Packaging proteine ​​diretto all'interno della membrana esterna vescicole da Escherichia coli: Progettazione, produzione e purificazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di purificare e caratterizzare le vescicole della membrana esterna batterica riempite di enzimi per l'uso come reagenti catalitici in vitro. Questa tecnica di isolamento enzimatico consente di raccogliere OMV batterici da terreni di coltura e quindi di impiegarli per condurre la catalisi senza cellule di un composto organofosfato. L'imballaggio diretto all'interno di OMV batterici migliora significativamente la stabilità enzimatica in una serie di condizioni di reazione e conservazione, a differenza delle tecniche tradizionali che spesso provocano una perdita graduale e continua dell'attività enzimatica.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono al confezionamento di proteine rilevanti in molteplici campi, come lo sviluppo di terapie, la bonifica o lo sviluppo di sistemi catalitici privi di cellule. Sebbene questo protocollo descriva in dettaglio la purificazione di OMV da E.coli, le tecniche con modifiche alla strategia di confezionamento potrebbero essere facilmente utilizzate per la purificazione di OMV da una varietà di colture cellulari microbiche. Dopo aver generato vescicole della membrana esterna o OMV nei batteri secondo il protocollo di testo, centrifugare il terreno di coltura batterica intatto a 7.000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Rimuovere e conservare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare. Quindi, sottoporre il surnatante a una seconda centrifuga per assicurarsi che tutti i batteri vengano rimossi dal terreno. Per rimuovere gli aggregati proteici e il materiale cellulare di grandi dimensioni dal terreno di coltura salvato, aspirare la soluzione in una siringa sterile da 10 a 50 millilitri.

Collegare un filtro da 0,45 micron per attirare l'estremità della siringa. Quindi premere lo stantuffo e raccogliere il flusso in un nuovo tubo. In alternativa, filtrare sottovuoto il terreno di coltura trasferendolo in un apparecchio di filtrazione sterile.

Collegare l'unità a una pompa a vuoto o a un aspiratore per lavello per generare l'aspirazione. Trasferire il mezzo filtrato in un nuovo recipiente. Per isolare gli OMV, trasferire il terreno di coltura filtrato in provette per ultracentrifugazione.

Far girare il fluido a circa 150.000 volte G e quattro gradi Celsius per tre ore utilizzando un rotore che corrisponde ai tubi utilizzati. Subito dopo l'ultracentrifugazione per evitare la perdita di massa del pellet, decantare il terreno di coltura impoverito di OMV dal pellet OMV leggermente marrone, che può essere visibile o meno a occhio nudo. Il pellet OMV formato dopo l'ultracentrifugazione può essere aderito solo in modo lasco alla vescicola di centrifugazione.

Prestare attenzione durante la decantazione per assicurarsi che il pellet non si stacchi e vada perso. Conservare il surnatante per la successiva diffusione dinamica della luce per verificare che le particelle OMV siano state completamente esaurite dal mezzo. Aggiungere da 0,5 a un millilitro di PBS filtrato sterile, PH 7,4 o altro tampone filtrato come determinato dalle esigenze o dalle condizioni sperimentali, al pellet e lasciarlo incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quindi pipettare con cura la soluzione OMV purificata, mescolando delicatamente per assicurarsi che l'intero pellet sia stato solubilizzato. Per determinare la distribuzione dimensionale OMV, aprire il software di tracciamento delle nanoparticelle DLS per lo strumento in uso. Accendere il microscopio e pulire tutte le superfici del microscopio e dell'unità di tracciamento delle nanoparticelle.

Utilizzando una siringa sterile da un millilitro, aggiungere circa 0,5 millilitri di campione OMV direttamente alla finestra di visualizzazione del dispositivo di tracciamento delle particelle attraverso il raccordo inferiore, avendo cura di coprire l'intera finestra di visualizzazione senza iniettare bolle d'aria nel sistema. Posizionare l'unità di tracciamento delle nanoparticelle sul tavolino del microscopio e accendere il laser. Quindi fare clic su Acquisisci nel software.

Regolare la messa a fuoco e il tavolino del microscopio per visualizzare le particelle sulla schermata di anteprima presente nella finestra del software. Regola l'otturatore della fotocamera e il guadagno della fotocamera fino a quando le particelle luminose non vengono visualizzate chiaramente su uno sfondo scuro. Regola la durata dell'acquisizione su 60 secondi, quindi fai clic su Registra.

