prima di aggiungerlo all'emulsione di tuorlo d'uovo per garantire una distribuzione omogenea del lipide nel mangime e una disponibilità uniforme per tutte le larve. Proteggere il tubo dalla luce con un foglio di alluminio e conservarlo con ghiaccio. Per preparare la soluzione di alimentazione, aggiungere 19 millilitri di terreno embrionale a un tubo conico da 50 millilitri, quindi aggiungere un'aliquota di tuorlo d'uovo da un millilitro.

Agitare il composto per uno o due minuti fino a ottenere un'emulsione omogenea. Versare il composto attraverso un colino fine per rimuovere i conglomerati proteici e raccoglierlo in un tubo conico fresco da 50 millilitri. Quindi, sonicare a impulsi il mix di uova cinque volte, un secondo acceso, un secondo spento, con una micropunta affusolata da 1/4 di pollice a sei watt.

Ripetere il programma di sonicazione altre quattro volte. Questo crea i liposomi, che ora dovrebbero essere continuamente fatti oscillare fino all'uso per mantenere l'omogeneità. Aggiungere la quantità appropriata di analoghi lipidici fluorescenti a cinque millilitri della miscela di liposomi subito dopo la sonicazione.

Agitare ad alta velocità per 30 secondi per incorporare gli analoghi lipidici fluorescenti nei liposomi. Proteggere il composto dalla luce avvolgendo il tubo in un foglio di alluminio e rimetterlo nel bilanciere. Aggiungi cinquanta larve in una vaschetta per l'alimentazione, rimuovi il terreno embrionale e aggiungi 5 millilitri di mangime.

Per incoraggiare l'assunzione di cibo, cullare delicatamente le larve in un dondolo incubato e proteggerle dalla luce se sono in uso analoghi lipidici fluorescenti. Alla fine del periodo di alimentazione, lavare le larve in cinque millilitri di terreno embrionale per tre volte. Per immobilizzare le larve, posizionare un blocco di metallo sul ghiaccio, sovrapporre un fazzoletto per evitare un raffreddamento eccessivo, quindi posizionare le larve nel piatto di terreno embrionale sopra per raffreddarle.

Osserva le larve a 10 volte al microscopio da dissezione e determina quali di esse hanno consumato il mangime liposomiale. Le larve che hanno consumato liposomi avranno un intestino scuro. È fondamentale determinare se una larva si è nutrita controllando la presenza di un intestino scurito.

In genere, dall'uno al cinque per cento delle larve non mangia e potrebbe confondere i risultati sperimentali se non identificata e rimossa. Per l'imaging a lungo termine ad alto ingrandimento con un obiettivo invertito, raffreddare prima le larve su un blocco di metallo su ghiaccio. Trasferisci una larva in un piatto con fondo di vetro e rimuovi il mezzo embrionale con un fazzoletto.

Metti una goccia di 42 gradi Celsius a bassa fusione all'1,2% di agarosio sopra la larva e posizionala immediatamente con un attizzatoio. Togliete il piatto dal blocco freddo e lasciate riposare l'agarosio per due o tre minuti. Infine, aggiungere un volume sufficiente di terreno embrionale fresco per coprire l'agarosio e prevenire l'essiccazione.

I campioni sono ora pronti per l'imaging. Al termine di un'alimentazione liposomiale, raccogliere un minimo di 10 larve lavate in un tubo da 1,5 millilitri. Rimuovere il terreno embrionale e poi congelare le larve.

Ripetere in una provetta separata con 10 larve non alimentate come controllo. Mantenendo il campione in ghiaccio, aggiungere 100 microlitri di tampone di omogeneizzazione a ciascuna provetta, quindi omogeneizzare con un sonicatore a micropunta. Trasferire il tessuto in una provetta di coltura da 13 millilitri.

Aggiungere 375 microlitri di uno o due cloroformio al metanolo a ciascun impasto tampone di omogeneizzazione. Agitare per 30-60 secondi, quindi incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere altri 125 microlitri di cloroformio e agitare per 30 secondi.

