Valutazione della funzione bioenergetica in cellule endoteliali vascolare cerebrale

Gli obiettivi generali di questa procedura sono valutare in che modo le alterazioni della funzione mitocondriale influenzano lo sviluppo dei disturbi neurologici e progettare terapie che abbiano un effetto diretto sull'apertura della barriera ematoencefalica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei disturbi neurologici, ad esempio come minimizzare la morte cellulare neuronale dopo un ictus. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una valutazione in tempo reale della funzione mitocondriale in cellule intere e integre.

Dopo aver coltivato le cellule endoteliali vascolari cerebrali in mezzo completo, in un fiasco per colture cellulari di superficie pari a 75 cm², a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a raggiungere una confluenza dell'80%, scartare il mezzo di coltura cellulare e risciacquare le cellule con tripsina EDTA. Quindi aggiungere da uno a due millilitri di tripsina EDTA fresca al fiasco e staccare le cellule a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Dopo aver verificato al microscopio invertito che le cellule si sono staccate, arrestare la reazione aggiungendo delicatamente 10 millilitri di mezzo cellulare completo fresco e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione.

Eliminare il soprannatante e lavare il pellet in 10 millilitri di mezzo di crescita completo fresco per un’ulteriore centrifugazione. Successivamente, risospendere il pellet nel mezzo di crescita completo a una concentrazione di due volte 10 alla quinta cellule per millilitro per il sottocoltivo. Dopo il numero appropriato di sottocoltivi, seminare 1,6 volte 10 alla quarta cellule in 80 microlitri di mezzo completo per pozzetto, in una piastra per coltura cellulare a 96 pozzetti con flusso extracellulare, e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.

Una volta che le cellule si sono attaccate alla piastra, aggiungere il trattamento di interesse nei pozzetti appropriati e reinserire le cellule nell'incubatore. Il giorno precedente il saggio di valutazione della funzionalità mitocondriale, idratare una cartuccia del sensore per flusso extracellulare con 150 microlitri di soluzione calibrante per flusso extracellulare e incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius in assenza di anidride carbonica. La mattina seguente, utilizzare la stazione per il lavaggio delle piastre per sostituire il mezzo di coltura cellulare con mezzo per saggio di flusso extracellulare a pH 7,0.

Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius, senza anidride carbonica, per 30-60 minuti. Una volta che le cellule hanno raggiunto l'equilibrio, inserire la cartuccia idratata nel Bioanalyzer e fare clic sul pulsante Avvia per iniziare la calibrazione. Al termine della calibrazione, fare clic sul messaggio Sblocca cartuccia per rimuovere la piastra inferiore della cartuccia e caricare la piastra delle cellule.

Quindi aprire il file di dati per ottenere i valori di velocità dal Bioanalyzer ed esportarli nel file di foglio di calcolo. Poiché la cinetica e l'intensità relativa delle risposte variano tra i diversi tipi di cellule endoteliali vascolari cerebrali, in questi esperimenti è stata utilizzata una serie di concentrazioni di cellule bEnd.3 per identificare il numero ottimale di cellule per la misurazione dei livelli di velocità di consumo dell'ossigeno in un saggio di profilazione metabolica.

Come osservato, la respirazione basale e massimale e la capacità respiratoria di riserva mostrano una risposta proporzionale alla densità cellulare. Tuttavia, la produzione di ATP diminuisce quando viene utilizzata la concentrazione più elevata di cellule per pozzetto, suggerendo che una coltura cellulare sovraconfluente non è adatta per l'esperimento. Le densità cellulari ottimali sembrano verificarsi nella gamma media di numero di cellule per pozzetto.

Pertanto, i livelli previsti del tasso di consumo di ossigeno sono stati valutati in questo esperimento rappresentativo utilizzando una concentrazione cellulare media, dimostrando che le molecole di mRNA precursori non codificanti riducono la funzione mitocondriale nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali. Questi esperimenti dimostrano inoltre che la respirazione massimale e la capacità di riserva sono significativamente ridotte dall'overespressione di queste molecole nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali a 24 ore dal transfezione, anche se la respirazione basale, la produzione di ATP e la perdita di protoni non mostrano variazioni significative. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due giorni.

Dalla semina delle cellule all'analisi della funzione mitocondriale, se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare che la determinazione della densità cellulare ottimale è estremamente importante prima di iniziare qualsiasi altro esperimento. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come saggi di vitalità cellulare o di glicolisi, per rispondere ad ulteriori domande sui cambiamenti della funzione mitocondriale indotti da una ridotta vitalità cellulare o da alterazioni in altre vie metaboliche.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della funzione mitocondriale, consentendo l'utilizzo di cellule integre al posto di mitocondri isolati per lo studio di diverse patologie, tra cui malattie neurologiche, cancro o disturbi metabolici. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare la funzione mitocondriale nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali.