Name: Una polmonite Modello robusto in immunocompetenti roditori per valutare antibatterico efficacia contro S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa o A. baumannii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Scopri un metodo di infezione intrabronchiale non chirurgica per stabilire polmonite batterica robusta in roditori immunocompetenti. Questa tecnica consente di valutare l'efficacia di trattamenti antibatterici in un modello rilevante di polmonite grave.

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JH desidera riconoscere e ringraziare mentore, amico ed ex direttore di Valerie Berry per primo ci ha insegnato questo modello; e Gary Woodnutt, che ci ha insegnato le basi della e ispirato il nostro impegno nel campo della antibatterico PK / PD. Tutti gli autori desiderano ringraziare David Payne per il suo sostegno e apprezzamento per la nostra scienza. Vorremmo riconoscere la nostra prima in vivo colleghi di microbiologia che hanno contribuito al corpo di dati generati utilizzando questi metodi, soprattutto Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni Page e Nerissa Simon. Infine, il nostro ringraziamento va ai nostri colleghi in vitro microbiologia per la loro assistenza, in particolare per la fornitura di tutte le MIC noi richiesta (Lynn McCloskey, Josh occidentale e Sharon min); e per il nostro team di microbiologia clinica che offre consulenza e supporto (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman e Deborah Butler).

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<li>Miles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tricyclics+%28e.g.+GSK945237%29+as+potent+inhibitors+of+bacterial+type+IIA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases.</a> Bioorg Med Chem Lett. 26 (10), 2464-2469 (2016).</li>
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</ol>

Gli autori sono tutti dipendenti della GlaxoSmithKline Pharmaceuticals e azioni proprie di azioni versate all&#39;interno della società.

