Name: Packaging proteine diretto allinterno della membrana esterna vescicole da Escherichia coli: Progettazione, produzione e purificazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Scopri come purificare e caratterizzare vescicole di membrana esterna (OMV) di Escherichia coli contenenti enzimi per applicazioni catalitiche in vitro. Questo metodo migliora la stabilità enzimatica rispetto alle tecniche tradizionali.

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Questa ricerca è stata finanziata dall'Office of Naval Research attraverso i fondi Core forniti al Naval Research Laboratory.

1. Preparazione di plasmidi <ol><li> Preparare un plasmide (ad esempio, pET22) contenente la proteina di ancoraggio (OmpA) fusa a un dominio di legame biortogonale (di cui al presente protocollo come anchor-ST), tag epitopo (come 6xHis, myc o la bandiera tag per la purificazione e identificazione), tag periplasmic localizzazione, la resistenza agli antibiotici, e l&#39;origine appropriata di replica in base al ceppo batterico selezionato 7. <ol><li> Estrarre il DNA plasmide da culture durante la notte utilizzando un kit di isolamento del DNA disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore. </li></ol></li><li> Preparare un plasmide (ad esempio, pACYC184) contenente l&#39;enzima / proteine (PTE) da confezionare all&#39;interno della OMV fusa al dominio di legame bioorthogonal complementare a quella della proteina di ancoraggio (denominato nel presente protocollo come enzima-SC), epitopo, tag periplasmic localizzazione, la resistenza agli antibiotici che è diverso da quello del plasmide proteine ​​di ancoraggio, e orig appropriatain di replica basata sul ceppo batterico selezionato 7. <ol><li> Estrarre il DNA plasmide da culture durante la notte utilizzando un kit di isolamento del DNA disponibile in commercio seguendo il protocollo 7 del produttore. </li></ol></li></ol> 2. Generazione di un OMV Packaging E. coli Cultura <ol><li> Isolamento plasmidi <ol><li> Purificare plasmidi che codificano l&#39;enzima-SC costruire ed ancoraggio-ST costruisce da linee cellulari di manutenzione separati utilizzando un kit di isolamento plasmide commerciale come da protocollo 7 del produttore. Determinare la concentrazione di DNA e la purezza misurando l&#39;assorbanza a 260 nm e 280 nm. </li></ol></li><li> Co-trasformazione <ol><li> Selezionare un ceppo di E. coli che è disponibile in commercio per facilitare l&#39;espressione delle proteine. NOTA: BL21 cellule (DE3) sono stati utilizzati qui. Il lysogen T7 è necessaria per l&#39;espressione del costrutto ancoraggio-ST, che si basa sul promotore T7 e T7 RNA polimerasi per protespressione ein. L&#39;uso di altri ceppi batterici richiede o la presenza del gene lysogen T7 o l&#39;uso di un plasmide diverso pET22 7. </li><li> Diluire purificato DNA plasmidico a concentrazioni molari equivalenti poi trasformarle in cellule batteriche competenti tramite uno shock termico trasformazione o elettroporazione seguenti protocollo del produttore per le cellule competenti scelti. </li><li> cellule piastra trasformato Onto antibiotico contenente Luria-Bertani (LB) piastre di agar sia con ampicillina (pET22) e cloramfenicolo (pACYC184); entrambi presenti a concentrazioni finali di 25 ug / ml. </li><li> Porre la capsula cultura a 37 ° C durante la notte per isolare solo i cloni che contengono entrambi i plasmidi. NOTA: Le colonie che sopravvivono selezione antibiotica saranno utilizzati per tutti i futuri preparati OMV. Antibiotici (ampicillina e cloramfenicolo) saranno aggiunti a tutti colture liquide per mantenere la pressione selettiva e garantire la presenza di entrambi i plasmidi. </li></ol></li></ol> 3. OMV Produzione <ol><li> Colony espansione <ol><li> Seminare 5 ml di terreni di coltura (tipicamente Brodo Terrific (TB) o LB) contenenti antibiotici alle concentrazioni di cui sopra (punto 2.2.3) con una singola colonia dalle piastre di selezione descritti al punto 2.2.4. </li><li> Eseguire una diluizione 1: 100 volte della coltura starter durante la notte in fiasche di coltura sconcertato. NOTA: utilizzare un volume di file multimediali tra 250-500 ml. </li><li> Mantenere la coltura a 37 ° C agitando a 250 rpm per garantire che sufficiente aerazione della cultura è raggiunto. </li></ol></li><li> Induzione di ogni plasmide <ol><li> Lasciare che la coltura batterica a crescere ad un OD 600 di 0,6-0,8, a circa 3 ore di crescita dopo l&#39;inoculazione del pallone di crescita primario. </li><li> Per migliorare la resa finale del PTE-SC vescicole caricate, centrifugare l&#39;intera cultura a 7.000 xg per 15 min. Risospendere il pellet di cellule in pre-riscaldato, terreni di coltura fresco. NOTA: Questo optionale passaggio consente di rimuovere qualsiasi OMV vuoto che sono presenti nel terreno di coltura prima dell&#39;induzione PTE-SC. </li><li> Ottenere una soluzione stock al 20% di L-arabinosio in acqua e filtro sterile utilizzando un filtro di 0,22 micron. Conservare la soluzione L-arabinosio a 4 ° C per 2-4 settimane. </li><li> Aggiungere la soluzione L-arabinosio al pallone di coltura ad una concentrazione finale dello 0,2% di avviare la produzione PTE-SC. NOTA: Questo aiuta a precaricare spazio periplasmatico con PTE-SC prima di promuovere una maggiore vescicolazione attraverso l&#39;induzione del mutante OmpA-ST. </li><li> Fare una soluzione 1 M isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in acqua e filtro sterile utilizzando un filtro di 0,22 micron. NOTA: IPTG deve essere utilizzato immediatamente una volta idratato. Aliquote di IPTG possono essere conservati congelati per 3-6 mesi e possono essere scongelati immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Aggiungere IPTG dopo un ulteriore periodo di incubazione 3 ore ad una concentrazione finale di 0,5 mM di avviare la produzione del OmpA-ST. </li><li> Lasciare che il culture a crescere per un ulteriore 8-14 ore a 37 ° C sotto agitazione. </li></ol></li></ol> 4. OMV Purificazione <ol><li> Rimozione dei batteri Intact <ol><li> Centrifugare terreni di coltura batterica per 15 min a 7000 xga 4 ° C per sedimentare batteri intatti. </li><li> Decantare, e salvare, i media la parte superiore del post centrifugazione pellet cellulare facendo attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Ripetere i punti 4.1.1 e 4.1.2 per un ciclo di centrifugazione ulteriore per garantire tutti i batteri intatti vengono rimossi dal terreno di coltura avendo cura di decantare e salvare i media. </li></ol></li><li> La rimozione di aggregati proteici <ol><li> Ulteriori purificare il terreno di coltura batterica usando un filtro da 0,45 micron a membrana per rimuovere batteri residui e grande materiale cellulare indesiderato. NOTA: utilizzare un materiale a membrana biologicamente compatibile per i recuperi più elevati e minore assorbimento di proteine, come acetato di cellulosa (CA) o polivinilidene difluoruro (PVDF). volumi filtri Siringa meno di 100 ml e volumi filtra sotto vuoto superiore a 100 ml. <ol><li> Per il filtro della siringa, disegnare terreno di coltura in siringa sterile 10-50 ml. Fissare 0,45 micron filtro per Luer fine della siringa. Premere stantuffo e raccogliere flusso continuo in una nuova nave. </li><li> Per aspirare il filtro, il trasferimento terreno di coltura ad un apparato di filtrazione sterile. Fissare unità a vuoto della pompa o affondare aspiratore per generare aspirazione. Trasferimento medio filtrata a nuova nave. </li></ol></li></ol></li><li> Isolamento di OMV via Ultracentrifugazione <ol><li> Aggiungere il terreno di coltura filtrato in tubi centrifugazione facendo attenzione a bilanciare i tubi opposte nella centrifuga. </li><li> Pellet a ~ 150.000 xg per 3 ore a 4 ° C in un&#39;ultracentrifuga utilizzando il rotore corrispondente corrispondenza dello strumento e tubi essendo utilizzata. </li><li> Decantare il terreno di coltura impoverito OMV dal pellet OMV, facendo attenzione a non disturbare il pellet OMV, immediatamente al completamento of centrifugazione a consentire il pellet OMV rimanere nei media ammorbidire il pellet riducendo recupero OMV. NOTA: Questo pellet sarà leggermente marrone e seconda della quantità di partenza di coltura batterica può o non può essere visibile ad occhio. Aspirare il supporto direttamente dalla parte superiore del tubo di centrifugazione è anche un&#39;opzione tenendo presente che i media più rimossi dal OMV pellet più pura campione finale OMV sarà. </li><li> Salvare il surnatante centrifugato per la prova successiva Dynamic Light Scattering (DLS) per verificare che le particelle OMV sono state completamente esaurite da parte dei media. </li><li> Aggiungere 0,5-1 ml di soluzione sterile a pH 7,4 o 100 mM N -Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic tampone filtrata tampone fosfato (PBS) Acido (CHES) a pH 8,0 al pellet OMV permettendogli di incubare per 30 minuti a RT. Assicurarsi che il pellet non si asciughi. NOTA: Gli sbalzi di soluzione forza ionica, il pH e la temperatura può causare ridotta solubilità OMV e