Successivamente, aggiungere 125 microlitri di TRIS 200 millimolare pH 7,5, agitare per 30 secondi e centrifugare a 2000 volte g per cinque minuti al riparo dalla luce. Rimuovere i campioni dalla centrifuga con cautela per evitare di disturbare le fasi separate. Utilizzando una pipetta di vetro pulita, raccogliere la fase organica inferiore e trasferirla in una provetta di vetro pulita da 13 millilitri.

Evitare accuratamente di trasferire le fasi acquose superiori o dei detriti larvali medi e gettarle. Essiccare la fase organica sotto vuoto a 0,12 di pressione atmosferica, proteggendola dalla luce, avendo cura di fermarsi una volta evaporato il liquido. Risospendere un singolo campione in 10 microlitri di cloroformio due a uno in metanolo e posizionare l'intero volume del campione su una piastra cromatografica canalizzata su strato sottile.

Ripetere con i campioni rimanenti, spottando a intervalli uniformemente distanziati. Infine, scansiona la lastra con un lettore di lastre fluorescente. L'esame delle larve alimentate su un dondolo in condizioni sperimentali mostra intestini scuriti, tipici dei pesci che hanno consumato l'emulsione di tuorlo d'uovo.

Le larve non nutrite di solito hanno l'intestino chiaro, quindi quelle che non hanno consumato la formula dietetica durante il periodo di alimentazione sono facilmente distinguibili. Una larva alimentata con un analogo lipidico fluorescente visualizza il trasporto e l'accumulo di questo lipide alimentare. Qui, il segnale fluorescente è visibile in tutti gli organi digestivi dopo otto ore di alimentazione.

Vari analoghi lipidici sono incorporati insiemi unici di strutture cellulari e quindi visualizzano poiché vengono metabolizzati in modo differenziale in lipidi complessi. Qui, gli analoghi fluorescenti C16 e C12 marcano le goccioline lipidiche. La fluorescenza-C5 marcasce i dotti epatici e pancreatici, le goccioline lipidiche, le membrane cellulari e le reti arteriose.

E l'analogo fluorescente-C2 etichetta i dotti epatici e pancreatici e le membrane cellulari. I saggi di assunzione di cibo larvale sono stati utilizzati per studiare l'alimentazione delle larve wild-type rispetto a quelle transgeniche che sovraesprimono l'apolipoproteina A4B1 e hanno dimostrato che nell'arco di quattro ore di alimentazione le larve transgeniche mangiavano meno del wild-type. Gli allevamenti sono stati normalizzati utilizzando larve di controllo accoppiate e non alimentate.

La quantificazione della fluorescenza delle larve wild-type e transgeniche, che sovraesprimono Apo A4 dopo l'alimentazione, mostra una significativa riduzione dell'ingestione da parte delle larve transgeniche rispetto a quelle wild-type. Una volta padroneggiato, il mangime analogo lipidico fluorescente al tuorlo d'uovo può essere preparato in circa 15 minuti. L'assunzione di cibo può essere quantificata da 10 a 12 campioni aggregati in circa quattro ore.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di esaminare le larve per difetti di sviluppo che possono compromettere l'assunzione di cibo, come una mascella malformata, un intestino sottosviluppato o una ridotta mobilità. Metodi come i trattamenti farmaceutici o l'ingegneria genomica possono essere incorporati in questo protocollo sperimentale per rispondere a ulteriori domande, come il modo in cui proteine specifiche e vie di segnalazione cellulare regolano l'assunzione di cibo e il metabolismo dei lipidi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia gastrointestinale e della biologia cellulare per visualizzare il trasporto e l'accumulo di lipidi nella dieta nelle larve di pesce zebra.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare un mangime larvale per pesce zebra ricco di lipidi, esaminare le larve per l'assunzione di cibo, montare le larve per l'imaging a breve e lungo termine e quantificare l'assunzione di cibo. Non dimenticate che lavorare con un sonicatore può essere pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario indossare una protezione per le orecchie.