Name: Valutazione della funzione bioenergetica in cellule endoteliali vascolare cerebrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Scopri come valutare la funzione mitocondriale in cellule endoteliali vascolari cerebrali per studiare l'integrità della barriera ematoencefalica. Questo metodo permette analisi in tempo reale su cellule intatte.

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Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni: AHA 16SDG31170008 a X.R. e NIH P20 GM109098, P01 AG027956 e U54 GM104942 a J.W.S.

NOTA: Lo schema del protocollo è mostrato in Figura 1, compresa una sequenza temporale delle procedure. 1. cultura e passaggio di cellule CVE <ol><li> Cellule di coltura CVE (cellule bEnd.3) in terreno di coltura completo (alti livelli di glucosio Dulbecco Modified mezzo di Eagle, DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina in un T75 cm pallone di coltura tissutale 2. Crescere a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. </li><li> Rimuovere e gettare il mezzo di coltura cellulare. Risciacquare strato di cellule con 0,25% di soluzione di EDTA tripsina-0,03%, e quindi aggiungere 1 - 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA al pallone e mantenere il matraccio a 37 ° C per 3 - 5 min. Osservare le cellule al microscopio invertito finché lo strato di cellule è staccato. Aggiungere 10 ml di terreno di coltura completo e aspirare le cellule pipettando delicatamente. </li><li> Decantare il liquido e le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e far girare a 700 xg per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari. </li&gt; <li> Eliminare il surnatante dalla provetta. Aggiungere 10 ml di terreno di coltura completo e risospendere il pellet cellulare. Spin le cellule a 700 xg per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante dalla provetta. Risospendere il pellet cellulare in mezzo di crescita completo ad una concentrazione di 2,0 x 10 5 cellule / ml (determinata per conteggio utilizzando un emocitometro; escludere le cellule morte mediante colorazione Trypan-blue). NOTA: le cellule appena scongelati sono sub-coltura per almeno 3 passaggi per esperimenti. </li></ol> 2. Le sementi e il trattamento di cellule su piastre di coltura cellulare <ol><li> cellule seme su una piastra di coltura di cellule del flusso extracellulare 96 pozzetti: 80 ml / pozzetto. Posizionare la piastra di coltura cellulare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Nota: 16 × 10 3 cellule per pozzetto raggiungeranno 60 - 80% di confluenza entro 24 ore. </li><li> Se le cellule sono esposti a una sostanza chimica, aggiungere i trattamenti una volta che le cellule sono attaccati alla piastra inferiore (8 - 24 ore dopo vediding). NOTA: Per gli esperimenti di trasfezione, non aggiungere antibiotici nel terreno di coltura completo. </li></ol> 3. Valutazione della mitocondriale Funzione Con il Bioanalyzer <ol><li> Prima dell&#39;inizio del test, idratare una cartuccia extracellulare sensore di flusso con calibrante aggiungendo 150 ml di extracellulare flusso calibrante soluzione alla piastra e incubazione O / N a 37 ° C senza CO 2. </li><li> Utilizzando la stazione di lavaggio piatto, cambiare il mezzo di coltura cellulare in pH 7,0 extracellulare flusso terreno di coltura. Incubare le cellule a 37 ° C senza CO 2 per il 30 - 60 min. </li><li> Preparare le soluzioni di lavoro di 8 micron oligomicina, 4,5 micron FCCP, 10 micron rotenone, e 10 micron antimicina A in DMEM. Carico 25 ml delle soluzioni madre nella cartuccia porte di iniezione: Port A, oligomicina; Port B, FCCP; Port C, rotenone e antimicina A con extracellulare terreno di coltura di flusso. Attuare il protocollo di test, come descritto nella tabella 1. </li><li> Caricare la cartuccia idratata in bioanalizzatore ed effettuare la calibrazione facendo clic sul pulsante &quot;Start&quot;. Dopo la calibrazione, rimuovere la piastra inferiore della cartuccia e caricare la piastra di cella cliccando il prompt &quot;Cartuccia Scaricare&quot;. Continuare il dosaggio fino al termine di tutte le misurazioni. </li><li> Aprire il file di dati e ottenere i valori della tariffa da bioanalizzatore. Esportare i dati in un file foglio di calcolo. </li></ol> 4. Analisi dei dati NOTA: I calcoli per le analisi dei dati sono formulati di seguito. I valori sono ottenuti dallo strumento bioanalizzatore come OCR presentato in figura 2. <ol><li> Per calcolare la respirazione basale, sottrarre la respirazione non mitocondriale (misure 10 - 12) dal valore basale (misura 3). NOTA: basale respirazione = basale - la respirazione mitocondriale non = tasso ③ - Tariffa ⑩ ⑫ ~. </li><li> Per calcolare producti ATPon, sottrarre la respirazione ATP-linked (misure 4 - 6) dal valore basale (misura 3). NOTA: la produzione di ATP = basale - respirazione ATP-linked = tasso ③ - Tariffa ④ ~ ⑥. </li><li> Per calcolare la respirazione massima, sottrarre la respirazione non mitocondriale (misure 10 - 12) dalla respirazione massima (misure 7 - 9). NOTA: respirazione massima = massima respirazione - non mitocondriale respirazione = Tasso ⑦ ~ ⑨ - Tariffa ⑩ ⑫ ~. </li><li> Per calcolare la capacità di riserva, sottrarre il valore basale (misura 3) dalla respirazione massima (misure 7 - 9). NOTA: la capacità di riserva = respirazione massima - basale = Tasso ⑦ ~ ⑨ - Tariffa ③. </li><li> Per calcolare Proton perdita, sottrarre la respirazione non mitocondriale (misura 10 - 12) dalla respirazione ATP-linked (misura 4). NOTA: Proton perdita = respirazione ATP-linked - non mitocondril respirazione = Tasso ④ - Tariffa ⑩ ⑫ ~. </li></ol>