promuovere aggregazione. </li><li> pipetta con attenzione la soluzione purificata OMV dalla provetta, mescolando delicatamente per garantire l&#39;intero pellet è stato solubilizzato. </li></ol></li></ol> 5. OMV Caratterizzazione <ol><li> Utilizzare qualsiasi software DLS o di monitoraggio nanoparticelle disponibile in commercio seguendo i protocolli del produttore fornito uniche per ogni strumento per determinare la distribuzione delle dimensioni OMV e concentrazione di particelle. NOTA: Qui, distribuzione delle dimensioni OMV e la concentrazione è stata determinata utilizzando NanoSight LM10 nanoparticelle di monitoraggio e NTA 2.3 Software di analisi. <ol><li> Aprire il software. </li><li> Accendere il microscopio e pulire tutte le superfici dell&#39;unità microscopio e il monitoraggio delle nanoparticelle. </li><li> Aggiungere ~ 0,5 ml di OMV campione direttamente alla finestra di visualizzazione del dispositivo di tracciamento di particelle attraverso il raccordo Luer con 1 ml siringa sterile avendo cura di coprire l&#39;intera finestra di visualizzazione senza iniettare eventuali bolle d&#39;aria nel sistema. </li><li> luogo tegli nanoparticelle unità di monitoraggio sul palco microscopio e accendere il laser. </li><li> Fai clic su &quot;Capture&quot; nel software. </li><li> Regolare il fuoco microscopio e mettere in scena per visualizzare le particelle sullo schermo di anteprima presente nella finestra del software. </li><li> Regolare il &quot;Shutter&quot; e &quot;guadagno della telecamera&quot; fino a quando le particelle brillanti sono chiaramente visualizzati su uno sfondo scuro. </li><li> Regolare la durata di cattura per 60 sec. </li><li> Fai clic su &quot;Record&quot;. </li><li> Quando richiesto, immettere la temperatura del / dispositivo campione, etichettare il campione, e salvare i dati video al termine della ciascuna correre in una cartella utente designato. </li><li> Tenere tutti i parametri di analisi (Rilevazione soglia, Blur, lunghezza minima traccia, Min atteso Particle Size) su auto modalità di rilevamento e cliccare su &quot;svolgimento del processo.&quot; NOTA: Consultare il manuale per come ogni parametro può essere regolato in modo indipendente per fini risultati delle analisi sintonia. </li><li> Record distribuzione granulometrica e particelle / mconcentrazione l come determinato dal software. NOTA: Una tipica gamma di dimensioni idrodinamica OMV è compresa tra 30-200 nm con una concentrazione di particelle / ml di ~ 10 x 10 8. </li></ol></li><li> Determinazione OMV contenuto proteico <ol><li> Utilizzare SDS-PAGE e protocolli standard Western Blot per valutare la purezza OMV, la produzione di enzimi, e l&#39;efficienza di reticolazione SC-ST 7. NOTA: La reticolazione efficienza non sarà al 100% 7. </li></ol></li></ol> 6. Verifica di Enzyme Packaging <ol><li> PTE Activity Assay <ol><li> Eseguire tutti saggi enzimatici in un tampone adatto ad esempio 100 mM CHES tampone (pH 8) a 25 ° C sia in una cuvetta o multiplato in un piatto ben 96/384. </li><li> Aggiungere 5 ml di una diluizione 1: 1.000 in tampone paraoxon CHES a 90 ml di CHES e 5 ml di purificato OMV (~ 36 volte concentrato rispetto alla concentrazione OMV presente nei mezzi di coltura). Attenzione: Paraoxon è un pesticida tossicoe deve essere gestito per produttore e linee guida istituzionali. </li><li> Le letture di assorbanza a intervalli regolari (ogni 20 sec per ~ tempo di reazione totale di 2 ore) a 405 nm (ε = 18.1 mM -1 cm -1) e a 348 nm (ε punto isosbestic = 5.4 mM -1 cm -1) monitorare la progressione della reazione il prodotto guasto paraoxon cromogenico, p -nitrophenol. NOTA: A valori di pH superiore a 8 è presente la forma deprotonato dominante di p -nitrophenol consentendo accurato monitoraggio a 405 nm. In tutte le altre soluzioni pH complessa o inferiore è necessario utilizzare il punto isosbestico di 348 nm come molteplici forme di p -nitrophenol saranno presenti. </li><li> Calcolare velocità di reazione iniziali determinando la pendenza della porzione lineare delle curve progressi dal punto 6.1.3 di confrontare in ciascun campione, efficienza confezionamento e produzione totale PTE la quantità relativa di PTE. </li><li> Eseguire enzimatica di serieprotocolli di analisi per determinare K M, V max e K gatto per la OMV incapsulati PTE. NOTA: un&#39;analisi Lineweaver-Burk può essere utilizzato per la determinazione di questi parametri cinetici dove l&#39;intercetta = 1 / V max e pendenza = K M / V max 20. </li></ol></li><li> Transmembrane substrato / diffusione del prodotto. <ol><li> Eseguire la stessa analisi analisi cinetica come descritto al punto 6.1 utilizzando concentrazioni crescenti di Triton X-100 in tampone CHES da 0-3% in volume. NOTA: L&#39;aggiunta di Triton X-100 per le funzioni solubilizzate OMV perturbare il doppio strato lipidico consentendo il contenuto della OMV il libero accesso alla soluzione di reazione. </li><li> Calcolare e confrontare le velocità iniziali per ogni livello di Triton X-100 per verificare transmembrana passaggio del substrato / prodotto indicato dal minimo cambiamento nell&#39;attività enzimatica (velocità iniziali) rispetto al enzimatica in mancanza di Triton X-100. Se un sostanziale aumento dell&#39;attività enzimatica è osservata in presenza di Triton X-100 è probabile che il substrato non diffonde liberamente nel OMV. </li><li> attività enzimatica libera Assay (come descritto sopra nel paragrafo 6.1) in presenza di Triton X-100 per verificare che l&#39;attività enzimatica non è inibita dal tensioattivo stesso. NOTA: Se l&#39;attività è notevolmente influenzato dalle Triton X-100, additivi alternativi, come saponine o vari polisorbato / tensioattivi interpolazione può essere più adatto alla rottura della membrana OMV. </li></ol></li></ol> 7. OMV bagagli <ol><li> Congelamento <ol><li> aliquote luogo ~ 100 ml di purificato OMV direttamente in azoto liquido a scatto per congelare il aliquote assicurandosi di non immergere completamente le fiale o contattare qualsiasi azoto liquido con il campione stesso. NOTA: purificata OMV può essere congelato a scatto direttamente nel buffer che è stato selezionato per solubilizzare il pellet OMV durante il depuprocesso ionico senza crioprotettori supplementari necessari 7. </li><li> Conservare le aliquote a scatto congelato a -80 ° C. </li><li> Scongelare aliquote congelate dal punto 7.1.1 mettendoli a temperatura ambiente assicurandosi di non riscaldare i campioni. </li><li> Prima di preparare tutti i campioni per la conservazione in questo modo eseguire il saggio enzimatico descritto al punto 6.1 confrontando velocità iniziali prima e dopo il congelamento per verificare che non vi è alcuna perdita significativa di attività enzimatica dopo congelamento-scongelamento. NOTA: Conservare purificato OMV a 4 ° C se una riduzione dell&#39;attività enzimatica si osserva dovuti al gelo. </li></ol></li><li> Liofilizzazione <ol><li> Lyophilize gli snap congelato purificati aliquote OMV che utilizzano attrezzature liofilizzazione disponibili in commercio 21. </li><li> Conservare aliquote liofilizzato a temperatura ambiente per settimane oa -80 ° C per molti mesi. </li><li> Aggiungere lo stesso volume di acqua purificata al liofilizzato OMV come prima liofilizzazione e lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 min per reidratare tlui campione. Mescolare delicatamente quando sia necessario assicurarsi di non vortice o ultrasuoni la OMV. </li><li> Aggiungere polvere liofilizzata OMV direttamente al punto di cura per le applicazioni dove prima diluizione / solubilizzazione non è necessario. </li></ol></li></ol>

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<li>Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-superpositive+GFP+reassembly+is+a+fast%2C+efficient%2C+and+robust+method+for+detecting+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+BioSyst%22%5BJournal%5D)">Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo.</a> Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).</li>
<li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils%3A+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li>
<li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li>
<li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li>
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<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme%2Fprotein+packaged+bacterial+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Delivery%22%5BJournal%5D)">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo funzioni di protocollo per dimostrare un rappresentante dirette tecnica imballaggio in cui viene prodotto e confezionato in OMV da E. coli un enzima di interesse. Come per molte tecniche complesse ci sono più aree in cui il protocollo può essere modificato per ospitare per l&#39;utilizzo in diverse applicazioni uniche, alcune delle quali sono descritte di seguito. Mentre il meccanismo di imballaggi OMV e l&#39;enzima incapsulamento può essere adattata alle esigenze specifiche ci sono diversi passaggi all...