Per il successo ottimale nel riprodurre questo modello di infezione, i seguenti suggerimenti supplementari dovrebbero essere prese in considerazione. Virulenza dei nuovi isolati può essere migliorata passaging 2 - 3 volte in vivo prima utilizzazione in uno studio. Ceppi batterici congelati devono sempre essere preparati da un primario in vivo fonte -derived con il minor numero di passaggi possibile rispetto all&#39;originale, e ricongelamento o riutilizzo del magazzino scongelati è scoraggiato. Utilizzando isolati clinici recenti recuperati da pazienti affetti da polmonite, e / o la preparazione di culture in crescita fase di registro può anche contribuire a migliorare istituzione dell&#39;infezione. Una diluizione di cinque volte in agar (ad esempio 2 ml di sospensione salina aggiunto 8 mL agar) può essere usato al posto di dieci volte per aumentare l&#39;inoculo batterico, e il volume inoculo può essere regolata in base alle dimensioni dell&#39;animale (es 200 ml / animale di solito è inoculati in 250 g ratti). Prima dell&#39;aggiunta della sospensione batterica salina nelagar (cioè al punto 2.3), la densità batterica può essere prevista o stimata mediante ispezione visiva, gli standard MacFarland o misure di densità ottica. E &#39;utile per acquisire familiarità con le caratteristiche di crescita in vitro per ogni isolato prima di condurre esperimenti in vivo. Consistenza della crescita e movimentazione consente la stima più accurata della densità batterica per un dato isolato. metodi microbiologici standard diversi da quelli descritti, ad esempio media e omogeneizzatori tessuto alternativa, possono essere utilizzati come appropriato per la preparazione di inoculi e la conta dei batteri da tessuti infetti. Si consiglia vivamente di preparare o sciogliere l&#39;agar il giorno prima dell&#39;esperimento e riporlo durante la notte in un bagno d&#39;acqua separata impostato a 50 ° C. Ciò semplifica il processo e contribuire guardia contro l&#39;agar essere troppo caldo al momento dell&#39;infezione. Una temperatura di 41-42 ° C raggiunge un buon equilibrio tra manutenzione suning l&#39;agar allo stato liquido, senza essere troppo caldo per la sopravvivenza dei batteri a breve termine. Come possibile alternativa agar nutritivo, nobile agar è stato usato con successo in alcuni esperimenti. Un tubo di agar inoculo è solitamente sufficiente per un intero esperimento (ed è raccomandato), ma più provette può essere preparato per infettare un gran numero di animali (ad esempio più di 60), o quando il processo infettare richiede più di 30 - 45 min Se più tubi inoculo sono necessari, aggiungere la sospensione batterica salina per ciascun tubo di agar in quanto è necessario. Questo riduce il rischio che la sopravvivenza e / o idoneità batterica saranno influenzati dalla prolungata esposizione ad una temperatura elevata prima dell&#39;inoculo. Va notato che utilizzano tubi inoculo multipli possono anche richiedere ulteriori procedure animale randomizzazione. Per quanto possibile, di infettare tutti gli animali della stessa preparazione inoculo. Si consiglia di adattare la dimensione di esperimenti per l&#39;attuale livello di competenza con la TEchnique. Uno scienziato esperto può intubazione e inoculare un animale in meno di 30 s e inoculare fino a 5 - 6 animali per partita (ossia con una siringa piena di inoculo agar). Per coloro apprendimento della tecnica, la velocità è importante come agar inizierà a solidificare; Tuttavia, il posizionamento accurato del inoculo è più importante. Iniziare con 1 o 2 animali per partita, e aumentare la tecnica diventa più familiare. Gli animali continuano a respirare durante l&#39;intubazione; pertanto, la finestra temporale per l&#39;inoculazione dipende da quanto velocemente l&#39;animale recupera da isoflurano, che dovrebbe essere di circa 2 - 3 min. Gli animali che risvegliano durante il processo possono essere ri-anestetizzati e hanno tentato una seconda volta, ma non è raccomandato di farlo più volte. inoculazione di successo al primo tentativo è previsto in quasi il 100% degli animali una volta che si ottiene competenza. Si noti che è più facile imparare la tecnica utilizzando ratti prima; topi sono più delicate e minore troppoLS sono più inclini a blocco con agar solidificato se non manipolato in fretta. siringhe pre-riscaldamento, tubi e saline così come mantenere il dispositivo di intubazione su una superficie calda (non bollente), come ad esempio una piastra elettrica sulla regolazione bassa, possono aiutare a prevenire la solidificazione del agar. Quando imparare la tecnica, è anche utile per praticare il corretto posizionamento del inoculo utilizzando un colorante di colore scuro (come il blu di metilene concentrato) invece della sospensione batterica in agar. Eseguire la procedura descritta, ma l&#39;eutanasia dell&#39;animale subito dopo l&#39;inoculazione del colorante (non permettendo all&#39;animale di recuperare tra anestesia e l&#39;eutanasia). Sezionare per determinare dove il colorante è stato immesso, e regolare tecnica conseguenza. L&#39;endpoint primario in questo modello è CFU dai polmoni infetti. La sopravvivenza non è un buon indicatore di carica batterica e non è un endpoint consigliato. Per gli studi di efficacia, la suggerita N è di 5 - 6 animali per gruppo come questo è predicted per rilevare ≥1 log10 differenze CFU tra i gruppi con almeno il 90% di potenza. Gli animali possono essere infettati in gruppi in modo tale che compagni di gabbia rimangano insieme, o di un vero e proprio processo di randomizzazione possono essere seguiti. Si noti che se i gruppi sono assegnati da gabbia, i gruppi dovrebbero essere infettati in sequenza casuale con i controlli di crescita di fine studio infetti ultima (per confermare che la sopravvivenza batterica / fitness non è stata influenzata dalla lunghezza del tempo esposto ad una temperatura elevata nel bagnomaria). Metodi dati censurare dovrebbe essere necessario, e nessuno è consigliato con l&#39;eccezione di rimozione immediata di qualsiasi animale che è stata ovviamente mis-inoculati all&#39;inizio dello studio (prima dell&#39;inizio di eventuali trattamenti). Gli animali che sono eutanasia prima della fine dello studio dovrebbero essere campionati e risultati incluse nei set di dati a meno che un motivo valido per l&#39;esclusione è stata identificata in modo prospettico (vale a dire un evento estraneo alla infezione o trattamento). riporto farmaco può affect alcuni campioni ed è una considerazione importante in tutti i modelli di infezione in vivo. Se un composto viene determinata frequenza, vicino al tempo dell&#39;eutanasia o ha una lunga emivita, può essere presente nel tessuto omogenato ad una concentrazione sufficientemente elevata per continuare a uccidere i batteri ex vivo durante il processo di enumerazione batterica (diluizione e la placcatura di i campioni o sulle piastre di agar durante l&#39;incubazione durante la notte). Per evitare questo, carbone attivo e / o un additivo che degrada la molecola attiva senza danneggiare le cellule batteriche possono essere aggiunti al campione prima della omogeneizzazione. Altri metodi includono centrifugazione dei campioni per rimuovere la maggior parte del composto attivo (che dovrebbe rimanere nel supernatante) e impiegando diversa diluizione e placcatura regimi diluire sufficientemente composto attivo ad una concentrazione non-inibitrice. Come evidenziato dagli esempi illustrati nella Figura 2, questo modello con successo induces infezioni polmonari nei roditori con una vasta gamma di organismi, compresi quelli che non crescono bene in altri modelli (ad esempio H. influenzae). Queste infezioni sono coerenti e riproducibili, riducendo la