<ol><li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cytoskeletal+elements+are+critical+for+flow-mediated+dilation+in+human+coronary+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles.</a> Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).</li>
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<li>Sutendra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Nogo+and+the+mitochondria-endoplasmic+reticulum+unit+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 3, 88ra55(2011).</li>
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<li>Oldendorf, W. H., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greater+number+of+capillary+endothelial+cell+mitochondria+in+brain+than+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).</li>
<li>Kaczara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+released+by+CORM-401+uncouples+mitochondrial+respiration+and+inhibits+glycolysis+in+endothelial+cells%3A+A+role+for+mitoBKCa+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels.</a> Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).</li>
<li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350(2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere potenziali conflitti di interesse in relazione alla ricerca, alla paternità e/o alla pubblicazione di questo articolo. Le tariffe di accesso aperto per questo articolo sono state fornite da Agilent Technologies.

Questo protocollo rappresenta un metodo di valutazione del fenotipo bioenergetico in cellule endoteliali vascolari cerebrali. Serve come un test di base per la valutazione dei mitocondri delle cellule endoteliali, ed è ottimale per esperimenti progettati per studiare i meccanismi di stimoli che possono influenzare il percorso di segnalazione mitocondriale nelle cellule CVE. Esso fornisce anche un metodo per testare potenziali terapie per le malattie BBB-rottura-associati. I passaggi critici all&#39;interno del protocollo Extracellulari bioanalyzers di flusso hanno la capacità di misurare OCR in tempo reale. In questo saggio, identificando la densità cellulare appropriata è critica. Se la densità cellulare è inferiore a 8 × 10 3 cellule per pozzetto, basale OCR è troppo bassa per essere analizzati (Figura 2 e Figura 3); se la densità cellulare è al di sopra di 32 × 10 3 cellule per bene, le cellule non rispondono a oligomicina o FCCP lavornti (Figura 2 e Figura 3). La densità cellulare ottimale per questa linea di cellule nel nostro modello sperimentale è di 16 × 10 3 cellule per bene, che dimostra i risultati replicabili e la sensibilità agli stimoli 7 e trattamenti 10,14. Se si utilizza un bioanalizzatore 24 pozzetti, nuove titolazioni della densità delle cellule sarebbero necessari per il test. E &#39;documentato che CVE hanno un grande volume di mitocondri rispetto ad altre cellule endoteliali o tipi di tessuto 15,16, suggerendo la necessità di una maggiore produzione di energia e un minor numero di cellule per misurare il metabolismo bioenergetica. Abbiamo testato diversi tipi di cellule endoteliali cerebrali, come primario e immortalate murine cellule endoteliali cerebrovascolari 7 e immortalate cellule endoteliali umane cerebrovascolari (dati non pubblicati). Queste cellule necessari simili densità di cellule per raggiungere il accettabili OCR (basale respirazione OCR entro 40-160 pmol / min per96 pozzetti e un 50 - 400 pmol / min per piastre da 24 pozzetti) quando è stata eseguita l&#39;analisi bioenergetica. Kaczara et al. Riportata la misurazione del metabolismo bioenergetico nel umani vena ombelicale cellule endoteliali (HUVEC), che ha utilizzato una più alta densità cellulare 17. Il nostro gruppo non ha valutato le cellule dei vasi provenienti da altri organi o tessuti. Teoricamente, il bioanalizzatore potrebbe potenzialmente essere utilizzato su qualsiasi tipo di cellula, ma richiede l&#39;ottimizzazione del saggio per la densità cellulare, mezzo di coltura cellulare, e condizioni di coltura (alcune cellule specifiche possono richiedere piastre rivestite per crescere bene). È necessario che gli esperimenti sono completati per garantire il tasso di OCR è compreso nell&#39;intervallo accettabile. Se l&#39;OCR nelle cellule endoteliali da altri organi è inferiore CVE dal cervello, aumentando la densità cellulare può aiutare a ottenere all&#39;interno di un intervallo OCR accettabile. In alternativa, se le cellule non si utilizza la fosforilazione ossidativa come loro principale fonte di energia, il bioanalizzatore non sarebbe un Optimal test. Il bioanalizzatore consente l&#39;interruzione sequenziale della catena di trasporto degli elettroni, in base all&#39;ordine in cui vengono applicati i reagenti. Innanzitutto, oligomicina viene applicato, che