Qui presentata è un metodo per la progettazione, produzione e purificazione di vescicole enzimi batterici caricato membrana esterna (OMV). OMV sono piccole, soprattutto unilamellare, proteoliposomi che variano nel formato 30-200 nm 1,2. Tutti i batteri Gram-negativi e Gram-positivi che sono stati studiati fino ad oggi hanno dimostrato rilascio di una OMV o vescicole extracellulari (EV) dalla loro superficie 3,4. Il meccanismo preciso con cui sono prodotti OMV devono ancora essere completamente chiarito causa delle diverse popolazioni batteriche che loro così come le funzioni diverse che servono secernono. OMV hanno dimostrato di trasportare una vasta gamma di carico da piccole molecole, peptidi e proteine di materiale genetico serve una varietà di segnalazione complesso, gene traslocazione, e virulenza FUNZIONI 5,6. I meccanismi esatti di OMV biogenesi non sono ben caratterizzati, e sembrano differire tra le specie batteriche. nonostante this Infatti, abbiamo sviluppato un metodo per migliorare l&#39;efficienza di confezionamento di una proteina ricombinante in OMV creando un legame sintetico tra una proteina di interesse e altamente abbondante endogena proteina alla membrana esterna batterica e successiva OMV. In assenza di un legame sintetico, o di affinità artificialmente incorporato, tra la proteina ricombinante espressa e la OMV l&#39;efficienza confezione osservato è molto basso 7. Questo risultato è prevedibile come l&#39;incorporazione delle proteine ​​all&#39;interno della OMV sia avviene attraverso l&#39;incapsulamento casualità nel momento preciso della formazione OMV in superficie batterica o attraverso il packaging diretto da meccanismi che non sono ben compresi. Qualche successo è stato osservato nel confezionamento proteine ​​semplicemente attraverso sovraespressione nello spazio periplasmatico che si basa su incapsulamento casualità ma efficace imballaggio è altamente proteina dipendente con alcune proteine ​​Confezioni ad alta efficienza rispetto ad altri tha non comprimere affatto 8-10. Utilizzando le tecniche comuni di biologia sintetica abbiamo cercato di progettare Escherichia coli (E. coli) per produrre contemporaneamente, pacchetto e secernere un enzima attivo di interesse in OMV che aggira le limitazioni attuali conoscenze su come si formano e come OMV carico viene selezionato dai batteri per confezionamento. Ai fini della presente domanda, un sistema di proteine ​​bioconjugation scaglionato è stato selezionato come il legame sintetici di scelta per facilitare confezionamento direzionale nel OMV. Come suggerisce il nome un sistema proteico bioconjugation scissione comprende due domini subunità complementari che interagiscono tra loro. I domini di proteine spaccatura selezionati ai fini del presente protocollo sono indicati come la SpyCatcher (SC) e SpyTag dominio (ST) e sono derivati dal Streptococcus pyogenes fibronectina-binding protein (FbaB) 11. Questo sistema proteina spaccatura è insolito in quanto wgallina le due subunità sono all&#39;interno di prossimità un legame isopeptide forma spontaneamente tra la prossimale aspartico residui acidi acidi e lisina aminoacidi che creano un legame covalente. Formazione del legame Isopeptide non richiede l&#39;aggiunta di proteine chaperone, enzimi catalitici o cofattori e può verificarsi facilmente a temperatura ambiente (RT) e su un ampio intervallo di condizioni fisiologicamente rilevanti 12. Come prova di concetto, phosphotriesterase (PTE) (CE 3.1.8.1) dal Brevundimonas minuto è stato scelto per essere confezionato in E. coli derivati OMV 13. PTE contiene un sito attivo binuclear Zn / Zn e ha la capacità di abbattere organofosfati attraverso una reazione di idrolisi conversione aryldialkylphosphates in dialkylphosphates e alcoli arilici 14. L&#39;esposizione a organofosfati compromette il corretto funzionamento dei neurotrasmettitori attraverso inibendo l&#39;idrolisi di acetilcolina da acetilcolinesterasi alle giunzioni neuromuscolari makincomposti derivati g organofosfati estremamente pericolose 15. Prolungata o significativa esposizione a organofosfati si traduce spesso in preda a convulsioni incontrollabili e di solito provoca la morte tramite asfissia. Mentre PTE presenta la più alta attività catalitica verso paraoxon, un insetticida molto potente, è anche in grado di idrolizzare una vasta gamma di altri pesticidi e V / tipo G agenti nervini chimici 16. Per facilitare confezionamento OMV, un plasmide batterico creata che codifica un costrutto genico che contiene un promotore inducibile, una sequenza di localizzazione periplasmatica, ea breve polylinker monte della sequenza SC gene. Inserimento del gene PTE tra il leader e la sequenza SC permette la creazione di un interruttore genetico che colpisce la proteina di fusione PTE-SC allo spazio periplasmatico per imballaggi OMV. Mentre gli sforzi descritti qui concentrano sulla PTE, il gene dell&#39;enzima è intercambiabile e può essere facilmente sostituita con un&#39;altra sequenza genica a FACconfezionamento ilitate di un enzima alternativo o proteine. Come la seconda parte del collegamento sintetico, viene scelto per presentare la sequenza peptidica ST un&#39;abbondante proteina della membrana esterna (OmpA). Mentre la scelta di proteine ​​di ancoraggio può variare, è essenziale che la proteina ha un dominio permissiva che presenta all&#39;interno dello spazio periplasmatico, tollera il costrutto di fusione senza indurre citotossicità, è noto per essere presente in OMV, e non aggrega quando è ricombinante prodotta. OmpA è un kDa proteina transmembrana 37,2 porin che è noto per essere altamente espresso nella membrana esterna batterica e conseguente OMV 17. Si è implicato nel trasporto di piccole molecole, &lt;2 nm in termini di dimensioni, attraverso la membrana batterica 18. Native OmpA ha due domini strutturalmente unici, un barile motivo transmembrana beta e una porzione C-terminale periplasmically solubile noto per interagire con il peptidoglicano 19. Nel mutante OmpA-ST fusione designed qui la porzione C-terminale della OmpA stato eliminato e la ST è stata fusa alla periplasmically fronte N- o C-Termini. Eliminare la parte periplasmic del OmpA diminuisce il numero di interazioni tra la membrana esterna e il peptidoglicano con conseguente destabilizzazione della membrana che porta a iper-vescicole 7. Genomic OmpA stata mantenuta in aggiunta al costrutto OmpA-ST ricombinante espressa per mitigare destabilizzazione membrana lordo.