Unicellulare espressione genica Utilizzando Multiplex RT-qPCR per caratterizzare eterogeneità delle rare popolazioni linfoidi

Questo protocollo descrive come valutare l'espressione di una vasta gamma di geni a livello clonale. Single-cell RT-qPCR produce risultati altamente affidabili con una forte sensibilità per le centinaia di campioni e geni.

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare l'espressione genica multipla in singole cellule. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come l'eterogeneità delle firme molecolari all'interno di una popolazione cellulare o una rara firma molecolare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che specifiche firme molecolari con almeno 48 geni diversi possono essere valutate in molte cellule contemporaneamente.

Iniziare questa procedura preparando una miscela di preamplificazione per 48 reazioni in una provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere alla provetta 240 microlitri di tampone retrotrascrizione specifico, 62,4 microlitri di tampone EDTA TE basso e 9,6 microlitri di Taq DNA polimerasi. Utilizzando una pipetta elettronica, distribuire 6,5 microlitri della miscela di preamplificazione in ciascuno dei 48 pozzetti in una piastra a cella singola a 96 pozzetti.

Quindi, preparare una miscela di saggio 0,2x in una provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere al tubo 1,4 microlitri di ogni primer. Regolare il volume finale a 140 microlitri con tampone EDTA TE basso.

Utilizzando una pipetta elettronica, distribuire 2,5 microlitri della miscela di saggio 0,2x nei 48 pozzetti della piastra di selezione a singola cellula a 96 pozzetti, contenente la miscela di preamplificazione. Sigillare la piastra con una pellicola di copertura. Agitare il piatto e farlo girare a 280 volte g per un minuto.

Le singole cellule linfoidi innate epatiche, o ILC, saranno selezionate mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. Iniziare questa procedura utilizzando una piastra vuota a 96 pozzetti come test. Posizionare la piastra di prova sul portapiastra con il pozzetto a sinistra e verso lo sperimentatore.

Regolare il portatarga in modo da ottenere una goccia al centro di un pozzetto con le perline di verifica. Se regolata correttamente, posizionare la piastra di selezione a cella singola a 96 pozzetti contenente la miscela del saggio e la preamplificazione sul supporto della piastra. Disegna il layout della piastra e ordina una cella per pozzetto della popolazione recintata.

Il corretto posizionamento di ciascuna cella sulla piastra di smistamento a 96 pozzetti a cella singola è essenziale e il layout della piastra deve essere mantenuto su un software per fogli di calcolo. Lasciare un pozzetto contenente una miscela di saggio 0,2x e una miscela di preamplificazione senza cellule, come controllo senza input. Facoltativamente, lasciare due file di sei pozzetti per la diluizione del cDNA come controlli per l'efficienza del primer.

Immediatamente dopo la selezione a cella singola, vorticare e centrifugare la piastra di selezione a cella singola a 96 pozzetti. Posizionare la piastra nel termociclatore. Eseguire la trascrizione inversa e la preamplificazione come indicato.

Per avere materiale sufficiente è necessaria la pre-amplificazione di specifici geni bersaglio su singole cellule selezionate. Diluire i campioni preamplificati aggiungendo 36 microlitri di tampone EDTA TE basso in ciascun pozzetto. Per iniziare questa procedura, preparare 191 microlitri di una Master Mix pipettando 175 microlitri di una Master Mix qPCR e 17,5 microlitri del reagente di caricamento del campione in una provetta da 1,5 millilitri.

Su una nuova piastra da 96 pozzetti, distribuire 3,6 microlitri di Master Mix su ciascuno dei 48 pozzetti. Questa è la piastra campione a 96 pozzetti. Trasferire 2,9 microlitri di cDNA preamplificato dalla piastra di smistamento a 96 pozzetti a singola cellula alla nuova piastra di campionamento a 96 pozzetti, mantenendo la stessa posizione per ogni campione tra le due piastre.

Preparare una piastra di dosaggio da 96 pozzetti distribuendo tre microlitri di reagente di caricamento del saggio a ciascuno dei 48 pozzetti su una nuova piastra da 96 pozzetti. Aggiungere tre microlitri di primer a ciascun pozzetto. Il corretto posizionamento di ciascun primer nella piastra di saggio a 96 pozzetti è essenziale.

Mantieni un layout di targa su un software per fogli di calcolo. Per iniziare questa procedura, posizionare il circuito microfluidico integrato, o IFC, sul banco e controllare le valvole utilizzando una siringa. Rimuovere il cappuccio della siringa, posizionarlo perpendicolarmente a una valvola e premere con decisione.