inibisce mitocondriale Complesso V (ATP sintasi). In secondo luogo, FCCP, un disaccoppiatore elettroni, viene applicato, che porta alla distruzione del gradiente protonico. Infine, rotenone e antimicina A, che inibiscono mitocondriale complessi I e III, rispettivamente, vengono applicate portare ad una totale inibizione del flusso di elettroni. L&#39;ordine di esposizione al farmaco è essenziale perché i farmaci bloccano la reazione a catena di trasporto degli elettroni specifico, e le modifiche sequenziali può essere misurato in modo da riflettere la funzione mitocondriale. Modifiche e risoluzione dei problemi Per valutare la risposta agli stimoli mitocondriale nelle cellule CVE, si raccomanda che gli stimoli sono applicati ai celle dopo le cellule sono rispettati fondo piastra di coltura cellulare (vedi timelinedi figura 1; di solito ci vogliono almeno 6 ore). Per ottenere risultati riproducibili da trattamenti, è estremamente importante mantenere la densità cellulare coerente. Se pretrattamenti sono progettati prima della semina delle cellule, la densità delle cellule per ogni pre-trattamento deve essere attentamente valutato, escludendo le cellule morte per la semina. Se trasfezione è incluso nel disegno sperimentale, fare riferimento al protocollo di trasfezione del produttore. Dimostrato in dati presentati in Figura 4, miR-34a è stato trasfettato nelle cellule CVE utilizzando un kit Lipofectamine trasfezione, che richiede medio-antibiotici libere coltura cellulare e un test mito-stress per valutare i cambiamenti nella funzione metabolica con sovraespressione di miR-34a . Le dosi di plasmide possono essere ottimizzate, come precedentemente pubblicato 13. Un&#39;altra modifica che può essere fatto al protocollo sta cambiando le concentrazioni dei reagenti. Una curva di titolazione di oligomicina, FCCP, e / o rotenone e Antimicina A può essere compleTed. Inoltre, se questo test viene utilizzato per high throughput analisi di vari farmaci, si suggerisce di includere un saggio parallelo a misurare la vitalità cellulare e proliferazione cellulare, che è stato descritto nelle nostre precedenti pubblicazioni 7,13. I valori OCR sono significativamente interessate dal numero di cellulare (figure 2 e 3), ei saggi di proliferazione cellulare e la vitalità beneficio della normalizzazione dei dati. Tuttavia, il completamento di questi test sono a discrezione di ogni singolo laboratorio. LIMITI DELLA TECNICA Il principale limite di questo protocollo è che abbiamo usato solo una cellula in vitro modello di cultura nello studio. Attualmente, non ci sono vivo modelli disponibili EX o modelli animali che potrebbero risolvere la funzione mitocondriale delle cellule endoteliali. I nuovi modelli dovrebbero essere sviluppati per la valutazione della funzione bioenergetica in vivo e <em&gt; ex vivo in studi futuri. Un altro limite è l&#39;estensione delle valutazioni barriera seguenti misure bioenergetici. Gli esperimenti non può essere eseguita in quanto, in primo luogo, dopo il completamento delle misurazioni bioenergetiche, la vitalità cellulare è diminuita dopo completa rottura della catena di trasporto degli elettroni; In secondo luogo, le piastre e gli inserti colture cellulari specifici sono tenuti a rilevare i valori bioenergetica e non si adattano inserti per le valutazioni di barriera. Pertanto, non ci sono molti saggi funzionali che possono essere completati dopo il test bioenergetica. Tuttavia, si prevede che i dispositivi speciali possono essere sviluppate per eseguire saggi funzionali prima del test bioenergetica. Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi / Tecniche precedenti per valutare la funzione mitocondriale reso necessario l&#39;isolamento dei mitocondri dalle cellule 18. Questo netecnica w utilizzando bioanalizzatore consente la misurazione dell&#39;attività mitocondriale in cellule intatte, che conserva più l&#39;ambiente cellulare che valutare mitocondri isolati. Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica Questo protocollo è stato progettato e sviluppato per la linea cellulare bEnd.3, ma è anche compatibile con primaria endoteliali vascolari cerebrali (pCVE), le cellule 7 o altre endotelio, e lo abbiamo dimostrato nella nostra precedente pubblicazione utilizzando cellule pCVE 7. Quando vengono utilizzati altri tipi di endotelio, possono essere richiesti il ​​rivestimento della piastra di coltura e l&#39;impiego di fattori di crescita. Tuttavia, il saggio di titolazione è raccomandato per altri tipi di cellule pure. Questo protocollo offre un metodo generale da adottare nella valutazione delle bioenergetica di cellule CVE, e può essere ulteriormente applicata a studi meccanismo o risposte terapeutiche in questo modo.

