Packaging proteine ​​diretto all'interno della membrana esterna vescicole da

L'obiettivo generale di questa procedura è purificare e caratterizzare vescicole della membrana esterna batteriche contenenti enzimi, da utilizzare come reagenti catalitici in vitro. Questa tecnica di isolamento enzimatico consente di raccogliere le OMV batteriche dal mezzo di coltura e successivamente di impiegarle per condurre una catalisi priva di cellule di un composto organofosfato. L'incapsulamento mirato all'interno delle OMV batteriche migliora significativamente la stabilità enzimatica in una serie di condizioni di reazione e di conservazione, a differenza delle tecniche tradizionali che spesso determinano una perdita graduale e continua dell'attività enzimatica.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'incapsulamento di proteine con rilevanza in diversi settori, come lo sviluppo di terapie, il risanamento ambientale o la creazione di sistemi catalitici privi di cellule. Sebbene questo protocollo descriva la purificazione di OMV da E.coli, le tecniche, con modifiche alla strategia di incapsulamento, potrebbero essere facilmente utilizzate per la purificazione di OMV da diverse colture cellulari microbiche. Dopo aver generato vescicole della membrana esterna, o OMV, nei batteri seguendo il protocollo descritto, centrifugare il mezzo di coltura batterica integro a 7.000 × g e a quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Rimuovere e conservare il soprannatante, avendo cura di non disturbare il pellet cellulare. Successivamente, sottoporre il soprannatante a una seconda centrifugazione per assicurare la rimozione di tutti i batteri dal mezzo. Per eliminare gli aggregati proteici e i materiali cellulari di grandi dimensioni dal mezzo di coltura conservato, aspirare la soluzione in una siringa sterile da 10 a 50 millilitri.

Collegare un filtro da 0,45 micron all'estremità del luer della siringa. Quindi premere lo stantuffo e raccogliere il flusso in uscita in un nuovo tubo. In alternativa, filtrare il mezzo di coltura a vuoto trasferendolo in un apparecchio di filtrazione sterile.

Collegare l'unità a una pompa a vuoto o a un aspiratore per lavandino per generare aspirazione. Trasferire il mezzo filtrato in un nuovo contenitore. Per isolare le OMV, trasferire il mezzo di coltura filtrato in provette per ultracentrifugazione.

Centrifugare il mezzo a circa 150.000 ×g e a quattro gradi Celsius per tre ore, utilizzando un rotore adatto alle provette impiegate. Immediatamente dopo l'ultracentrifugazione, per evitare la perdita di massa del pellet, decantare il mezzo di coltura privo di OMV dal pellet di OMV di colore leggermente bruno, che potrebbe non essere visibile ad occhio nudo. Il pellet di OMV formato dopo l'ultracentrifugazione potrebbe aderire solo debolmente alla parete della provetta di centrifugazione.

È necessario prestare attenzione durante la decantazione per assicurarsi che il pellet non venga smosso e perso. Conservare il soprannatante per un successivo scattering dinamico della luce, al fine di verificare che le particelle OMV siano state completamente eliminate dal mezzo. Aggiungere dallo 0,5 a un millilitro di PBS sterile filtrato, pH 7,4, o un altro tampone filtrato in base alle esigenze o alle condizioni sperimentali, al pellet e lasciare incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quindi, pipettare con attenzione la soluzione di OMV purificata, mescolando delicatamente per assicurarsi che l'intero pellet sia stato solubilizzato. Per determinare la distribuzione dimensionale delle OMV, aprire il software di tracciamento di nano-particelle DLS relativo allo strumento in uso. Accendere il microscopio e pulire tutte le superfici del microscopio e dell'unità di tracciamento di nano-particelle.

Utilizzando una siringa sterile da un millilitro, aggiungere circa 0,5 millilitri di campione di OMV direttamente nella finestra di osservazione del dispositivo di tracciamento delle particelle attraverso il raccordo inferiore, avendo cura di coprire completamente la finestra di osservazione senza introdurre bolle d'aria nel sistema. Posizionare l'unità di tracciamento delle nano-particelle sul palchetto del microscopio e accendere il laser. Quindi fare clic su Acquisisci nel software.

Regolare la messa a fuoco del microscopio e la posizione del palchetto per visualizzare le particelle sullo schermo di anteprima presente nella finestra del software. Regolare l'otturatore della telecamera e il guadagno della telecamera finché le particelle luminose non risultano chiaramente visibili su uno sfondo scuro. Impostare la durata dell'acquisizione a 60 secondi, quindi fare clic su Registra.