probabilità che dovranno essere ripetuti a causa di insufficienza modello e / o scarso rendimento con un dato isolato esperimenti. Anche se gli animali sono immunocompetenti, non sono in grado di risolvere rapidamente l&#39;infezione, se non del tutto. Questo consente una maggiore flessibilità nella durata dello studio, come molti isolati mantengono una infezione fattibile attraverso almeno 96 h senza la necessità di iniezioni ripetute di mantenere neutropenia. Il potenziale vantaggio di studiare l&#39;efficacia antibatterica negli animali immunocompetenti è stato notato in precedenza 20, 21, e ci sono prove che, per alcuni composti (ad esempio ossazolidinoni), i dati di roditori non neutropenici possono più prevedere con precisione obiettivi di esposizione umani rispetto a quelli neutropenia reso 5. L&#39;utilità polivalente tegli modello è dimostrata nelle figure 3 e 4 e tabelle 1 e 2. Questi studi sono parte di una grande raccolta di dati pubblicati e non pubblicati che è stato generato con questo modello di sostenere gli sforzi di ottimizzazione di piombo 16, 17, 22-24, per il confronto e la conferma del dosaggio umano proposto regimi 19, 25-29 e PK / PD caratterizzazione 18, 30-32 .While questo modello è inizialmente più complesso per condurre rispetto al metodo intranasale inalazione, ci sono molti vantaggi come descritto sopra. Con la pratica e l&#39;uso di routine, le tecniche dovrebbero diventare semplice da eseguire. Si può osservare in alcuni studi che la carica batterica al basale era inferiore a quello tipicamente mirata in altri modelli di infezione polmonare. Ciò è dovuto in gran parte alla diluizione richiesta in agar e il volume sfida piccola, particolarmente nei topi. Tuttavia, dovrebbe anche essere notatoche la crescita batterica è stata osservata in tutti i casi, anche quando il peso iniziale era relativamente basso. La carica batterica di riferimento obiettivo è 6-6,5 log10 CFU / polmoni (6.8 a 7.3 log 10 CFU / g di tessuto nei topi a base di peso medio del polmone), che corrisponde a densità stimate in pazienti umani con grave polmonite 33. Un fardello basale superiore può essere ottenuto concentrare ulteriormente l&#39;inoculo batterico o ritardando l&#39;inizio della somministrazione composti per consentire la crescita batterica supplementare; tuttavia, aumentando il carico sfida troppo può portare a malattie anormalmente grave ed acuta (cioè la morte in meno di 24 ore), che è refrattario a tutti i trattamenti antibatterici a prescindere di suscettibilità. Anche se l&#39;inoculo è inizialmente posizionato preferibilmente nel polmone sinistro dell&#39;animale, l&#39;infezione si diffonde generalmente in entrambi i polmoni. malattia progressiva dei polmoni, la diffusione dei batteri ad altri organi, e l&#39;eventuale morbidità è spesso observEd con S. pneumoniae, K. pneumoniae e P. aeruginosa. Di interesse, infezioni da H. influenzae e A. baumannii di solito sono più contenuti e raramente portano alla morte nel inoculi batterica prescritto. I risultati di efficacia ottenuti da questo modello hanno correlato bene con i profili di sensibilità in vitro così come bersagli PK / PD definiti. Riduzioni di carica batterica sono regolarmente osservati per isolati ritenuti suscettibili all&#39;agente in prova, mentre quelli mostre resistente considerati nessun cambiamento o crescita batterica sopra il basale 16, 17, 19, 24-29. Studi condotti su ratti valutano due chinoloni e un macrolide utilizzando questo modello 32 hanno dimostrato che la porta PK / PD necessarie per un 1-log 10 riduzione S. pneumoniae rispetto al basale correlata con l&#39;obiettivo determinato topi neutropenici e, soprattutto, con obiettivi clinici per pneum batterica acquisita in comunitàonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, un nuovo meccanismo di antibiotici, è stato testato contro multipla S. pneumoniae e ha richiesto un simile obiettivo PK / PD per un 1-log 10 riduzione di questo polmone modello di infezione 31 come quello richiesto per un 1-log 10 riduzione, nel modello coscia neutropenico 36 in cui la penetrazione del polmone è stato preso in considerazione (i dati su file). Allo stesso modo, i PK / PD obiettivi stabiliti nei topi per GSK2251052 contro P. aeruginosa sono stati coerenti per la stasi, 1 e 2 log10 riduzioni CFU tra questo modello polmone 30 e il modello di infezione coscia neutropenia in cui la penetrazione del polmone era considerato 37, 38 . Correlazione con un modello di infezione polmonare neutropenia con l&#39;inoculazione intranasale era povera; tuttavia, GSK2251052 non produceva più di una risposta statica in questo studio 38. Questo può essere attribuibile alla inoculo batterico superiore, che era 8 log 10 CFU / topo rispetto ai 6 log <sub&gt; 10 CFU / mouse nella neutropenico coscia 37 e intratracheale intubazione 30 modelli. Raccolta di dati di questo tipo è fondamentale per il benchmarking, in quanto consente un confronto diretto con i modelli esistenti e correlazione con i dati clinici per valutare la capacità predittiva traslazionale. Un uso più diffuso del modello di intubazione endotracheale infezione polmonare fornirà dati aggiuntivi per questi tipi di analisi. Esistono diverse limitazioni di questo modello polmonite immunocompetenti. In primo luogo, non è ben adatto a valutare comparsa di resistenza spontanea perché l&#39;alto inoculo batterico generalmente richiesto per tali studi si traduce in troppo grave un&#39;infezione. Dopo i tentativi di raggiungere oneri batteriche di 7 o 8 log 10 CFU al basale, la rapida morbilità è stato osservato (cioè gli animali che diventano moribondo in meno di 24 ore), nonostante il lavaggio accurato della inoculi per eliminare le tossine pre-esistente (dati su file). essopuò essere possibile superare questo problema utilizzando i roditori più grandi. Ratti, ratti particolarmente pesanti (&gt; 250 g), sembrano tollerare meglio superiore inoculi rispetto a topi e possono essere adatti per questi tipi di studi. Una seconda limitazione è che l&#39;uso di agar come un&#39;infezione-enhancer può precludere utilizzando il modello per la valutazione di alcuni host: patogeno. Si ritiene che l&#39;agar fornisce un punto focale protetta fino infezione è completamente stabilito all&#39;interno del polmone. E &#39;possibile consegnare l&#39;inoculo in soluzione salina invece di agar per aiutare a superare questo problema; Tuttavia, va notato che questo produrrà soltanto l&#39;infezione con alcuni isolati. In terzo luogo, vi è una curva di apprendimento ripida necessaria per diventare esperti nella tecnica. La procedura può essere delicato, soprattutto nei topi. È facile posizionare erroneamente la cannula metallica nell&#39;esofago, e forza eccessiva può portare alla puntura sia dell&#39;esofago o della trachea. posizionamento attento del inoculo è anchetenuti o animali possono o non recuperare o non essere adeguatamente infetti. Tuttavia, con pazienza e perseveranza, si può diventare altamente competente ed eseguire la tecnica in modo rapido, agevole e preciso. Rimuovendo il requisito per la neutropenia, aumentare la robustezza e la riproducibilità, permettendo ai ricercatori di studiare di più agenti patogeni e isolati, migliorare la flessibilità del disegno sperimentale e di fornire una infezione difficile da caratterizzare farmacodinamica per la polmonite, questo modello infezione polmonare immunocompetenti aggiunge valore sostanziale alla scoperta di antibiotici comunità. Un maggiore uso di questo modello dagli investigatori ulteriori contribuirà a fornire l&#39;analisi comparativa necessario per la sua guadagnare più diffusa accettazione e continuare a fornire informazioni di supporto per l&#39;interpretazione appropriata.

Valutare l&#39;efficacia di potenziali farmaci candidati in modelli animali di infezione è una componente fondamentale del processo di scoperta di nuovi farmaci antibatterici. In vivo studi di efficacia forniscono dati importanti per il processo decisionale in tutto l&#39;arco di attività di scoperta, da chiarire le relazioni struttura-attività (SAR) e l&#39;ottimizzazione serie chimica piombo attraverso la determinazione di farmacocinetica-farmacodinamica (PK / PD) caratteristiche di composti e sostenere la selezione della dose per sviluppo clinico e l&#39;approvazione regolamentare. Numerosi modelli di infezione animale sono descritti in letteratura per questi scopi. Uno dei modelli più comuni e diffusi è il neutropenico infezione del mouse coscia, che è stato lanciato da Aquila 1, 2 e successivamente ampliato da Vogelman e Craig 3, 4. Questo modello è stato prezioso per supportare la determinazione dei punti di interruzione di sensibilità batterica e per fornire obiettivi PK / PD per il dosaggio umana. Ci sono molti esamiples dove la capacità predittiva di questo modello è stato dimostrato 4-7. Tuttavia, uno degli svantaggi del modello di infezione coscia è la mancanza di rilevanza diretta per le infezioni polmonari. Vi è ora una maggiore enfasi sulla corrispondenza del sito di infezione in modelli animali al sito di infezione negli esseri umani; e quindi, per studiare composti per il trattamento di polmonite, è ideale per utilizzare un modello di infezione polmonare in animali. Diversi metodi per indurre infezioni polmonari in animali da laboratorio sono stati descritti ed utilizzati per studi di efficacia antibatteriche compresa intranasale inalazione, l&#39;aspirazione per via orofaringea, l&#39;esposizione dell&#39;aerosol e chirurgica inoculazione intratracheale 8. In molti casi, gli animali (in particolare topi) devono prima essere resi neutropenia per ottenere una infezione polmonare robusta. Nonostante questo stato gravemente immunocompromessi, il numero di batteri patogeni e ceppi che producono infezioni vitali nei roditori èlimitato. Ad esempio, può essere difficile stabilire con successo Haemophilus influenzae o Acinetobacter baumannii in modelli polmonite 9, 10, e anche più virulenti patogeni, come ad esempio lo Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae, può rappresentare sfide 11-13. Nel 1991, Smith ha descritto un modello di infezione polmonare nei ratti appena svezzati immunocompetenti in cui l&#39;infezione è stata fondata da instillare batteri direttamente nei polmoni tramite un semplice metodo di intubazione endotracheale non chirurgico 14. Berry et al. successivamente modificato il metodo per infettare i topi 15. Usando un inoculo di agar-based, questa tecnica di inoculazione induce infezioni polmonari robusti in ratti e topi immunocompetenti con S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii. Si è suscettibile di una vasta gamma di isolati, comprese quelle ospitare diversi resistdeterminanti ANCE e quelli che non producono una infezione praticabile attraverso altre vie di inoculazione. Consente inoltre l&#39;efficacia da determinarsi animali immunocompetenti, una condizione che è più rilevante rispetto al modello tradizionale del mouse neutropenico per popolazioni di pazienti che non sono gravemente immunocompromessi. La consistenza e l&#39;affidabilità di questo modello su più agenti patogeni e isolati rende particolarmente adatto per studi di efficacia antibatterica.

<table><tbody><tr><td>TSA II Trypticase Soy Agar con il 5% di sangue di pecora</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>4321261</td><td></td></tr><tr><td>Chocolate II Agar Becton</td><td>Dickinson and Company</td><td>4321267</td><td></td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Brodo Modificato</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>299070</td><td></td></tr><tr><td>BBL Trypticase Brodo di soia con il 20% di glicerolo</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>297808</td><td>supporti di memorizzazione per Anello</td></tr><tr><td>di inoculazione</td><td>Nunc</td><td>251586</td><td></td></tr><tr><td>0,9% di cloruro di sodio, USP</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>NDC 0338-0048-04</td><td></td></tr><tr><td>Difco Nutrient Agar</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>213000</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga autoportante da 30 ml con tappo</td><td>EverGreen Scientific</td><td>222-3530-G80</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica in polipropilene da 50 ml 30 x 115 mm</td><td>Falcon, un Corning Brand</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubo a fondo tondo in polipropilene da 14 ml 17 x 100 mm</td><td>Falcon, uno</td> strumento di guida <td>352059</td><td></td>Corning Brand</tr><tr><td></td><td>Intek Services Ltd</td><td>GT01</td><td>cannula in metallo su misura per ratti</td></tr><tr><td>90' Tubo Portex</td><td>SAI</td><td>POR-080-100</td><td>Cannula in plastica per ratti</td></tr> 1 <tr><td>mL TB siringa slip tip</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Ago PrecisionGlide 25 G x 5/8</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Ago per alimentazione animale - dritto 20 x 3" 2-1/4</td><td>Popper and Sons, Inc</td><td>7903</td><td>utilizzato per creare cannule metalliche per topi</td></tr><tr><td>Tubo in polietilene Intramedic</td><td>Clay Adams marca - Becton Dickinson and Company</td><td>427401</td><td>cannula in plastica per topo&nbsp;</td></tr><tr><td>75 TN 5.0 &micro; Siringa L 26s/2"/2</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>Siringa per iniezione in vetro HPLC</td></tr><tr><td>Tubo in Pyrex, coltura 25x150 tappo a vite con rivestimento in gomma</td><td>Corning</td><td>9825-25</td><td>per autoclave/conservare cannule metalliche</td></tr><tr><td>alcol isopropilico al 70%</td><td>Vi-Jon (Swan)</td><td>NDC 0869-0810-43</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-013-10</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher&nbsp;</td><td>Seward</td><td>Stomacher80</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 sacche classiche</td><td>Seward</td><td>BA6040</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per saggi, 96 pozzetti, fondo tondo</td><td>Costar, Corning Inc</td><td>3795</td><td>opzionale, per diluizione seriale</td></tr><tr><td>di piastre Blood Omni</td><td>Hardy</td><td></td><td>#A127 opzionale, piastre rettangolari</td></tr></tbody></table>

una polmonite modello robusto in immunocompetenti roditori per valutare antibatterico efficacia contro<i&gt; s. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; h. influenzae</i&gt;,<i&gt; k. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; p. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; a. baumannii</em

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

L&#39;efficacia di candidati trattamenti antibatterici deve essere dimostrato in modelli animali di infezione, come parte del processo di scoperta e lo sviluppo, preferibilmente in modelli che imitano l&#39;indicazione clinica prevista. Un metodo per indurre infezioni polmonari robusti in ratti e topi immunocompetenti è descritto che permette la valutazione dei trattamenti in un modello di gravi polmonite da S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae o A. baumannii. Gli animali sono anestetizzati, e un inoculo di agar-based si deposita in profondità nei polmoni tramite intubazione endotracheale non chirurgica. L&#39;infezione risultante è coerente, riproducibile e stabile per almeno 48 ore e fino a 96 ore per la maggior parte degli isolati. Studi con antibatterici commercializzati hanno dimostrato una buona correlazione tra l&#39;efficacia in vivo e in sensibilità in vitro, e la concordanza tra farmacocinetica / farmacodinamica obiettivi determinatoin questo modello e gli obiettivi clinicamente accettate è stato osservato. Sebbene non vi sia un investimento di tempo iniziale quando l&#39;apprendimento della tecnica, può essere eseguita rapidamente ed efficientemente una volta raggiunta competenza. I vantaggi del modello comprendono eliminazione del requisito di neutropenia, maggiore robustezza e riproducibilità, capacità di studiare più agenti patogeni e isolati, una maggiore flessibilità nel disegno dello studio e la creazione di una infezione difficile in un host immunocompetenti.