E &#39;ampiamente riconosciuto che il sangue-cervello-barriera (BBB) ​​formate da cellule endoteliali vascolari cerebrali (CVE) ha funzioni ben distinte e uniche di primaria importanza per la biologia vascolare. Queste cellule endoteliali utilizzano mitocondri per generare maggior parte della fornitura cellulare di adenosina trifosfato (ATP) come fonte di energia chimica. Oltre a fornire ATP per le cellule CVE, mitocondri regolano vari processi cellulari in cellule endoteliali vascolari, quali cellulari segnalazione 1-4, apoptosi 5, e il controllo del ciclo cellulare e la crescita cellulare 6. Disregolazione funzione bioenergetica mitocondriale nelle cellule CVE possono influenzare la biogenesi mitocondriale, portando ad alterata attività di endotelio vascolare, ed esacerbare le malattie cerebrovascolari e malattie neurodegenerative, per esempio, ictus 7,8 e malattia di Alzheimer (aD) 9. Abbiamo dimostrato che gli insulti alle cellule CVE a seguito dell&#39;esposizione ad lipopolysaccharide (LPS) compromettere la funzione mitocondriale nelle cellule CVE e peggiorare ictus esiti 7. Terz-butil-idrochinone (TBHQ) aumenta la mortalità ictus interferendo con fosforilazione ossidativa delle cellule CVE 10. Pertanto, il modello quantitativo della funzione bioenergetica nelle cellule CVE non solo piloti una serie di studi meccanismo legati al sistema nervoso centrale (SNC) malattie, ma fornisce anche un importante passo avanti in screening di farmaci di terapie di targeting funzione mitocondriale in biologia vascolare. mitocondri isolati sono stati utilizzati per misurare la funzione bioenergetica. Abbiamo 7 e altri 11 hanno riportato le valutazioni di bioenergetica cellulari in cellule intatte CVE utilizzando un Bioanalyzer flusso extracellulare. L&#39;analizzatore offre il vantaggio di valutazione bioenergetica cellulare endogena. Questo test sensibile e coerente misura il metabolismo mitocondriale di cellule CVE e può essere utilizzato per valutare impairment bioenergetica da stimuli, indagare i meccanismi di vie di segnalazione mitocondriali, e farmaci schermo o trattamenti che influenzano la funzione mitocondriale nelle cellule CVE. Il consumo di ossigeno Rate (OCR) viene registrato dal bioanalizzatore utilizzando un approccio di profilatura farmacologico, combinando l&#39;uso di quattro perturbatori mitocondriali: oligomicina, carbonile cianuro-4 (trifluoromethoxy) fenilidrazone (FCCP), rotenone, e antimicina A. In questo protocollo, abbiamo dettaglio un approccio ottimizzato che consente la misurazione e il calcolo dei parametri funzionali mitocondriali nelle cellule CVE, tra basale respirazione mitocondriale, la produzione di ATP, perdita protonica, la respirazione massima, e capacità respiratoria ricambio, in un singolo test.