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>Preparare sempre fresco o aliquota e congelare.</td></tr><tr><td>L-arabinosio</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>Può essere preparato in anticipo e conservato a 4 °C.</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>aggiungere immediatamente prima dell'uso dopo che il terreno si è sufficientemente raffreddato dall'autoclave. &nbsp;</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>aggiunta immediatamente prima dell'uso dopo che il supporto si è sufficientemente raffreddato dall'autoclave. &nbsp;</td></tr><tr><td>TB/LB Terreni di coltura</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>altro terreno di coltura funzionerà probabilmente in modo simile.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Uno dei</td><td></td><td>tanti potenziali tensioattivi adatti. &nbsp;</td></tr><tr><td>Palloni di coltura sconcertati</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>I deflettori promuovono livelli più elevati di aerazione. &nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>Tampone ottimale utilizzato per la degradazione del paraoxon (pH > 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>Sostanza molto tossica da maneggiare con cura e smaltire correttamente. &nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro per siringa 0,45 &; micro; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td><td>Il diametro del filtro dipenderà dal volume del campione. La membrana a basso legame proteico è fondamentale.</td></tr><tr><td>Incubatore a scuotimento</td><td>New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>La temperatura e la miscelazione precise sono essenziali per la crescita batterica riproducibile.</td></tr><tr><td>Centrifuga per colture Sorvall</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>Centrifuga per colture di grande volume (500 ml) in grado di produrre 7.000 x g.</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga Sorvall</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>Capace di forze centrifughe &ge; 150.000 x g.</td></tr><tr><td>Rotore per ultracentrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>Assicurarsi che vengano utilizzati il rotore e le provette corretti e che tutto sia correttamente bilanciato.</td></tr><tr><td>Provette per ultracentrifuga ultratrasparenti (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>Assicurarsi che non siano presenti fratture da stress prima dell'uso e che le provette siano perfettamente bilanciate.</td></tr><tr><td>Spettrofotometro&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Necessario per saggi cinetici enzimatici.</td></tr><tr><td>DLS/tracciamento delle particelle</td><td>NanoSight&nbsp;</td><td>LM10</td><td>Necessario per la distribuzione dimensionale OMV e la determinazione della concentrazione. &nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>Ceppo di espressione batterica adatto.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>Altri plasmidi possono essere utilizzati al loro posto. &nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>Altri plasmidi possono essere utilizzati al loro posto. &nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Kit di esempio.</td></tr></tbody></table>

packaging proteine ​​diretto all&#39;interno della membrana esterna vescicole da<em&gt; escherichia coli</em&gt;: progettazione, produzione e purificazione

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Un crescente interesse per l&#39;applicazione di tecniche di biologia sintetica per programmare vescicole membrana esterna (OMV) stanno portando ad alcune applicazioni molto interessanti e uniche per OMV in cui le nanoparticelle tradizionali si stanno rivelando troppo difficili da sintetizzare. Ad oggi, tutti i batteri Gram-negativi hanno dimostrato di produrre OMV confezionamento dimostrazione di una varietà di carico che comprende piccole molecole, peptidi, proteine ​​e materiale genetico. Sulla base della loro diversa carico, OMV sono implicati in molti processi biologici che vanno dalla comunicazione cellulare per il trasferimento genico e consegna dei fattori di virulenza seconda di quale batteri producono l&#39;OMV. Solo di recente sono batterica OMV diventati accessibili per l&#39;uso in una vasta gamma di applicazioni attraverso lo sviluppo di tecniche per il controllo e il confezionamento diretta di proteine ​​ricombinanti in OMV. Questo protocollo descrive un metodo per la produzione, purificazione, e l&#39;uso di enzima confezionato OMV prevede migliorata overala produzione ll di enzima ricombinante, aumento vescicole, e una maggiore stabilità dell&#39;enzima. utilizzazione di successo di questo protocollo comporta la creazione di un ceppo batterico che produce contemporaneamente una proteina ricombinante e la dirige per OMV incapsulamento attraverso la creazione di un collegamento sintetica tra la proteina ricombinante e una proteina della membrana esterna di ancoraggio. Questo protocollo dettagli anche i metodi per isolare OMV da colture batteriche così come le tecniche di manipolazione e cose da considerare quando si adattare questo protocollo per l&#39;uso per altre applicazioni uniche quali: la consegna della droga farmaceutica, diagnostica medica e risanamento ambientale.