Quando richiesto, inserire la temperatura del dispositivo del campione, etichettare il campione e salvare i dati video al termine di ogni esecuzione in una cartella designata dall'utente. Mantenere tutti i parametri di analisi in modalità rilevamento automatico e fare clic su Elabora Sequenza. Registrare la distribuzione dimensionale delle particelle e la concentrazione in particelle per millilitro come determinato dal software.

Per determinare il contenuto proteico delle OMV, utilizzare SDS-PAGE e Western blot per valutare la purezza delle OMV, la produzione enzimatica e l'efficienza di cross-linking tra SpyCatcher o SC e SpyTag o ST. È fondamentale confermare l'espressione degli enzimi bersaglio e della proteina ancorante. L'espressione di proteine ricombinanti spesso può non riuscire per diversi motivi, pertanto è necessario confermare la produzione proteica con successo prima della caratterizzazione delle OMV.

Per eseguire un saggio di attività fosfotriesterasi o PTE, aggiungere cinque microlitri di una diluizione 1:1.000 di paraoxone in tampone CHES a cinque microlitri di OMV purificate in 90 microlitri di CHES. Registrare le letture di assorbanza a 405 nanometri e 348 nanometri ogni 20 secondi per circa due ore di tempo totale di reazione, al fine di monitorare l'avanzamento del prodotto cromogeno della degradazione del paraoxone, il p-nitrofenolo. Infine, effettuare l'analisi dei dati secondo il protocollo descritto nel testo.

Qui vengono mostrati esempi della morfologia di OMV purificate di E.coli ottenute mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Le OMV presentano dimensioni comprese tra 50 e 250 nanometri, come determinato mediante strumentazione per il tracciamento delle particelle. In questo grafico è riportata la concentrazione assoluta di OMV.

Quando l'OMP-A-ST N-terminale è stato co-trasformato con PTE-SC in presenza di arabinosio e IPTG, si è osservato un significativo aumento della produzione di OMV rispetto ai campioni di controllo. L'elettroforesi su SDS-PAGE e i blotting Western mostrati qui caratterizzano ulteriormente il contenuto proteico delle OMV e l'espressione delle proteine ricombinanti per OMP-A-ST, OMP-A nativo, PTE-SC e OMP-A-ST-PTE-SC. In questo grafico, i livelli complessivi di espressione della PTE e l'efficienza di incapsulamento nelle OMV nei pellet cellulari, nel sopranatante UC e nei pellet purificati di OMV UC sono stati determinati mediante misurazioni della velocità iniziale utilizzando il paraoxon come substrato cromogeno.

Qui, il Triton X-100 è stato utilizzato per verificare la traslocazione del paraoxone attraverso i bilayer integri delle OMV. Non è stata osservata una grande differenza di attività in presenza o in assenza del detergente, indicando che il paraoxone attraversa liberamente i pori endogeni presenti nella OMV. Infine, come osservato in questo esperimento, i dati cinetici di PTE-SC sono stati adattati a un'equazione cinetica enzimatica standard di Michaelis-Menten per la co-trasformazione dell'OMP-A-ST N-terminale con PTE-SC in presenza di arabinosio e IPTG e per PTE-SC in presenza di attivazione con arabinosio.

Dopo aver realizzato e confermato tutti i costrutti genetici, l'incapsulamento enzimatico e la purificazione delle OMV possono essere completati nell'arco di due giorni. È necessario un terzo giorno per confermare e caratterizzare le OMV ogni volta che viene sviluppato un nuovo costrutto. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di verificare le classi di sicurezza di tutti i materiali e dell'equipaggiamento per la centrifugazione.

Inoltre, è importante verificare l'esito positivo di ogni passaggio prima di procedere al successivo. I passaggi di caratterizzazione descritti qui possono essere integrati con altri per confermare il confezionamento dell'enzima e la morfologia delle OMV. La concentrazione proteica, il contenuto lipidico, la concentrazione di LPS e molte altre proprietà possono variare a seconda dei diversi carichi e delle condizioni di adduzione, e potrebbero influenzare le applicazioni successive.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare e caratterizzare le OMV contenenti enzimi, nonché di come eseguire saggi preliminari per valutare l'attività del carico enzimatico. Non dimenticare che lavorare con batteri e reagenti chimici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura si devono sempre adottare precauzioni come un'adeguata tecnica asettica e l'uso di dispositivi di protezione individuale.