L'O-ring dovrebbe muoversi. Riempire il chip con il liquido della linea di controllo. Dopo aver ripetuto i passaggi precedenti con la seconda valvola, rimuovere la pellicola nera dal fondo del chip.

Caricare il chip nel controller IFC. Nella schermata del controller IFC, selezionare prime, quindi eseguire. Quindi, espellere il chip e richiudere la pellicola nera sul fondo del chip.

Utilizzando una pipetta a otto canali, trasferire cinque microlitri dalla piastra del saggio a 96 pozzetti al lato sinistro, o uno, del chip. Cambia le punte per ogni pozzetto del chip. Evita di creare bolle e, se compaiono bolle, usa punte da 10 microlitri per rimuoverle.

Riempi il lato sinistro del chip come indicato. Allo stesso modo, riempire il lato destro del chip utilizzando cinque microlitri dalla piastra di campionamento a 96 pozzetti. Per il successo di questo esperimento, è essenziale che il chip IFC sia riempito correttamente per un corretto caricamento nel controller IFC.

Rimuovere la pellicola blu dalla parte inferiore del chip e caricare il chip nel controller IFC. Nella schermata del controller IFC, selezionare load mix, quindi eseguire. Al termine, espellere il chip e richiudere la pellicola blu sul fondo del chip.

Per eseguire il chip, selezionare prima il software di raccolta dati sul computer qPCR microfluidico. Una volta avviato, seleziona nuova esecuzione. Seleziona espulsione e carica il chip.

Dopo aver configurato il software come descritto nel protocollo di testo, selezionare avvia esecuzione. La reazione durerà circa 90 minuti. Per iniziare l'analisi dei dati, aprire il software di analisi PCR in tempo reale, selezionare il file e aprire, trovare la cartella dell'esperimento e selezionare chip run dot b m one file.

Fare clic sulla vista di analisi, sulla tabella dei risultati e sulla vista della mappa di calore. Le caselle contrassegnate con una x sono al di sotto del livello di rilevamento di soglia e/o presentano curve di amplificazione errate. Assegna un nome ai campioni.

Vai alla configurazione di esempio e seleziona il nuovo SBS 96. Fare clic su mappatura e selezionare il layout del campione in base al layout della piastra del campione a 96 pozzetti. Copia e incolla il layout di esempio dal software per fogli di calcolo.

Definire il layout incollato come nome di esempio. Utilizzare la stessa procedura per denominare i saggi. Immettere i nomi dei primer nella configurazione del rivelatore e definire il layout incollato come nome del rivelatore.

Fare clic su Analisi, Visualizza e analizza. Seleziona il file, esporta e salva come risultati della mappa termica. Utilizzando la citometria a flusso, le popolazioni di ILC epatiche sono state ordinate in base a marcatori ILC ampiamente espressi e sono state definite tre popolazioni distinte.

Un chip di espressione genica multiplex a singola cellula correttamente caricato dovrebbe apparire con linee rette e righe, con ogni camera di reazione riempita e nella stessa dimensione. Un chip caricato in modo errato avrà linee e file vuote di camere di reazione, nonché linee di piegatura. Questa figura di fluoresceina amidite di un chip caricato correttamente mostra differenze nella luminosità della camera di reazione che appaiono dopo alcuni cicli.

Le camere di reazione con un segnale di amplificazione appaiono più luminose delle camere di reazione con segnali di amplificazione bassi o assenti. Dopo un corretto smistamento cellulare, pre-amplificazione e caricamento, la popolazione ILC è apparsa eterogenea per l'espressione genica nel fegato di topi adulti wild type. A sinistra c'è una mappa di calore senza modifiche.

A destra è riportata la mappa termica modificata ottenuta dopo la definizione del nome del campione e del saggio. Utilizzando un software online, sono state identificate le firme di espressione genica specifiche delle cellule e le relazioni tra le popolazioni cellulari. Ogni riga rappresenta un gene e ogni riga rappresenta la stessa cellula e le tre popolazioni cellulari sono rappresentate in blu, rosso e verde.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in nove ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere attentamente traccia dell'orientamento della piastra per la distribuzione delle celle e del primer. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare firme molecolari rare e specifiche nelle popolazioni cellulari.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare l'espressione genica multipla in molte singole cellule contemporaneamente, dopo un corretto smistamento cellulare, pre-amplificazione e caricamento.