Analisi cinematica di divisione cellulare e di espansione: Quantificare la base cellulare della crescita e dello sviluppo di campionamento zone in

Gli obiettivi generali di questa analisi sono determinare la base cellulare della crescita della foglia del mais e utilizzare questi dati per indagare i meccanismi molecolari che regolano la crescita, attraverso strategie di campionamento specifiche per stadio dello sviluppo. Questo metodo può contribuire a rispondere a una domanda fondamentale della biologia dello sviluppo vegetale: in che modo la divisione cellulare e l'espansione cellulare contribuiscono alle differenze nella crescita dell'organo nel suo complesso?

Questo approccio consente l'indagine e la mappatura spaziale di processi molecolari biochimici e fisiologici alla base della crescita dell'intero organo vegetale. Sebbene questo sistema possa fornire informazioni sulla crescita della foglia di mais, la tecnica può essere utilizzata anche per altri sistemi, inclusi altre specie di graminacee e altri organi.

La dimostrazione visiva di questi metodi è fondamentale. Le fasi di raccolta, bi-frammentazione del campione e misurazione risultano difficili da eseguire senza tale dimostrazione. La procedura sarà dimostrata da Katrien Sprangers e Viktoriya Avramova.

Due studenti di dottorato del mio laboratorio. Per eseguire un'analisi completa della crescita fogliare in modo cienematico nei monocotiledoni, coltivare almeno 15 piante per ogni trattamento e genotipo, in condizioni controllate all'interno di una stanza di crescita. Quando appare una foglia di interesse, utilizzare un righello per misurare la lunghezza della foglia, ovvero la distanza dal terreno fino all'apice della foglia, ogni giorno fino a quando la foglia non si è completamente espansa.

Nella fase di sviluppo di interesse, tagliare la parte aerea della pianta da almeno cinque piante rappresentative il più vicino possibile alle radici, in modo da mantenere intatta la regione meristematica. Successivamente, partendo dalle foglie esterne, srotolare delicatamente tutte le foglie fino a quella di interesse, una alla volta. Rimuovere alcuni millimetri aggiuntivi dalla base per staccare le foglie secondo necessità.

Successivamente, rimuovere l'apice e le piccole foglie racchiuse dalla foglia di interesse, e tagliare un segmento di tre centimetri dalla foglia, partendo dalla base su un lato della nervatura centrale. È fondamentale tagliare la foglia esattamente nel punto in cui è collegata al fusto. Un taglio troppo alto porterebbe a una sottostima delle dimensioni del meristema.

Conservare il segmento in un tubo da prova da 1,5 millilitri, riempito con una soluzione di etanolo assoluto e acido acetico in rapporto volumetrico 3:1, a quattro gradi Celsius per 24 ore fino a diversi mesi. Dall'altro lato della vena, tagliare un segmento di 11 centimetri a partire dalla base e conservare questo segmento in un tubo da 15 millilitri riempito con etanolo assoluto, a quattro gradi Celsius per almeno sei ore per rimuovere i pigmenti. Dopo un secondo ciclo di 24 ore in etanolo assoluto a quattro gradi Celsius, sostituire l'etanolo con acido lattico puro e conservare il segmento a quattro gradi Celsius per altre 24 ore, oppure fino all'analisi successiva.

Per misurare il meristema, trasferire innanzitutto il segmento fogliare di tre centimetri in un tampone di risciacquo appena preparato per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire il segmento in un contenitore di soluzione colorante Dapi, per due-cinque minuti sul ghiaccio al buio. Successivamente, montare rapidamente il tessuto su un vetrino da microscopio in vetro e coprire il segmento con un coprioggetto.

Verificare la fluorescenza delle cellule epidermiche al microscopio, utilizzando la fluorescenza UV. Quindi, montare il campione in una goccia di tampone di risciacquo su un nuovo vetrino da microscopio con un nuovo coprioggetto in vetro. Utilizzando un ingrandimento di 20 volte, riposizionare il segmento sul microscopio e scorrere il campione per individuare le figure mitotiche proliferative.