Gli strumenti necessari, orientamento dell&#39;animale, e la profondità di intubazione sono mostrati in Figura 1. Anche mostrato è un esempio rappresentativo di colonie che crescono su una piastra di agar dopo la diluizione seriale e la placcatura triplice copia di un campione omogenato polmone. Un aumento della carica batterica di vari log 10 CFU sopra controlli di base è tipicamente osservata nei polmoni infetti per isolati batterici più, anche dopo l&#39;infezione, 96 h, e la variabilità tra animali è basso (figura 2). Per alcuni H. influenzae, ci può essere poca crescita; tuttavia, l&#39;infezione non dovrebbe cominciare ad auto-determinazione entro un periodo di tempo 48 o 96 ore (Figura 2B). Questo modello di infezione polmonare può essere utilizzato durante l&#39;ottimizzazione di serie chimica piombo per sostenere SAR, come mostrato in figura 3 per i composti rappresentativi di due diverse serie 16, 17. Esso fornisce un costante, riproducibile incontratohod per valutare PK / PD negli animali immunocompetenti ed è stato utilizzato per determinare quella zona libera di droga sotto la curva concentrazione-tempo sopra la concentrazione minima inibente (fAUC / MIC) correlata con l&#39;efficacia di un polipeptide deformylase romanzo (PDF) inibitore contro S. pneumoniae e H. influenzae (Figura 4). Inoltre, gli obiettivi / MIC fAUC per stasi e un 1-log 10 CFU riduzione dai controlli di base sono stati determinati attraverso 11 S. pneumoniae e 5 isolati H. influenzae (Tabella 1) 18. Accoppiamento questo modello di infezione con un sistema di somministrazione di farmaci per ricreare profili farmacocinetici umani in ratti crea un potente strumento per valutare regimi di dosaggio umani prima degli studi clinici. Un esempio di questo è riassunto nella tabella 2, il che dimostra che una formulazione a rilascio prolungato di amoxicillina-acido clavulanico è stato più efficace regimi di dosaggio esistenti per gli organismi con ElevaTed MIC Valori 19. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig1.jpg" /> Figura 1: non chirurgico intratracheale intubazione. Gli strumenti sono indicati per intubazione ratto (A) e il mouse (B). Una volta anestetizzato, l&#39;animale deve essere posizionato come mostrato in C, con la testa a destra e la coda a sinistra se la persona che esegue la tecnica è destrorso. Mettere il dito indice sinistro delicatamente sulla gola per aiutare a palpare gli anelli tracheali per la conferma del posizionamento della cannula corretta. L&#39;inoculo deve essere collocato in profondità nel polmone sinistro, come mostrato nella vista ventrale di un polmone di ratto (D). Le colonie che crescono su agar dopo diluizione seriale e placcatura di un campione dovrebbe apparire simile a quello mostrato in E. Figura 1D, Copyright © Gill Smith [animali da laboratorio, Volume 25 (1991), G. Smith, Ametodo non chirurgico semplice di instillazione endobronchiale per la costituzione delle infezioni respiratorie nel ratto, pagine 46 - 49] 14. Ristampato con il permesso. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig2.jpg" /> Figura 2: esempi rappresentativi di batterica crescita nei polmoni di animali infetti. Media ± deviazione dati CFU standard da N = 5 animali / gruppo viene mostrato per diversi isolati di S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) e A. baumannii (E). La prima barra di ogni coppia (grigio chiaro) è la linea di base bacteonere rial a infezioni post 1 o 2 ore, mentre il secondo bar è il controllo della crescita di fine studio a 48 ore dopo l&#39;infezione (grigio scuro) o infezione dopo 96 h (nero). sono stati applicati No Metodi Censura dati; in tal modo, questi risultati includono i dati provenienti da tutti i 5 animali per gruppo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig3.jpg" /> Figura 3: valutare l&#39;efficacia delle varie serie chimica durante l&#39;ottimizzazione di piombo. modelli di infezione polmonare, utilizzando le tecniche descritte sono stati utilizzati per esplorare le relazioni struttura-attività come parte di tipo abacterial programma IIA topoisomerasi. Promettenti composti 7 e 1 sono stati valutati contro i chinoloni-sensibili (A) 16 o resistenti ai chinoloni(B) 17 isolati di S. pneumoniae, rispettivamente. Ciascun simbolo rappresenta CFU determinato dai polmoni di un ratto con linee che rappresentano il gruppo media e deviazione standard. Limite inferiore di quantificazione (LLQ) era 1,7 log 10 CFU / polmoni. I composti sono stati pesati (56 o 112 mg di pura molecola genitore gratuito), sciolto in 9 ml di acqua sterile, diluita 3 ml in 3 ml di acqua (1: 1) e gestito da sonda gastrica di 1 ml / 125 g di ratto due volte al giorno ( 6 - 7 h a parte) per 2 giorni, a partire da dopo l&#39;infezione 1 h. controlli non trattato (NTC) sono stati campionati dopo l&#39;infezione 1 h per basale o trattate con soluzione salina e campionati alla fine dello studio (48 h) per i controlli di crescita. Figura 3A ristampato da Bioorganici &amp; Medicinal Chemistry Letters, Volume 21, TJ Miles et al, Novel cicloesil-amidi come antibatterici potenti di targeting di tipo batterico IIA topoisomerasi, Pages 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, con il permesso di Elsevier.Figura 3B ristampato da Bioorganici &amp; Medicinal Chemistry Letters, Volume 26, TJ Miles et al, triciclici Novel (ad es GSK945237) inibitori come potenti di tipo batterico IIA topoisomerasi, Pagine 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, con il permesso di Elsevier. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig4.jpg" /> Figura 4: PK / PD Caratterizzazione di un inibitore PDF Novel. Modelli Emax sono stati creati utilizzando dosi che vanno dati di efficacia nei topi immunocompetenti infettati nel polmone con isolati di S. pneumoniae (A) o H. influenzae (B) per determinare gli obiettivi PK / PD per un inibitore PDF novel 18. Circlesrappresentare la carica batterica media 4-5 topi / gruppo trattato con dosi variabili di composto. Le analisi sono state eseguite per correlare l&#39;efficacia con libera dalla droga 24 ore AUC (circoli aperti) o AUC / MIC (cerchi pieni). Ristampato con il permesso, Copyright © American Society for Microbiology, [agenti antimicrobici e Chemioterapia, il volume 60, 2016, pagine 180 - 189] 18. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Stasi </td><td colspan="2"> 1-log 10 riduzione </td><td></td></tr><tr><td> Organismo </td><td> MIC (mg / ml) </td><td> R 2 per linea fit (%) </td><td> fAUC </td><td> fAUC / MIC </td><td> fAUC </td><td> fAUC / MIC </td><td> Max uccisione (log 10 riduzione) </td></tr><tr><td> S. pneumoniae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10127 </td><td> 0.25 </td><td> 99,9 </td><td> 2.0 </td><td> 8.1 </td><td> 3.6 </td><td> 14.4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1316009S </td><td> 0.25 </td><td> 96.1 </td><td> 6.5 </td><td> 26.0 </td><td> 15.1 </td><td> 60.3 </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> ATCC10813 </td><td> 0.5 </td><td> 100 </td><td> 8.4 </td><td> 16.9 </td><td> 22.2 </td><td> 44.5 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> 1307007S </td><td> 1 </td&gt; <td> 95,8 </td><td> 16.1 </td><td> 16.1 </td><td> 20.1 </td><td> 20.1 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> ATCC6303 </td><td> 1 </td><td> 99,8 </td><td> 19.8 </td><td> 19.8 </td><td> 24.8 </td><td> 24.8 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1629 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 15.8 </td><td> 7.9 </td><td> 21.2 </td><td> 10.6 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> 