L&#39;espressione simultanea di due proteine ​​ricombinanti, come è richiesto per la strategia di imballaggio OMV descritto in questo protocollo, può essere realizzato attraverso diverse vie. Qui, un sistema a due vettoriale è stato utilizzato con origini compatibili di replicazione e cassette geniche inducibili separati. Per l&#39;espressione del PTE-SC costruire un backbone plasmide commerciale (pACY184) è stato progettato per includere una arabinosio inducibile cassetta genica e una d...

Viene presentato un protocollo per la produzione, la purificazione e l'uso di vescicole di membrana esterna confezionate con enzimi (OMV) che forniscono una maggiore stabilità enzimatica per l'implementazione in diverse applicazioni.

Packaging proteine ​​diretto all&#39;interno della membrana esterna vescicole da<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Progettazione, produzione e purificazione

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

L'obiettivo generale di questa procedura è purificare e caratterizzare vescicole della membrana esterna batteriche contenenti enzimi, da utilizzare come reagenti catalitici in vitro. Questa tecnica di isolamento enzimatico consente di raccogliere le OMV batteriche dal mezzo di coltura e successivamente di impiegarle per condurre una catalisi priva di cellule di un composto organofosfato. L'incapsulamento mirato all'interno delle OMV batteriche migliora significativamente la stabilità enzimatica in una serie di condizioni di reazione e di conservazione, a differenza delle tecniche tradizionali che spesso determinano una perdita graduale e continua dell'attività enzimatica.Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'incapsulamento di proteine con rilevanza in diversi settori, come lo sviluppo di terapie, il risanamento ambientale o la creazione di sistemi catalitici privi di cellule. Sebbene questo protocollo descriva la purificazione di OMV da E.coli, le tecniche, con modifiche alla strategia di incapsulamento, potrebbero essere facilmente utilizzate per la purificazione di OMV da diverse colture cellulari microbiche. Dopo aver generato vescicole della membrana esterna, o OMV, nei batteri seguendo il protocollo descritto, centrifugare il mezzo di coltura batterica integro a 7.000 × g e a quattro gradi Celsius per 15 minuti.Rimuovere e conservare il soprannatante, avendo cura di non disturbare il pellet cellulare. Successivamente, sottoporre il soprannatante a una seconda centrifugazione per assicurare la rimozione di tutti i batteri dal mezzo. Per eliminare gli aggregati proteici e i materiali cellulari di grandi dimensioni dal mezzo di coltura conservato, aspirare la soluzione in una siringa sterile da 10 a 50 millilitri.Collegare un filtro da 0,45 micron all'estremità del luer della siringa. Quindi premere lo stantuffo e raccogliere il flusso in uscita in un nuovo tubo. In alternativa, filtrare il mezzo di coltura a vuoto trasferendolo in un apparecchio di filtrazione sterile.Collegare l'unità a una pompa a vuoto o a un aspiratore per lavandino per generare aspirazione. Trasferire il mezzo filtrato in un nuovo contenitore. Per isolare le OMV, trasferire il mezzo di coltura filtrato in provette per ultracentrifugazione.Centrifugare il mezzo a circa 150.000 ×g e a quattro gradi Celsius per tre ore, utilizzando un rotore adatto alle provette impiegate. Immediatamente dopo l'ultracentrifugazione, per evitare la perdita di massa del pellet, decantare il mezzo di coltura privo di OMV dal pellet di OMV di colore leggermente bruno, che potrebbe non essere visibile ad occhio nudo. Il pellet di OMV formato dopo l'ultracentrifugazione potrebbe aderire solo debolmente alla parete della provetta di centrifugazione.È necessario prestare attenzione durante la decantazione per assicurarsi che il pellet non venga smosso e perso. Conservare il soprannatante per un successivo scattering dinamico della luce, al fine di verificare che le particelle OMV siano state completamente eliminate dal mezzo. Aggiungere dallo 0,5 a un millilitro di PBS sterile filtrato, pH 7,4, o un altro tampone filtrato in base alle esigenze o alle condizioni sperimentali, al pellet e lasciare incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Quindi, pipettare con attenzione la soluzione di OMV purificata, mescolando delicatamente per assicurarsi che l'intero pellet sia stato solubilizzato. Per determinare la distribuzione dimensionale delle OMV, aprire il software di tracciamento di nano-particelle DLS relativo allo strumento in uso. Accendere il microscopio e pulire tutte le superfici del microscopio e dell'unità di tracciamento di nano-particelle.Utilizzando una siringa sterile da un millilitro, aggiungere circa 0,5 millilitri di campione di OMV direttamente nella finestra di osservazione del dispositivo di tracciamento delle particelle attraverso il raccordo inferiore, avendo cura di coprire completamente la finestra di osservazione senza introdurre bolle d'aria nel sistema. Posizionare l'unità di tracciamento delle nano-particelle sul palchetto