Valutazione della funzione bioenergetica in cellule endoteliali vascolare cerebrale

Gli obiettivi generali di questa procedura sono valutare in che modo le alterazioni della funzione mitocondriale influenzano lo sviluppo di disturbi neurologici e progettare terapie che abbiano un effetto diretto sulle aperture della barriera emato-encefalica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei disturbi neurologici, ad esempio come si può ridurre al minimo la morte delle cellule neuronali dopo un ictus? Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una valutazione in tempo reale della funzione mitocondriale in cellule intere intatte.

Dopo aver coltivato le cellule endoteliali vascolari cerebrali in terreno completo, in un pallone di coltura tissutale quadrato da 75 centimetri, a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica all'80% di confluenza, scartare il terreno di coltura cellulare e sciacquare le cellule con tripsina EDTA. Quindi aggiungere uno o due millilitri di tripsina EDTA fresca al pallone e staccare le cellule a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Dopo aver confermato che le cellule sono state sollevate al microscopio invertito, interrompere la reazione con l'aggiunta delicata di 10 millilitri di terreno cellulare completo fresco e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri per la centrifugazione.

Scartare il surnatante e lavare il pellet in 10 millilitri di terreno di coltura fresco completo per un'altra centrifugazione. Quindi risospendere il pellet in un terreno di crescita completo a una concentrazione di due volte 10 al quinto di cellule per millilitro per la subcoltura. Dopo il numero appropriato di sottocolture, seminare 1,6 volte 10 fino alla quarta cellula in 80 microlitri di terreno completo per pozzetto, su una piastra di coltura cellulare a flusso extracellulare da 96 pozzetti e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Quando le cellule si sono attaccate alla piastra, aggiungere il trattamento di interesse negli appositi pozzetti e rimettere le cellule nell'incubatore. Il giorno prima del test di valutazione funzionale mitocondriale, idratare una cartuccia di censura del flusso extracellulare con 150 microlitri di soluzione calibrante del flusso extracellulare e incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica. La mattina successiva, utilizzare la stazione di lavaggio delle piastre per trasformare il terreno di coltura cellulare in un terreno di saggio del flusso extracellulare a pH 7,0.

Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius, senza anidride carbonica, per 30-60 minuti. Quando le cellule si sono equilibrate, caricare la cartuccia idratata nel bioanalizzatore e fare clic sul pulsante Avvia per iniziare la calibrazione. Al termine della calibrazione, fare clic sul prompt Sblocca cartuccia per rimuovere la piastra inferiore della cartuccia e caricare la piastra della cella.

Quindi aprire il file di dati per ottenere i valori di velocità dal bioanalizzatore per l'esportazione nel file del foglio di calcolo. Dato che la cinetica e l'intensità relativa delle risposte variano tra i diversi tipi di cellule endoteliali vascolari cerebrali, in questi esperimenti, una serie di concentrazioni di bEnd. 3 cellule sono state utilizzate per identificare il numero ottimale di cellule per misurare i livelli del tasso di consumo di ossigeno in un saggio di profilazione metabolica.

Come osservato, le respirazioni basali e massimali e la capacità respiratoria di riserva dimostrano una risposta proporzionale alla densità cellulare. La produzione di ATP, tuttavia, diminuisce quando viene utilizzata la più alta concentrazione di cellule per pozzetto, suggerendo che una coltura cellulare troppo confluente non è adatta per l'esperimento. Con le densità cellulari ottimali che sembrano verificarsi nella gamma media del numero di cellule per pozzetto.

Pertanto, i livelli attesi del tasso di consumo di ossigeno sono stati valutati in questo esperimento rappresentativo utilizzando una concentrazione cellulare di fascia media, dimostrando che le molecole di mRNA precursori non codificanti riducono la funzione mitocondriale nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali. Questi esperimenti dimostrano anche che la respirazione massima e la capacità di riserva sono significativamente diminuite dalla sovraespressione di queste molecole nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali a 24 ore dalla trasfezione, anche se la respirazione basale, la produzione di ATP e la perdita di protoni non mostrano cambiamenti significativi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due giorni.

Dalla placcatura delle cellule all'accesso alla funzione mitocondriale, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che determinare la densità cellulare ottimale è estremamente importante prima di iniziare qualsiasi altra procedura. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la vitalità cellulare o i saggi glicolitici, per rispondere a ulteriori domande sui cambiamenti che si verificano nella funzione mitocondriale a causa di una ridotta vitalità cellulare o di cambiamenti in altre vie metaboliche.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della funzione mitocondriale per l'utilizzo di cellule intatte all'interno di mitocondri isolati e una varietà di malattie, tra cui malattie neurologiche, cancro o disturbi metabolici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come accedere alla funzione mitocondriale nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali.