Analisi cinematica di divisione cellulare e di espansione: Quantificare la base cellulare della crescita e dello sviluppo di campionamento zone in Zea mays Foglie

Gli obiettivi generali di questa analisi sono determinare le basi cellulari della crescita delle foglie di mais e utilizzare questi dati per studiare i meccanismi di regolazione della crescita molecolare eseguendo strategie di campionamento specifiche per lo sviluppo. Questo metodo può aiutare ad affrontare una domanda chiave nella biologia dello sviluppo delle piante. In che modo la divisione cellulare e l'espansione cellulare contribuiscono alle differenze nella crescita dell'intero organo?

Questo approccio consente lo studio e la mappatura spaziale dei processi biochimici, molecolari e fisiologici, alla base della crescita dell'intero organo vegetale. Sebbene questo sistema possa fornire informazioni sulla crescita delle foglie di mais, la tecnica può essere utilizzata per altri sistemi. Comprese altre specie erbacee e organi.

La dimostrazione visiva di questi metodi è fondamentale. Al momento della raccolta, la bi-blazione del campione e le fasi di misurazione sono difficili da eseguire senza tale dimostrazione. A dimostrare la procedura, saranno Katrien Sprangers e Viktoriya Avramova.

Due studenti di dottorato del mio laboratorio. Per eseguire un'analisi chenematica completa della crescita fogliare nelle monocotiledoni, coltivare almeno 15 piante per ogni trattamento e genotipo, in condizioni controllate in una stanza di crescita. Quando appare una foglia di interesse, usa un righello per misurare la lunghezza della foglia, cioè la lunghezza dal terreno alla punta della foglia, ogni giorno fino a quando la foglia non è completamente espansa.

Nella fase di sviluppo di interesse, tagliare la parte fuori terra della pianta da almeno cinque piante rappresentative il più vicino possibile alle radici, per mantenere intatta la regione meristematica. Poi, partendo dalle foglie esterne, srotolate delicatamente tutte le foglie fino alla foglia di interesse, una ad una. Togliendo qualche millimetro in più dalla base per staccare le foglie se necessario.

Successivamente, rimuovete l'apice e le foglioline racchiuse dalla foglia di interesse, e tagliate un segmento di tre centimetri dalla foglia, partendo dalla base su un lato della vena mediana. È fondamentale tagliare la foglia proprio dove è collegata allo stelo. Poiché il taglio troppo alto, porterebbe ad una sottostima delle dimensioni del meristema.

Conservare il segmento in una provetta da 1,5 millilitri, riempita con tre soluzioni di acido acetico etanolo assoluto due un volume per volume, a quattro gradi Celsius per 24 ore fino a diversi mesi. Dall'altro lato della vena, tagliare un segmento di 11 centimetri dalla base e conservare questo segmento in un tubo da 15 millilitri riempito di etanolo assoluto, a quattro gradi Celsius per almeno sei ore per rimuovere i pigmenti. Dopo un secondo giro di 24 ore in etanolo assoluto a quattro gradi Celsius, sostituire l'etanolo con acido lattico puro e conservare il segmento a quattro gradi Celsius per altre 24 ore, o fino a ulteriori analisi.

Per misurare il meristema, trasferire prima il segmento fogliare di tre centimetri nel tampone di risciacquo appena preparato per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire il segmento in un contenitore di soluzione colorante Dapi, per due-cinque minuti su ghiaccio al buio. Quindi, montare rapidamente il tessuto su un vetrino da microscopio in vetro e coprire il segmento con un vetro di copertura.

Confermare la fluorescenza delle cellule epidermiche al microscopio, utilizzando la fluorescenza UV. Quindi, montare il campione in una goccia di tampone di risciacquo su un nuovo vetrino da microscopio con un nuovo coperchio di vetro. Utilizzando un ingrandimento di 20 volte, riportare il segmento al microscopio e scorrere il campione per individuare le figure mitotiche proliferative.

Evitare qualsiasi divisione cellulare formativa degli stemmi in via di sviluppo, e quindi definire dove si trova la figura mitotica più distale. Utilizzando un programma software di analisi delle immagini, misurare l'intera lunghezza del fotogramma dell'immagine. In questo esempio, 645 micrometri.

Quindi conta il numero di fotogrammi che coprono l'intera lunghezza del meristema dalla figura mitotica più distale alla base della foglia e moltiplica questo numero per la lunghezza di un fotogramma per ottenere l'intera lunghezza del meristema. Per ottenere un profilo di lunghezza cellulare, trasferire il segmento di 11 centimetri dall'acido lattico al banco e utilizzare un bisturi per tagliare il tessuto in segmenti di 10 centimetri. Monta i segmenti di foglia risultanti su un singolo vetrino da microscopio e una piccola goccia di acido lattico.

Posizionando tutti i pezzi con lo stesso lato rivolto verso l'alto. Quindi, trasferire il vetrino al microscopio dotato di ottica a contrasto interferenziale differenziale. A partire dal segmento più vicino alla base della foglia, utilizzare un programma software di analisi delle immagini appropriato per misurare la lunghezza di almeno 20 cellule epidermiche replicate e file direttamente adiacenti alle lime stemmatiche, per garantire la selezione coerente dello stesso tipo di cellula in posizioni equidistanti lungo ciascuno dei segmenti.

Prendi sono per abbassare la posizione corrispondente per ogni misurazione in tutta la foglia. Quindi determinare la lunghezza media della cella in ogni millimetro lungo l'asse della foglia utilizzando una procedura di livellamento polinomiale locale implementata nello script R che è disponibile come file supplementare. Fare attenzione a non lisciare eccessivamente.

L'arrotondamento dovrebbe rimuovere il rumore nei dati delle celle, ma non influire sulla forma complessiva della curva. Qui viene mostrato un confronto tra piante ben irrigate e piante sottoposte a condizioni di stress da siccità in termini di crescita fogliare. La lunghezza finale delle foglie delle piante di controllo era inferiore del 40% rispetto a quella delle piante stressate dalla siccità, a causa di un minore tasso di allungamento delle foglie.

Il tasso di allungamento fogliare delle piante stressate dalla siccità, è inferiore del 73% rispetto a quello dei controlli ben irrigati, a causa di una ridotta produzione cellulare. Che in tern, è principalmente causato da un ridotto tasso di divisione cellulare. L'analisi cinematica fornisce una mappa della localizzazione della zona di crescita delle foglie, consentendo il campionamento con una risoluzione subzonale per analisi molecolari e biochimiche.

Ad esempio, la quantificazione dell'MDA lungo la zona di crescita della foglia di mais in piante sottoposte a condizioni di controllo e siccità ben irrigate, dimostra un aumento significativo di questo prodotto della degradazione lipidica in tutta la zona di crescita in risposta a condizioni di ritenzione idrica. A causa dell'accorciamento delle foglie in risposta alla siccità, le zone di sviluppo non corrispondevano nel controllo e nelle piante stressate in questo esperimento. Utilizzando il profilo di lunghezza cellulare, tuttavia, è possibile determinare la lunghezza delle zone di sviluppo, consentendo di confrontare i livelli di MDA nelle singole zone.

Una volta padroneggiato, un singolo campione può essere elaborato in quattro ore, se la tecnica viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di mantenere intatto il meristema durante la raccolta. Seguendo questa procedura, possono essere applicate altre tecniche, come la determinazione di parametri molecolari e biochimici, per studiare il loro coinvolgimento nella regolazione della crescita.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la divisione cellulare e l'espansione cellulare nella foglia di mais in crescita, determinare le dimensioni delle diverse zone di crescita e interpretare di conseguenza i dati molecolari e biochimici. Non dimenticare che lavorare con acidi lattico e acetico e EDTA può essere pericoloso. Pertanto, quando si esegue questa procedura, è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e pulire il microscopio in ogni fase dopo l'uso.