<table><tbody><tr><td>linea cellulare bEnd.3</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>25 - 30 passaggi</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>10% concentrazione finale</td></tr><tr><td>Penicillina/Steptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>1&times; 100 calze</td></tr><tr><td>0,25% tripsina, 0,03% EDTA soluzione</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td>1.0 &; M concentrazione finale</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>CAS 50-99-7</td><td>25 mM concentrazione finale</td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>1.0 &micro; M concentrazione finale</td></tr><tr><td>Carbonilcianuro 4-(trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP)</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>0,5 &micro; M concentrazione finale</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>1.0 &micro; M concentrazione finale</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma</td><td>CAS 1397-94-0</td><td>1.0 &micro; M concentrazione finale</td></tr><tr><td>Stazione di lavaggio delle piastre</td><td>Cavalluccio marino Bioscienze</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizzante del flusso extracellulare&nbsp; &nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare a flusso extracellulare</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Cartuccia sensore di flusso extracellulare</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione calibrante per il flusso extracellulare</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di analisi del flusso extracellulare</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102365-100</td><td>PH tamponato prima del test</td></tr></tbody></table>

valutazione della funzione bioenergetica in cellule endoteliali vascolare cerebrale

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

L&#39;integrità del sangue-cervello-barriera (BBB) ​​è fondamentale per prevenire lesioni cerebrali. endoteliale vascolare cerebrale (CVE), le cellule sono uno dei tipi di cellule che compongono il BBB; queste cellule hanno una domanda molto alta energia, che richiede la funzione mitocondriale ottimale. In caso di malattia o lesione, la funzione mitocondriale in queste cellule può essere alterato, causando malattia o l&#39;apertura della BBB. In questo manoscritto, si introduce un metodo per misurare la funzione mitocondriale in cellule CVE utilizzando interi, cellule intatte e un Bioanalyzer. Un test mito stress viene utilizzato per sfidare le cellule che sono state perturbate, fisicamente o chimicamente, e valutare la loro funzione bioenergetica. Inoltre, questo metodo fornisce anche un modo utile per lo screening di nuove terapie che hanno effetti diretti sulla funzione mitocondriale. Abbiamo ottimizzato la densità cellulare necessaria per produrre consumi di ossigeno che consentono il calcolo di una varietà di para mitocondrialemetri, tra cui la produzione di ATP, la respirazione massima, e la capacità di riserva. Mostriamo anche la sensibilità del test, dimostrando che l&#39;introduzione del microRNA, miR-34a, porta ad una diminuzione marcata e rilevabile in attività mitocondriale. Mentre i dati riportati nel presente documento è ottimizzato per la linea cellulare bEnd.3, abbiamo anche ottimizzato il protocollo per le cellule primarie CVE, suggerendo ulteriormente l&#39;utilità in modelli preclinici e clinici.