298.443 </td><td> 2 </td><td> 99,9 </td><td> 26,5 </td><td> 13.2 </td><td> 31,0 </td><td> 15.5 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> 336.808 </td><td> 2 </td><td> 86 </td><td> 8.2 </td><td> 4.2 </td><td> 19,0 </td><td> 9.5 </td><td> 2.6 </td></tr><tr><td> 338.860 </td><td> 2 </td><td> 99.5 </td><td> 2.9 </td><td> 1.5 </td><td> 6.7 </td><td> 3.4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> &amp; #160; 340449 </td><td> 2 </td><td> 94,6 </td><td> 8.0 </td><td> 4.0 </td><td> 14.9 </td><td> 7.4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr><td> L11259 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 7.1 </td><td> 3.5 </td><td> 9.0 </td><td> 4.5 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> Media ± DS </td><td> NA un </td><td> N / A </td><td> 11.0 ± 7.5 </td><td> 11.0 ± 7.9 </td><td> 17.0 ± 8.2 </td><td> 19.5 ± 17.8 </td><td> 2.3 ± 0.5 </td></tr><tr><td> Mediano </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 8.2 </td><td> 8.1 </td><td> 19,0 </td><td> 14.4 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> H. influenzae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1998-100-126H </td><td> 1 </td><td> 99,7 </td><td> 7.3 </td><td> 7.3 </td><td> 13.4 </td><td> 13.4 </td><td> 2.9 </td></tr><tr><td> 503-008H </td><td> 1 </td><td> 99,8 </td><td> 7.1 </td><td> 7.1 </td><td> 13.9 </td><td> 13.9 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 08003H </td><td> 2 </td><td> 99,9 </td><td> 14.5 </td><td> 7.2 </td><td> 16,7 </td><td> 8.3 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> H128 </td><td> 2 </td><td> 96.6 </td><td> 15.3 </td><td> 7.6 </td><td> 26.0 </td><td> 13,0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 19001H </td><td> 4 </td><td> 91,9 </td><td> 14.8 </td><td> 3.7 </td><td> 37.3 </td><td> 9.3 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> Media ± DS </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 11.8 ± 4.2 </td><td> 6.6 ± 1.6 </td><td> 21.5 ± 10.2 </td><td> 11.6 ± 2.6 </td><td> 2.8 ± 0.1 </td></tr><tr><td> Mediano </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 14.5 </td><td> 7.2 </td><td> 16,7 </td><td> 13,0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> un NA, non applicabile. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1: PK / PD Obiettivi per un inibitore PDF romanzo contro S. pneumoniae e H. influenzae Isolati. AUC libera dalla droga e AUC / MIC obiettivi di stasi e un 1-log 10 CFU riduzione dal basale sono stati determinati per 11 S. pneumoniae e 5 H. influenzae in topi immunocompetenti infettati nel polmone e trattati con il composto 18. il DATuna è stata utilizzata per aiutare a selezionare le dosi umane per lo sviluppo clinico. Questa tabella è stata adattata e ristampato con il permesso, Copyright © American Society for Microbiology, [agenti antimicrobici e Chemioterapia, il volume 60, 2016, pagine 180 - 189] 18. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Gruppo di trattamento a </td><td colspan="8"> Significano log 10 S. pneumoniae (CFU / polmone) b ± SD per ceppo (AMX / CA MIC): </td></tr><tr><td> 05010S (2 mg / ml) </td><td> 16001S c (4 mg / ml) </td><td> 16001S (4 mg / ml) </td><td> 30005S (4 mg / ml) </td><td> 20009S (4 mg / ml) </td><td> 05003S (8 mg / ml) </td><td> 404.053 (8 mg / ml) </td><td> 47003S (8 mg / ml) </td></tr><tr><td> Controllo </strong&gt; </td><td> 7.3 ± 0.4 </td><td> 7,0 ± 0,8 </td><td> 5.7 ± 1.2 </td><td> 7.1 ± 0.7 </td><td> 7.1 ± 0.4 </td><td> 6.4 ± 0.6 </td><td> 6.8 ± 0.4 </td><td> 6.0 ± 0.3 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2.000 / 125 mg bid (rapporto 16: 1) </td><td> ≤ 1,7 ** </td><td> 2.8 ± 1.2 ** </td><td> 2.2 ± 0.8 ** </td><td> 2.3 ± 0.9 ** </td><td> 2,5 ± 0,9 ** </td><td> 2.0 ± 0.9 ** </td><td> 3.8 ± 1.4 ** </td><td> 1.8 ± 0.2 ** </td></tr><tr><td> 1.000 / 125 mg tre volte al giorno (rapporto 8: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 2.8 ± 0.5 ** </td><td> 2.7 ± 1.3 ** </td><td> 3.3 ± 0.9 ** </td><td> 4.9 ± 0.5 ** </td><td> 6.6 ± 1.3 </td><td> 4.7 ± 0.7 ** </td></tr><tr> &lt;td&gt; 875/125 mg tid (rapporto 7: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 3.0 ± 1.3 * </td><td> 2.1 ± 0.7 ** </td><td> 3.2 ± 0.4 ** </td><td> 5.2 ± 0.9 * </td><td> 6.4 ± 0.6 </td><td> 4.9 ± 0.4 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg bid (rapporto 7: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 4,5 ± 1,2 * </td><td> 5.6 ± 1.3 * </td><td> 5.2 ± 0.7 ** </td><td> 6.3 ± 0.7 </td><td> 6.4 ± 0.7 </td><td> 5.5 ± 0.4 </td></tr><tr><td> 500/125 mg tre volte al giorno (rapporto 4: 1) </td><td> 3.1 ± 1.3 ** </td><td> 4,5 ± 0,9 ** </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td></tr><tr><td> Azitromicina, 1.000 / 500 mg od </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 5.8 ± 2.0 </td><td> 7.1 ± 0.9 </td><td> 3.1 ± 1.0 ** </td><td> 6.6 ± 0.4 </td><td> 6.07; 0.6 </td></tr><tr><td> Levofloxacina, 500 mg od </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 4.2 ± 0.8 * </td><td> 5.7 ± 0.8 * </td><td> 4.9 ± 0.8 ** </td><td> 3.0 ± 1.3 ** </td><td> 3.5 ± 0.2 ** </td><td> 3.9 ± 0.8 ** </td></tr><tr><td rowspan="2"> Gruppo di trattamento d </td><td colspan="8"> Media log 10 H. influenzae (CFU / polmone) ± SD per ceppo: </td></tr><tr><td colspan="4"> H128 (β-lattamasi positivi) </td><td colspan="4"> Chesterfield (β-lattamasi negativo, resistente ampicillina) </td></tr><tr><td> Controllo </td><td colspan="4"> 6.4 ± 0.6 </td><td colspan="4"> 6,7 ± 0,6 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.000 / 125 mg bid (rapporto 16: 1) </td><td colspan="4"> 2.0 ± 0.7 ** </td><td colspan="4"> 3.1 ± 0.9 ** </td></tr><tr><td> 1.000 / 125 mg tre volte al giorno (rapporto 8: 1) </td><td colspan="4"> 2.1 ± 1.0 ** </td><td colspan="4"> 3.6 ± 1.1 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg TID (rapporto 7: 1) </td><td colspan="4"> 2.8 ± 1.3 ** </td><td colspan="4"> 3.8 ± 1.3 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg bid (rapporto 7: 1) </td><td colspan="4"> 2.0 ± 0.8 ** </td><td colspan="4"> 5.1 ± 1.1 ** </td></tr><tr><td> Azitromicina, 1.000 / 500 mg od </td><td colspan="4"> 3.2 ± 1.7 * </td><td colspan="4"> 5.8 ± 1.1 </td></tr><tr><td> Levofloxacina, 500 mg od </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td></tr><tr><td colspan="9"> un AMX / CA, amoxicillina-acido clavulanico; offerta, due volte al giorno; tid., tre volte al giorno; od una volta al giorno. </td></tr><tr><td colspan="9"> B Il limite di rilevazione è stato &lt;1,7; *, Significativamente differenti dal controllo (P ≤ 0,05); **, Significativamente differenti dal controllo (P ≤ 0,01); NT, non testato. </td></tr><tr><td colspan="9"> c Strain 16001S è stato testato in due esperimenti separati. </td></tr><tr><td colspan="9"> d amoxicillina-acido clavulanico 500/125 mg (4: 1) tre volte al giorno non è stato testato contro i ceppi di H. influenzae. </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Efficacia di Recreated plasma umano profili di esposizione per i diversi Amoxicillina / Clavulanate regimi di dosaggio. I dati generati nei ratti infetti immunocompetenti nel polmone con isolati di S. pneumoniae o H. influenzae che utilizzano questo modello hanno dimostrato che una migliore formulazione di amoxicillina-acido clavulanico (2, 000/125 mg due volte al giorno) è stato più efficace di regimi di dosaggio standard, nei confronti di isolati con elevata sensibilità in vitro 19. Questa tabella è stata adattata e ristampato con il permesso, Copyright © American Society for Microbiology, [agenti antimicrobici e Chemioterapia, il volume 49, 2005 pagine 908 - 915] 19.