Evitare qualsiasi divisione cellulare formativa degli stemmi in via di sviluppo, quindi definire dove si trova la figura mitotica più distale. Utilizzando un software di analisi delle immagini, misurare la lunghezza totale del campo dell'immagine. In questo esempio, 645 micrometri.

Quindi, contare il numero di fotogrammi che coprono l'intera lunghezza del meristema, dalla figura mitotica più distale alla base della foglia, e moltiplicare questo numero per la lunghezza di un singolo fotogramma per ottenere la lunghezza totale del meristema. Per ottenere un profilo della lunghezza cellulare, trasferire il segmento di 11 centimetri dall'acido lattico al banco di lavoro e utilizzare un bisturi per tagliare il tessuto in 10 segmenti da un centimetro ciascuno. Montare i segmenti fogliari risultanti su un unico vetrino da microscopio insieme a una piccola goccia di acido lattico.

Disporre tutti i pezzi con lo stesso lato rivolto verso l'alto. Successivamente, trasferire il vetrino sotto un microscopio dotato di ottica a contrasto di interferenza differenziale. A partire dal segmento più vicino alla base della foglia, utilizzare un opportuno software di analisi delle immagini per misurare la lunghezza di almeno 20 cellule epiderniche replicate e delle file adiacenti alle file stomatiche, al fine di garantire una selezione coerente dello stesso tipo cellulare in posizioni equidistanti lungo ciascun segmento.

Prestare attenzione a scrivere la posizione corrispondente per ciascuna misurazione lungo la foglia. Quindi determinare la lunghezza media della cellula ad ogni millimetro lungo l'asse della foglia utilizzando una procedura di smoothing polinomiale locale implementata nello script R disponibile come file supplementare uno. Prestare attenzione a non eseguire un eccessivo smoothing.

La levigatura dovrebbe eliminare il rumore nei dati della crescita fogliare, senza alterare la forma complessiva della curva. Qui viene mostrato un confronto tra piante ben irrigate e piante sottoposte a stress da siccità in termini della loro crescita fogliare. La lunghezza finale delle foglie delle piante di controllo era inferiore del 40 percento rispetto a quella delle piante stressate dalla siccità, a causa di una minore velocità di allungamento fogliare.

Il tasso di allungamento fogliare delle piante sottoposte a stress da siccità è inferiore del 73 percento rispetto ai controlli ben irrigati, a causa di una ridotta produzione cellulare. A sua volta, ciò è principalmente causato da una ridotta velocità di divisione cellulare. L'analisi cinematica fornisce una mappa della localizzazione della zona di crescita della foglia, consentendo il campionamento con una risoluzione subzonale per analisi molecolari e biochimiche.

Ad esempio, la quantificazione dell'MDA lungo la zona di crescita della foglia di mais in piante sottoposte a condizioni di controllo ben irrigate e a condizioni di siccità mostra un aumento significativo di questo prodotto della degradazione lipidica in tutta la zona di crescita in risposta alla carenza idrica. A causa dell'accorciamento della foglia in risposta alla siccità, le zone di sviluppo non corrispondevano tra piante di controllo e piante stressate in questo esperimento. Tuttavia, utilizzando il profilo della lunghezza cellulare, è possibile determinare la lunghezza delle zone di sviluppo, consentendo il confronto dei livelli di MDA nelle singole zone.

Una volta acquisita padronanza, un singolo campione può essere processato in quattro ore, se la tecnica viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere intatto il meristema durante il suo prelievo. Dopo questa procedura, possono essere applicate altre tecniche, come la determinazione di parametri molecolari e biochimici, per studiarne il coinvolgimento nella regolazione della crescita.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la divisione cellulare e l'espansione cellulare nella foglia in crescita del mais, determinare le dimensioni delle diverse zone di crescita e interpretare di conseguenza i dati molecolari e biochimici. Non dimenticare che lavorare con acidi lattico e acetico ed EDTA può essere pericoloso. Pertanto, è sempre necessario adottare precauzioni come indossare guanti e pulire il microscopio dopo ogni utilizzo quando si esegue questa procedura.