Per valutare la funzione bioenergetica delle cellule CVE in risposta allo stress ossidativo, abbiamo scelto il microvascolare cerebrale linea di cellule murine endoteli bEnd.3, che visualizza le stesse caratteristiche di barriera comparativi primario microvascolari cerebrali cellule endoteliali 12. Dato che la cinetica e intensità relativa risposta sono variati tra i vari tipi di cellule, la prima serie di esperimenti sono stati progettati per ottenere livelli misurabili OCR identificando il numero ottimale di cellule bEnd.3 da utilizzare nel saggio per profili metabolici, presenti in Figura 2. in seguito alla valutazione, i dati vengono quantificati e presentati in Figura 3. respirazione basale, la respirazione massima, e capacità respiratoria ricambio mostrato una risposta proporzionale con densità cellulare. Tuttavia, la produzione di ATP è diminuita quando sono stati selezionati 64 × 10 3 cellule per bene, suggerendo che la coltura cellulare over-confluenti ènon adatto per questo esperimento. Le densità cellulare ottimale verificano dell&#39;8 - 32 × 10 3 cellule per pozzetto, sulla base della risposta agli interferenti mitocondriali. Per esperimenti successivi, una densità di semina di 16 × 10 3 cellule per pozzetto è stato usato per consentire il rilevamento ottimale delle variazioni OCR. Utilizzando 16 × 10 3 cellule per bene, abbiamo osservato le risposte attese in OCR e dimostrato che il microRNA miR-34a riduce la funzione mitocondriale in cellule CVE (Figura 4). Abbiamo già riferito che miR-34a ridotta fosforilazione ossidativa in queste cellule 13. Gli esperimenti ripetuti hanno inoltre dimostrato che la respirazione massima e la capacità di riserva sono stati notevolmente diminuito dalla sovraespressione di miR-34a in CVE a 24 ore dopo la trasfezione, anche se la respirazione basale, la produzione di ATP, e perdita protonica non ha avuto cambiamenti significativi (figura 4) . Questi datidimostrare la sensibilità del bioanalizzatore per rilevare i cambiamenti nella funzione mitocondriale in CVE. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> Figura 1. Pianificazione strategica per l&#39;esperimento. La timeline per la cella, piatto, e la preparazione della cartuccia è indicato. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> Figura 2. Raw Dati rappresentativi della Funzione bioenergetico in cellule CVE con varie densità delle cellule. I tassi di consumo di ossigeno sono stati misurati in cellule CVE con diverse densità di cellule. I dati rappresentano media ± DS (n = 5); OCR: Ossigeno Consumo Tasso; FCCP: carbonile cianuro-4- (trifluoromethoxy) fenilidrazone;<html> Rot / Anti-A: rotenone e antimicina A. ①, ② e ③ indicano la respirazione basale; ④, ⑤ e ⑥ indicare ATP legato respirazione; ⑦, ⑧, e ⑨ indicare massimo la respirazione; ⑩, ⑪ e ⑫ indicare la respirazione non mitocondriale. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> Figura 3. Risultati rappresentativi della funzione bioenergetica nelle celle CVE con varie densità delle cellule. Respirazione basale, la produzione di ATP, respirazione massima, e la capacità di riserva sono calcolati a partire dai dati grezzi generati dai bioenergetica saggio funzionale in figura 2 utilizzando le formule indicate nella sezione 4 . I dati rappresentano i media ± SD (n = 5); OCR: ossigeno Consumo Rate.<html> f = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> Figura 4: Rappresentante dei risultati di riduzione della funzione bioenergetica di miR-34a (A) i dati grezzi di mitocondriale seguente funzione sovraespressione di miR-34a a 24 ore dopo la trasfezione.. (B) la respirazione basale, la produzione di ATP, la respirazione massima, e la capacità di riserva sono calcolate a partire dai dati grezzi generati dai bioenergetica saggio funzionale in figura 4A; i parametri sono calcolati dalle formule di cui al punto 4. La sovraespressione di miR-34a riduce la funzione mitocondriale in cellule CVE a 24 ore dopo la trasfezione. I dati rappresentano media ± DS (n = 5); OCR: ossigeno Consumo Rate. ****, P &lt;0,0001.file / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> Tabella 1. Lo strumento Run protocollo.

mitocondri delle cellule endoteliali sono fondamentali per mantenere l&#39;integrità del sangue-cervello barriera. Introduciamo un protocollo per misurare la funzione bioenergetico nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali.

Valutazione della funzione bioenergetica in cellule endoteliali vascolare cerebrale

