Il disegno sperimentale per Microdissezione laser RNA-Seq: Lezioni da una analisi dello sviluppo di mais Leaf

L'obiettivo generale di questo metodo è quantificare l'accumulo di trascritti in cellule specifiche o domini cellulari in modo che possano essere effettuati confronti tra domini diversi o tra domini equivalenti in campioni mutanti e wild type. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo, come ad esempio come vengono specificati i domini degli organi o come specifiche mutazioni influenzano l'espressione genica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'accumulo di trascritti può essere quantificato in domini minuti, definiti con precisione, troppo piccoli per essere sezionati a mano.

Prima di iniziare questa procedura, coltivare piantine di mais in condizioni standard fino a due settimane di vita. Per sezionare gli apici dei germogli per le sezioni laterali, asportare prima una piantina appena sotto la linea del suolo. Quindi usa una lama di rasoio per rimuovere le fette sottili dalla base del gambo fino a quando non è visibile un ovale di calma circondato da una o due foglie mature.

Fai un altro taglio a circa 10 millimetri sopra la base. Questo segmento di 10 millimetri contiene il meristema apicale del germoglio nei primordi delle foglie giovani. Ruota il segmento di 10 millimetri in modo che la base sia rivolta verso l'alto.

Eseguire due tagli paralleli all'asse laterale per ottenere un vetrino di tessuto di due o tre millimetri di spessore. Scartare le due parti esterne e conservare la fetta centrale per il fissaggio e l'inclusione. Immergere la fetta di tessuto in circa 10 millilitri di contadini fissati in una fiala di vetro su ghiaccio.

Dopo che tutti i campioni sono stati sezionati, applicare il vuoto per rimuovere le bolle d'aria e favorire la penetrazione del fissativo. Tenere premuto l'aspirapolvere per 10 minuti, quindi rilasciare lentamente l'aspirapolvere. Sostituire il fissativo e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte agitando delicatamente.

Il giorno seguente, continuare a processare i tessuti per l'inclusione come descritto nel protocollo di testo. Per fondere i blocchi di paraffina, posizionare gli stampi di inclusione su una piastra calda della stazione di inclusione dei tessuti e utilizzare una pinza per trasferire i campioni di tessuto negli stampi di inclusione con la superficie tagliata rivolta verso il basso. Posizionare l'anello di incorporamento sulla parte superiore dello stampo.

Rabboccare ogni stampo con paraffina fusa. Trasferire gli stampini su una piastra fredda fino a quando la paraffina non si sarà solidificata. Conservare i blocchi di paraffina in un contenitore ermetico con gel di silice a quattro gradi Celsius.

Le sezioni vengono tagliate da blocchi di paraffina su un microtomo seguendo le procedure standard e le sezioni mediane che includono il meristema apicale del germoglio vengono selezionate per il montaggio. Per montare le sezioni sui vetrini, posizionare i vetrini privi di RNasi o cotti su uno scaldavetrini a 42 gradi Celsius. Applicare diverse gocce di soluzione di etanolo al 50% per coprire ogni vetrino.

Appoggiare delicatamente le sezioni sul vetrino e far galleggiare le sezioni sulla soluzione di etanolo fino a quando non si sono espanse. Quindi, inclinare il vetrino e rimuovere la soluzione di etanolo in eccesso mediante aspirazione con una pipetta di trasferimento monouso. Utilizzare salviette prive di lanugine per rimuovere qualsiasi soluzione di etanolo aggiuntiva.

Asciugare i vetrini a 42 gradi Celsius per diverse ore o durante la notte. Quando i vetrini sono asciutti, conservarli in un contenitore ermetico con gel di silice a quattro gradi Celsius. Deparaffinizzare i vetrini il giorno della microdissezione.

Prepara tre barattoli di vetro Coplin, due barattoli che contengono circa 50 millilitri di xileni al 100% e un barattolo contenente circa 50 millilitri di etanolo al 100%. Immergere i vetrini in xileni uno per due minuti, xileni due per due minuti ed etanolo al 100% per un minuto. Scolare i vetrini su salviette prive di lanugine e asciugarli all'aria a temperatura ambiente.