del microscopio e accendere il laser. Quindi fare clic su Acquisisci nel software.Regolare la messa a fuoco del microscopio e la posizione del palchetto per visualizzare le particelle sullo schermo di anteprima presente nella finestra del software. Regolare l'otturatore della telecamera e il guadagno della telecamera finché le particelle luminose non risultano chiaramente visibili su uno sfondo scuro. Impostare la durata dell'acquisizione a 60 secondi, quindi fare clic su Registra.Quando richiesto, inserire la temperatura del dispositivo del campione, etichettare il campione e salvare i dati video al termine di ogni esecuzione in una cartella designata dall'utente. Mantenere tutti i parametri di analisi in modalità rilevamento automatico e fare clic su Elabora Sequenza. Registrare la distribuzione dimensionale delle particelle e la concentrazione in particelle per millilitro come determinato dal software.Per determinare il contenuto proteico delle OMV, utilizzare SDS-PAGE e Western blot per valutare la purezza delle OMV, la produzione enzimatica e l'efficienza di cross-linking tra SpyCatcher o SC e SpyTag o ST. È fondamentale confermare l'espressione degli enzimi bersaglio e della proteina ancorante. L'espressione di proteine ricombinanti spesso può non riuscire per diversi motivi, pertanto è necessario confermare la produzione proteica con successo prima della caratterizzazione delle OMV.Per eseguire un saggio di attività fosfotriesterasi o PTE, aggiungere cinque microlitri di una diluizione 1:1.000 di paraoxone in tampone CHES a cinque microlitri di OMV purificate in 90 microlitri di CHES. Registrare le letture di assorbanza a 405 nanometri e 348 nanometri ogni 20 secondi per circa due ore di tempo totale di reazione, al fine di monitorare l'avanzamento del prodotto cromogeno della degradazione del paraoxone, il p-nitrofenolo. Infine, effettuare l'analisi dei dati secondo il protocollo descritto nel testo.Qui vengono mostrati esempi della morfologia di OMV purificate di E.coli ottenute mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Le OMV presentano dimensioni comprese tra 50 e 250 nanometri, come determinato mediante strumentazione per il tracciamento delle particelle. In questo grafico è riportata la concentrazione assoluta di OMV.Quando l'OMP-A-ST N-terminale è stato co-trasformato con PTE-SC in presenza di arabinosio e IPTG, si è osservato un significativo aumento della produzione di OMV rispetto ai campioni di controllo. L'elettroforesi su SDS-PAGE e i blotting Western mostrati qui caratterizzano ulteriormente il contenuto proteico delle OMV e l'espressione delle proteine ricombinanti per OMP-A-ST, OMP-A nativo, PTE-SC e OMP-A-ST-PTE-SC. In questo grafico, i livelli complessivi di espressione della PTE e l'efficienza di incapsulamento nelle OMV nei pellet cellulari, nel sopranatante UC e nei pellet purificati di OMV UC sono stati determinati mediante misurazioni della velocità iniziale utilizzando il paraoxon come substrato cromogeno.Qui, il Triton X-100 &egrave; stato utilizzato per verificare la traslocazione del paraoxone attraverso i bilayer integri delle OMV. Non &egrave; stata osservata una grande differenza di attivit&agrave; in presenza o in assenza del detergente, indicando che il paraoxone attraversa liberamente i pori endogeni presenti nella OMV. Infine, come osservato in questo esperimento, i dati cinetici di PTE-SC sono stati adattati a un'equazione cinetica enzimatica standard di Michaelis-Menten per la co-trasformazione dell'OMP-A-ST N-terminale con PTE-SC in presenza di arabinosio e IPTG e per PTE-SC in presenza di attivazione con arabinosio.Dopo aver realizzato e confermato tutti i costrutti genetici, l'incapsulamento enzimatico e la purificazione delle OMV possono essere completati nell'arco di due giorni. È necessario un terzo giorno per confermare e caratterizzare le OMV ogni volta che viene sviluppato un nuovo costrutto. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di verificare le classi di sicurezza di tutti i materiali e dell'equipaggiamento per la centrifugazione.Inoltre, è importante verificare l'esito positivo di ogni passaggio prima di procedere al successivo. I passaggi di caratterizzazione descritti qui possono essere integrati con altri per confermare il confezionamento dell'enzima e la morfologia delle OMV. La concentrazione proteica, il contenuto lipidico, la concentrazione di LPS e molte altre proprietà possono variare a seconda dei diversi carichi e delle condizioni di adduzione, e potrebbero influenzare le applicazioni successive.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare e caratterizzare le OMV contenenti enzimi, nonché di come eseguire saggi preliminari per valutare l'attività del carico enzimatico. Non dimenticare che lavorare con batteri e reagenti chimici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura si devono sempre adottare precauzioni come un'adeguata tecnica asettica e l'uso di dispositivi di protezione individuale.

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