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Gli obiettivi generali di questa procedura sono valutare in che modo le alterazioni della funzione mitocondriale influenzano lo sviluppo dei disturbi neurologici e progettare terapie che abbiano un effetto diretto sull'apertura della barriera ematoencefalica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei disturbi neurologici, ad esempio come minimizzare la morte cellulare neuronale dopo un ictus. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una valutazione in tempo reale della funzione mitocondriale in cellule intere e integre.Dopo aver coltivato le cellule endoteliali vascolari cerebrali in mezzo completo, in un fiasco per colture cellulari di superficie pari a 75 cm², a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a raggiungere una confluenza dell'80%, scartare il mezzo di coltura cellulare e risciacquare le cellule con tripsina EDTA. Quindi aggiungere da uno a due millilitri di tripsina EDTA fresca al fiasco e staccare le cellule a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Dopo aver verificato al microscopio invertito che le cellule si sono staccate, arrestare la reazione aggiungendo delicatamente 10 millilitri di mezzo cellulare completo fresco e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione.Eliminare il soprannatante e lavare il pellet in 10 millilitri di mezzo di crescita completo fresco per un’ulteriore centrifugazione. Successivamente, risospendere il pellet nel mezzo di crescita completo a una concentrazione di due volte 10 alla quinta cellule per millilitro per il sottocoltivo. Dopo il numero appropriato di sottocoltivi, seminare 1,6 volte 10 alla quarta cellule in 80 microlitri di mezzo completo per pozzetto, in una piastra per coltura cellulare a 96 pozzetti con flusso extracellulare, e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.Una volta che le cellule si sono attaccate alla piastra, aggiungere il trattamento di interesse nei pozzetti appropriati e reinserire le cellule nell'incubatore. Il giorno precedente il saggio di valutazione della funzionalità mitocondriale, idratare una cartuccia del sensore per flusso extracellulare con 150 microlitri di soluzione calibrante per flusso extracellulare e incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius in assenza di anidride carbonica. La mattina seguente, utilizzare la stazione per il lavaggio delle piastre per sostituire il mezzo di coltura cellulare con mezzo per saggio di flusso extracellulare a pH 7,0.Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius, senza anidride carbonica, per 30-60 minuti. Una volta che le cellule hanno raggiunto l'equilibrio, inserire la cartuccia idratata nel Bioanalyzer e fare clic sul pulsante Avvia per iniziare la calibrazione. Al termine della calibrazione, fare clic sul messaggio Sblocca cartuccia per rimuovere la piastra inferiore della cartuccia e caricare la piastra delle cellule.Quindi aprire il file di dati per ottenere i valori di velocità dal Bioanalyzer ed esportarli nel file di foglio di calcolo. Poiché la cinetica e l'intensità relativa delle risposte variano tra i diversi tipi di cellule endoteliali vascolari cerebrali, in questi esperimenti è stata utilizzata una serie di concentrazioni di cellule bEnd.3 per identificare il numero ottimale di cellule per la misurazione dei livelli di velocità di consumo dell'ossigeno in un saggio di profilazione metabolica.Come osservato, la respirazione basale e massimale e la capacità respiratoria di riserva mostrano una risposta proporzionale alla densità cellulare. Tuttavia, la produzione di ATP diminuisce quando viene utilizzata la concentrazione più elevata di cellule per pozzetto, suggerendo che una coltura cellulare sovraconfluente non è adatta per l'esperimento. Le densità cellulari ottimali sembrano verificarsi nella gamma media di numero di cellule per pozzetto.Pertanto, i livelli previsti del tasso di consumo di ossigeno sono stati valutati in questo esperimento rappresentativo utilizzando una concentrazione cellulare media, dimostrando che le molecole di mRNA precursori non codificanti riducono la funzione mitocondriale nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali. Questi esperimenti dimostrano inoltre che la respirazione massimale e la capacità di riserva sono significativamente ridotte dall'overespressione di queste molecole nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali a 24 ore dal transfezione, anche se la respirazione basale, la produzione di ATP e la perdita di protoni non mostrano variazioni significative. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due giorni.Dalla semina delle cellule all'analisi della funzione mitocondriale, se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare che la determinazione della densità cellulare ottimale è estremamente importante prima di iniziare qualsiasi altro esperimento. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come saggi di vitalità cellulare o di glicolisi, per rispondere ad ulteriori domande sui cambiamenti della funzione mitocondriale indotti da una ridotta vitalità cellulare o da alterazioni in altre vie metaboliche.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della funzione mitocondriale, consentendo l'utilizzo di cellule integre al posto di mitocondri isolati per lo studio di diverse patologie, tra cui malattie neurologiche, cancro o disturbi metabolici. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare la funzione mitocondriale nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali.

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Questo metodo descrive come isolare e immortalare cellule endoteliali microvascolari di cervello di topo. Descriviamo un passo-passo protocollo partire dalla omogeneizzazione del tessuto cerebrale, mineralizzazione, semina e immortalizzazione delle cellule. Di solito, ci vogliono circa cinque settimane per ottenere una omogenea, immortalato linea microvascolare delle cellule endoteliali.

Generazione di un immortalato Murine Linea microvascolare Brain Cell endoteliali come<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Cervello Modello barriera

Questo video dimostra la valutazione del funzionamento mitocondriale delle cellule endoteliali vascolari cerebrali (CVE) utilizzando un test di flusso extracellulare. Le cellule CVE sono piastrate in una piastra di coltura cellulare a flusso extracellulare. I sensori di flusso extracellulare vengono idratati prima di essere caricati e calibrati nel bioanalizzatore. La piastra contenente le celle viene quindi caricata per l'analisi.

