Un metodo alternativo e validate iniezione per l'accesso ai sottoretinico Spazio via Un approccio Transcleral posteriore

L'obiettivo generale di questo studio è descrivere una nuova tecnica di iniezione sottoretinica che può essere utilizzata per colpire vettori virali, agenti farmacologici o indurre cellule staminali pluripotenti nello spazio sottoretinico nei topi. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della scienza della visione e dell'oftalmologia, come la valutazione dell'efficacia di nuovi interventi terapeutici per le degenerazioni retiniche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per fornire materiale allo spazio sottoretinico, con elevata efficacia, danni minimi e rapido recupero della struttura e della funzione retinica.

A dimostrare la procedura sarà Sachin P, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, tagliare i baffi di un topo anestetizzato per facilitare la visualizzazione e mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 gradi Celsius con un cuscinetto d'acqua circolante. Successivamente, dilatare le pupille con un collirio al 2,5% di fenilefrina.

Quindi, applicare colliri di metilcellulosa per prevenire la secchezza e ridurre al minimo la cataratta transitoria indotta dall'anestesia. Sterilizzare gli strumenti prima dell'intervento chirurgico. Successivamente, preparare la fluoresceina diluita in una cabina di biosicurezza.

Riempi la siringa con la quantità appropriata di fluoresceina. Quindi, eseguire un pizzicamento delle dita dei piedi per assicurarsi che l'animale sia profondamente anestetizzato e posizionare il topo in modo che l'occhio da iniettare sia rivolto verso l'alto e chiaramente visibile nel microscopio da dissezione. Pizzicare delicatamente la congiuntiva temporale con un paio di pinze a punta fine.

Quindi, praticare un'incisione circonferenziale di circa 90 gradi utilizzando le forbici curve di Vannas. Ripetere la procedura sulla capsula di Tenone sottostante. Successivamente, reseca il problema connettivo circostante con una pinza a punta fine, ruotando il globo nasale.

Lavorare verso il sito di iniezione a circa 0,5 millimetri di distanza dal nervo ottico e fare molta attenzione per evitare di interrompere il seno retro-orbitale. Un passaggio critico è l'esposizione del sito di iniezione che richiede la rotazione dell'occhio, senza danneggiare l'occhio stesso o le strutture associate, evitando in particolare danni al sacco sanguigno orbitale. In questa procedura, praticare una piccola incisione sulla sclera del sito di iniezione, grattando delicatamente la conchiglia oculare con una lama oftalmica di 22,5 gradi.

Questa incisione dovrebbe essere abbastanza grande da consentire alla punta dell'ago di passare attraverso la sclera. Quindi, inserire l'ago smussato calibro 33 nella sclerotomia con lo smusso rivolto verso la retina e angolato parallelamente alla retina. Iniettare la quantità desiderata di 0,01% di fluoresceina premendo lentamente lo stantuffo con una pressione uniforme.

Si noti che quando l'ago si trova nello spazio sottoretinico, si avverte una leggera resistenza durante la pressione dello stantuffo. Non ci sarà resistenza se l'ago perfora la retina, ma un'elevata resistenza se l'ago non penetra nella sclera o nell'EPR. Un altro passaggio critico è l'iniezione mirata allo spazio sottoretinico.

Questo deve essere realizzato senza penetrare attraverso la retina neurosensoriale, fino alla cavità vitreale. Attendere alcuni secondi prima di estrarre l'ago, per ridurre al minimo il riflusso. Successivamente, sciacquare l'occhio con soluzione fisiologica sterile e assicurarsi che l'occhio sia tornato alla sua posizione normale.

Quindi, applicare uno strato spesso di crema oftalmica a triplo antibiotico sulla superficie corneale dell'occhio iniettato. Successivamente, metti il topo in una gabbia solitaria pulita per il recupero. Monitora la sua respirazione e temperatura durante il recupero in anestesia e controlla che possa mantenere la decubito sternale.

Eseguire un ulteriore monitoraggio e trattamento post-operatorio appropriato, inclusa un'iniezione sottocutanea di carprofene, per la gestione del dolore post-chirurgico. Ecco una ricostruzione 3D della bolla a forma di cupola nel sito di iniezione. La bolla a forma di cupola viene quindi riempita di bianco denso per mostrare l'estensione e i margini del distacco di retina.

Le sezioni trasversali della retina provenienti dall'OCT possono essere viste in bianco, mentre lo spazio pieno di liquido a livello dell'RPE e dei fotorecettori appare nero. E in questa figura, le scansioni OCTB rappresentative nel sito di massimo distacco di retina sono mostrate per la pre-iniezione, 10 minuti dopo l'iniezione e quattro settimane dopo l'iniezione. Questa immagine mostra la formazione e la risoluzione di una bolla piatta da un'iniezione di 0,3 microlitri.

E questa immagine mostra la formazione e la risoluzione di una bolla a cupola da un'iniezione di 0,5 microlitri, mentre questa immagine mostra la formazione e la risoluzione di una bolla a cupola da un'iniezione di un microlitro. Infine, ecco un esempio di grave cicatrizzazione coroideale e assottigliamento della retina nel sito di iniezione. Le retine mantengono la normale funzione dopo la risoluzione della bolla.

A nove intensità di illuminazione, le forme d'onda per le risposte mediate dai bastoncelli scotopici sono mostrate per la pre-iniezione e quattro settimane dopo l'iniezione per iniezioni da 0,3 microlitri, 0,5 microlitri e 1 microlitro. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 10-15 minuti per occhio. Durante il tentativo di questa procedura, è importante valutare la salute degli occhi prima di iniziare.

Escludere gli occhi con opacità corneali o del cristallino o occhi infossati per i quali questa procedura sarebbe molto difficile. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'OCT e l'imaging del fondo oculare per valutare la qualità dell'iniezione.