Quando richiesto, inserire la temperatura del dispositivo di campionamento, etichettare il campione e salvare i dati video al termine di ogni corsa in una cartella designata dall'utente. Mantenete tutti i parametri di analisi in modalità di rilevamento automatico e fate clic su Sequenza processo (Process Sequence). Registra la distribuzione e la concentrazione delle dimensioni delle particelle come particelle per millilitro come determinato dal software.

Per determinare il contenuto proteico OMV, utilizzare SDS-PAGE e Western Blots per valutare la purezza della produzione di enzimi OMV e l'efficienza di reticolazione tra SpyCatcher o SC e SpyTag o ST. È imperativo confermare l'espressione degli enzimi bersaglio e della proteina di ancoraggio. L'espressione di proteine ricombinanti può spesso non avere successo per una serie di motivi e la produzione di proteine dovrebbe essere confermata prima della caratterizzazione dell'OMV.

Per eseguire un saggio di attività della fosforisterasi o del PTE, aggiungere cinque microlitri di una diluizione da uno a 1.000 di paraoxon nel tampone CHES a cinque microlitri di OMV purificati in 90 microlitri di CHES. Effettuare letture dell'assorbanza a 405 nanometri e 348 nanometri ogni 20 secondi per circa due ore di tempo di reazione totale per monitorare la progressione del prodotto di degradazione cromogenica del paraoxon p-nitrofenolo. Infine, eseguire l'analisi dei dati secondo il protocollo di testo.

Di seguito sono mostrati esempi della morfologia degli OMV purificati da E.coli tramite SEM. Gli OMV hanno dimensioni comprese tra 50 e 250 nanometri, come determinato utilizzando la strumentazione di tracciamento delle particelle. In questo grafico viene mostrata la concentrazione assoluta di OMV.

Quando l'OMP-A-ST N terminale è stato co-trasformato con PTE-SC in presenza di arabinosio e IPTG, è stato osservato un aumento significativo della produzione di OMV rispetto ai campioni di controllo. La SDS-PAGE e i Western Blot visti qui caratterizzano ulteriormente il contenuto proteico OMV e l'espressione proteica ricombinante per OMP-A-ST, OMP-A nativo, PTE-SC e OMP-A-ST-PTE-SC. In questa figura, i livelli complessivi di espressione di PTE e l'efficienza di confezionamento dell'OMV nei pellet cellulari, nel surnatante UC e nei pellet OMV UC purificati sono stati determinati mediante misurazioni iniziali della velocità utilizzando il paraoxon come substrato cromogenico.

Qui, Triton X-100 è stato utilizzato per verificare la traslocazione del paraoxon attraverso doppi strati OMV intatti. C'era poca differenza di attività con o senza detergente, indicando che il paraoxon passa liberamente attraverso i pori endogeni sull'OMV. Infine, come visto in questo esperimento, i dati cinetici di PTE-SC sono adattati a un'equazione cinetica enzimatica standard di Michaelis-Menten per N terminale OMP-A-ST co-trasformato con PTE-SC in presenza di arabinosio e IPTG e PTE-SC in presenza di attivazione dell'arabinosio.

Una volta che tutti i costrutti genetici sono stati realizzati e confermati, il confezionamento enzimatico e la purificazione OMV possono essere realizzati in un periodo di due giorni. Un terzo giorno è necessario per confermare e caratterizzare gli OMV ogni volta che viene sviluppato un nuovo costrutto. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di verificare le valutazioni di sicurezza di tutti i materiali e le apparecchiature di centrifugazione.

Inoltre, è importante verificare il successo di ogni passaggio prima di procedere al successivo. Le fasi di caratterizzazione qui descritte possono essere integrate con altre per confermare l'impacchettamento enzimatico e la morfologia dell'OMV. La concentrazione proteica, il contenuto lipidico, la concentrazione di LPS e molte altre proprietà possono variare in base ai diversi carichi utili e alle condizioni di adduzione e possono influenzare le applicazioni a valle.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare e caratterizzare gli OMV pieni di enzimi, nonché condurre saggi preliminari per valutare l'attività del carico enzimatico. Non dimenticare che lavorare con batteri e reagenti chimici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario utilizzare sempre precauzioni come un'adeguata tecnica asettica e dispositivi di protezione individuale.