Valutazione della funzione mitocondriale nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali

La disfunzione endoteliale è associata a numerose patologie ed è predittivo di eventi cardiovascolari avversi negli esseri umani. Vasodilatazione flusso-mediata (FMD) è un metodo ad ultrasuoni non invasivo di valutazione della funzione endoteliale. Scelte metodologiche ed esperienza dell'operatore possono influenzare i risultati. Un approccio sistematico per l'afta epizootica negli studi sull'uomo è discusso qui.

Ecografia Valutazione della endoteliali-dipendente flusso-mediata vasodilatazione dell&#39;arteria brachiale in Ricerca Clinica

Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) sono interconnesse da specifiche proteine giunzionali che formano una barriera altamente regolata che separa il sangue e il sistema nervoso centrale (SNC), la cosiddetta barriera emato-encefalica (BBB). L'isolamento delle cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello murino, come discusso in questo protocollo, consente studi dettagliati in vitro della BEE.

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

Il presente articolo descrive le considerazioni metodologiche per diverse valutazioni non invasive della funzione vascolare e della morfologia che sono comunemente utilizzate nella ricerca medica per valutare diversi stadi dell'aterosclerosi.

Un approccio metodologico alle valutazioni non invasive di funzione vascolare e morfologia

Descriviamo un semplice test su cellule-base per la rilevazione, la quantificazione e il monitoraggio dell'attività dei membri della famiglia endoteliale vascolare del fattore di crescita dei leganti. Il saggio utilizza recettori chimerici espressi in una linea cellulare fattore dipendente per fornire una valutazione semiquantitativa o quantitativa di legame recettoriale e reticolazione del legante.

Un saggio biologico semplice per la valutazione dei fattori di crescita dell&#39;endotelio vascolare

Ha dimostrato qui sono protocolli per isolamento (1) appena endothelial cerebrali intatti "tubi" e misure (2) simultanee di calcio endoteliale e potenziale durante endotelio-derivato hyperpolarization della membrana. Inoltre, questi metodi consentono per la sintonizzazione farmacologico di calcio delle cellule endoteliali e segnali elettrici come variabili sperimentali individuali o interattive.

Misurazioni simultanee di calcio intracellulare e potenziale di membrana nell'endotelio cerebrale Mouse appena isolato ed intatto

Vi presentiamo tre semplici saggi in vitro: il saggio di migrazione a lunga distanza, il saggio di co-cultura sulla migrazione e l'analisi chemio-attrazione-che valutano collettivamente le funzioni delle cellule staminali umane derivate cellule endoteliali periventricolari e le loro interazione con gli interneuroni GABAergic.

Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

La preparazione intensiva di "tubi" endoteliali cerebrali di topo intatti da arteriole parenchimali cerebrali è illustrata per lo studio della regolazione del flusso sanguigno cerebrale. Inoltre, dimostriamo i punti di forza sperimentali di questo modello di studio endoteliale per l'imaging a fluorescenza e la misurazione elettrofisiologica delle principali vie di segnalazione cellulare, compresi i cambiamenti nel potenziale intracellulare [Ca2+] e di membrana.

Isolamento e analisi funzionale dell'endotelio arteriolare del parenchima cerebrale del topo

Questo protocollo descrive un modello in vitro affidabile ed efficiente della barriera emato-encefalica. Il metodo utilizza cellule endoteliali vascolari cerebrali di topo bEnd.3 e misura la resistenza elettrica transmembrana.

Registrazione dell'integrità funzionale della barriera su cellule endoteliali vascolari bEnd.3 tramite rilevamento della resistenza elettrica transendoteliale

Qui dimostriamo la tecnica di utilizzo di biosensori basati sull'impedenza: ECIS e cellZscope, per misurare la forza della barriera endoteliale cerebrale. Descriviamo in dettaglio la preparazione e la tecnica per aggiungere vari stimoli a un modello in vitro dell'endotelio cerebrale. Misuriamo, registriamo e forniamo un'analisi rappresentativa dei risultati.

Misurazione dei cambiamenti nell'integrità della barriera endoteliale cerebrale con due biosensori basati sull'impedenza in risposta alle cellule tumorali e alle citochine

Scopri come valutare la funzione mitocondriale in cellule endoteliali vascolari cerebrali per studiare l'integrità della barriera ematoencefalica. Questo metodo permette analisi in tempo reale su cellule intatte.

Valutazione della funzione bioenergetica in cellule endoteliali vascolare cerebrale

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