Per iniziare questa procedura, fissare i vetrini sul tavolino del microscopio di microdissezione laser. Un fattore critico per il successo della microdissezione laser negli esperimenti RNasic è l'uso di marcatori morfologici e molecolari per selezionare domini precisi per la microdissezione. Esaminare i vetrini utilizzando un obiettivo 5X e identificare le cinque sezioni più mediane di ciascun vetrino utilizzando l'apice del meristema apicale del germoglio come punto di riferimento centrale.

Quindi, utilizzare un obiettivo 10X o 20X per identificare la posizione della ligula sul primordio a sette foglie plastocrono di ciascuna sezione. La ligula sarà visibile come una protuberanza che sporge dalla superficie adassiale del primordio fogliare. Utilizzare lo strumento di disegno del software di microdissezione laser per contrassegnare questa posizione.

Seleziona l'icona del disegno a mano libera, sposta il cursore nella posizione appropriata, quindi fai clic e trascina il mouse per disegnare. Il passaggio successivo consiste nell'utilizzare il righello e lo strumento di disegno rettangolare per misurare rettangoli alti 100 micrometri centrati su una ligula di ciascuna sezione come campioni di ligula. Per utilizzare lo strumento righello, selezionare l'icona del righello, spostare il cursore su un'estremità della regione da misurare, quindi fare clic e trascinare per misurare la regione.

La lunghezza del righello verrà mostrata sullo schermo. Usa lo strumento righello per misurare un segmento di 100 micrometri centrato su una ligiola. Per disegnare un rettangolo, selezionare lo strumento di disegno in linea retta e disegnare quattro linee rette.

Allo stesso modo, misura rettangoli da 100 micrometri posizionati 50 micrometri sopra e sotto il rettangolo della ligua. Questi saranno i campioni di lama e fodero. Microdissezionare i rettangoli misurati utilizzando la funzione di taglio laser per tagliare la sezione di tessuto lungo il contorno del dominio selezionato e la funzione di catapulta per spingere il rettangolo del tessuto fuori dal vetrino nel coperchio del tubo.

Raccogli i campioni di lipula, lama e fodero in provette separate. Utilizzare la stessa procedura per microdissezionare campioni epidermici assiali di lame, ligule e guaine da primordi a sette foglie plastocroni. Infine, applicare il tampone di estrazione dell'RNA al tessuto microsezionato e procedere con l'estrazione dell'RNA, l'amplificazione dell'RNA, la costruzione della libreria, il sequenziamento e l'analisi bioinformatica come descritto nel manoscritto.

Quando l'accumulo del trascritto è stato analizzato e tutti gli strati cellulari delle regioni della lama, della ligiola e della guaina, sono stati trovati 2.359 geni espressi in modo differenziale. Nelle regioni adassiali della lama epidermica, della ligula e della guaina, sono stati trovati 3.128 geni espressi in modo differenziale. Le analisi di microdissezione laser, RLM, sequenziamento dell'RNA e ibridazione in situ hanno fornito risultati coerenti, come illustrato da questi geni rappresentativi.

I cartoni animati a sinistra illustrano il LM di tutti gli strati cellulari e i cartoni animati a destra illustrano il LM solo dell'epidermide adassiale. Le punte delle frecce nelle immagini indicano le ligole emergenti. L'accumulo di un trascritto era significativamente più alto nella ligula sia in tutti gli strati cellulari che nel LM epidermico. La guaina stretta uno era significativamente sovraregolata nella regione della ligula sia in tutti gli strati cellulari LM che nell'epidermide adassiale LM, e si accumula specificamente nella punta della liguaina emergente.

Un gene di funzione sconosciuta aveva un riconteggio medio più alto nella LM epidermica della ligula rispetto alla LM di tutti gli strati. Il quarto gene, Zm PIN1a, non era significativamente espresso in modo differenziale nell'analisi di tutti gli strati cellulari, ma era significativamente sovraregolato nella ligula nell'analisi della sola epidermide. La sua elevata espressione nel tessuto vascolare può aver confuso le differenze nell'accumulo di trascritti nell'epidermide quando sono stati raccolti tutti gli strati cellulari.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che la scelta dei domini cellulari da microsezionare e confrontare e l'accuratezza delle microdissezioni sono cruciali per il successo degli esperimenti.