Viene descritto un metodo per stabilire infezioni polmonari in roditori immunocompetenti. Con competenza, questo metodo può essere eseguito rapidamente e facilmente per indurre un'infezione stabile con molti isolati di S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae e A. baumannii.

Una polmonite Modello robusto in immunocompetenti roditori per valutare antibatterico efficacia contro<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

L'obiettivo generale di questa procedura di infezione intrabronchiale non chirurgica è stabilire una robusta polmonite batterica nei roditori immunocompetenti. Questo metodo aggiunge valore per la scoperta e lo sviluppo di antibatterici, consentendo di valutare l'efficacia di potenziali trattamenti in un modello immunocompetente di polmonite grave. Il vantaggio principale di questa tecnica è che stabilisce un'infezione polmonare robusta e riproducibile con molti isolati, compresi quelli che in genere richiedono che gli animali siano neutropenici o isolati che non producono un'infezione vitale con altri metodi.In generale, le persone nuove a questa procedura avranno difficoltà. Una corretta intubazione è una procedura alla cieca che richiede l'apprendimento della giusta sensazione per intubare la trachea invece dell'esofago. Una corretta intubazione è diversa per ogni scienziato.L'angolo esatto della cannula potrebbe non essere lo stesso per tutti. Sentire le creste della trachea è la chiave. A dimostrare questa tecnica, sarà Cindy Mininger, scienziata del nostro laboratorio.Per iniziare, preparare sospensioni batteriche saline da colture di brodo durante la notte, come indicato nel protocollo di testo, o da piastre di agar, come dimostrato qui. Raccogli la crescita notturna dalle piastre di agar utilizzando un anello sterile per raschiare le colonie dalla superficie. Trasferire il materiale raccolto in cinque millilitri di soluzione fisiologica sterile fino ad ottenere una sospensione torbida e opaca e agitare delicatamente la coltura fino a renderla omogenea.Diluire quindi in serie e impiattare un'aliquota da ciascuna diluizione secondo il protocollo di testo. Dopo aver preparato l'agar e assemblato gli strumenti necessari per il processo di infezione, secondo il protocollo di testo, aliquotare nove millilitri di agar in una provetta sterile e quindi posizionare la provetta nel bagno d'acqua fino a quando l'agar non si equilibra a circa 42 gradi Celsius. Aggiungere un millilitro della sospensione batterica salina precedentemente preparata nel tubo di agar.Quindi, capovolgere più volte il tubo per mescolare e rimetterlo nell'acqua. Posizionare un tappetino usa e getta pulito sulla superficie di lavoro vicino al bagnomaria. Per preparare il piano di lavoro e il dispositivo di intubazione, sterilizzare prima la cannula metallica e il tubo in polietilene secondo il protocollo di testo e poi trasferirlo nel suo tubo di vetro sul piano di lavoro.Quindi, rimuovere il tappo dal tubo di conservazione e far scorrere l'estremità dell'impugnatura della cannula verso l'estremità aperta del tubo. Utilizzando una pinza sterile, rimuovere un pezzo di tubo in polietilene dal becher e inserirlo all'interno della cannula metallica sterile, assicurandosi che si muova liberamente. Posizionare un segno guida in una posizione predeterminata con una penna indelebile.Quindi, inserire un ago sterile monouso da 25 gauge sull'estremità libera del tubo in polietilene facendo scorrere l'ago di diversi millimetri nel tubo. Quindi, utilizzare una soluzione fisiologica sterile per riempire una nuova siringa monouso da un millilitro. Collegare la siringa all'ago montato sul tubo in polietilene e far scorrere l'intero volume di soluzione fisiologica attraverso il tubo.Gettare la siringa usata nel contenitore per oggetti taglienti. Quindi, riempire una nuova siringa sterile monouso da un millilitro con l'inoculo a base di agar dal bagnomaria. Ricollegare l'ago e il tubo calibro 25 e far scorrere l'agar attraverso il tubo premendo lo stantuffo fino a quando il tubo non è completamente pieno di agar.Dopo aver anestetizzato il ratto secondo il protocollo di testo, posizionare l'animale in posizione supina sul tappetino monouso con la testa rivolta a destra e la coda rivolta a sinistra. Quindi, inserisci l'estremità libera della cannula metallica nella bocca dell'animale. Ruotare la cannula in modo che l'estremità libera sia angolata verso l'alto e farla avanzare delicatamente nella trachea, bypassando accuratamente le strutture laringee con un leggero movimento rotatorio.Confermare l'inserimento nella trachea, anziché nell'esofago, facendo scorrere delicatamente la cannula leggermente in avanti e indietro più volte mentre si utilizza l'indice sinistro per palpare gli anelli tracheali. Per garantire l'intubazione nella trachea e non nell'esofago, muovere leggermente la cannula avanti e indietro e sentire le creste. Se la cannula scivola dolcemente lungo la gola e le creste non possono essere percepite, rimuovere il dispositivo e riprovare.Quando la cannula raggiunge la biforcazione in cui la trachea si divide nei bronchi sinistro e destro, fare un leggero movimento di torsione verso il lato sinistro dell'animale per assicurarsi che la cannula sia inserita nel bronco sinistro. Un errore comune è non posizionare l'inoculo abbastanza in profondità nel polmone, che può bloccare le vie aeree e inibire la respirazione. Quando la cannula viene ruotata all'angolazione corretta, dovrebbe scivolare facilmente nel bronco sinistro e avanzare dolcemente fino alla profondità appropriata.Far avanzare la cannula metallica fino a metà corsa a tre quarti del polmone sinistro, utilizzando il segno guida precedentemente posizionato per confermare che sia stata raggiunta la profondità appropriata. Con la cannula metallica in posizione, far avanzare il tubo in polietilene di diversi millimetri utilizzando il segno guida precedentemente posizionato sul tubo per assicurarsi che sia avanzato solo quanto basta per uscire dall'estremità della cannula metallica e non perforare il polmone. Con entrambe le cannule in posizione, utilizzare la siringa in dotazione per instillare 100 microlitri di sospensione di agar in profondità nel grande lobo del polmone sinistro.Estrarre alcuni millimetri del tubo e rimuovere delicatamente il dispositivo di intubazione intatto. Rimettilo nel tubo di vetro e sposta l'animale in una gabbia fresca per riprenderlo. Preparare il piano di lavoro e la cannula come appena dimostrato per i ratti, utilizzando l'attrezzatura per topi di dimensioni adeguate.Utilizzare una siringa sterile monouso da 1 millilitro e un ago sterile da 25 gauge per riempire la siringa di vetro per microiniezione con soluzione fisiologica sterile. Quindi, lavare la soluzione salina attraverso il dispositivo riassemblato. Quindi, utilizzare una nuova siringa sterile monouso da un millilitro e un ago sterile da 25 gauge per riempire la siringa per microiniezione con l'inoculo di agar.Quindi, rimontare il dispositivo e far scorrere l'agar attraverso il tubo fino a quando il tubo non è completamente riempito di agar. Dopo aver anestetizzato il topo secondo il protocollo di testo, posizionare l'animale nello stesso orientamento dimostrato per il ratto e usare una pressione costante ma delicata per intubare la trachea in modo simile a come con il ratto. Evita di usare la forza poiché la tecnica è più delicata nei topi.Assicurarsi che la cannula sia inserita nella trachea sentendo gli anelli tracheali. Ruotare leggermente e far avanzare la cannula nel bronco sinistro, inserendola in profondità nel polmone utilizzando i segni guida precedentemente posizionati. Con la cannula metallica in posizione, far avanzare il tubo in polietilene di diversi millimetri e infondere 20 microlitri di sospensione di agar.Qui è mostrato un esempio rappresentativo di colonie che crescono su una piastra di agar dopo la diluizione seriale e la triplicazione di un campione di omogeneizzato polmonare. Come dimostrato in questo grafico con S. pneumoniae, un aumento della carica batterica di diversi log base dieci CFU al di sopra dei controlli basali è tipicamente osservato nei polmoni infetti per la maggior parte degli isolati batterici, anche a 96 ore dopo l'infezione, e la variabilità tra gli animali è bassa. In questo esperimento, due composti sono stati valutati rispetto a isolati di S. pneumoniae sensibili ai chinoloni o ai chinoloni per illustrare che questo modello di infezione polmonare può essere utilizzato durante l'ottimizzazione di una serie chimica guida per supportare le relazioni struttura-attività.Ogni simbolo rappresenta le CFU determinate dai polmoni di un ratto. Qui sono mostrati i modelli E max creati utilizzando dati di efficacia dose-ranging in topi immunocompetenti infettati nel polmone con isolati di S. pneumoniae o H. influenzae per determinare bersagli farmacocinetici e farmacodinamici per un nuovo inibitore della deformilasi polipeptidica. I cerchi rappresentano la carica batterica media da quattro a cinque topi per gruppo trattati con dosi variabili di composto.I cerchi aperti rappresentano l'area libera sotto la curva e i cerchi pieni rappresentano l'area sotto la curva del tempo di concentrazione rispetto alla concentrazione inibitoria minima. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa 30 secondi per animale, con un massimo di cinque o sei animali inoculati per siringa di inoculo di agar. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire questo metodo di infezione intrabronchiale non chirurgica ed essere in grado di utilizzarlo per stabilire infezioni polmonari con molti isolati batterici diversi.energetico strumentale

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Fonte: Lenhard, A. et al. Un modello murino per la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno dopo la co-infezione virale riproduce la malattia aggravata dall'età. J. Vis. Esp. (2022)Questo video mostra un modello di co-infezione topina in cui il virus influenzale innesca la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno. Descrive le fasi coinvolte nella colonizzazione batterica, nelle infezioni virali e nella progressione della malattia.

Un modello murino per studiare la transizione patogena di Streptococcus pneumoniae dopo la co-infezione virale

Questo video dimostra l'instaurazione di un'infezione polmonare in un modello di roditore immunocompetente tramite intubazione e installazione di sospensioni batteriche nei lobi polmonari. Questo modello consente studi di efficacia antibatterica in animali immunocompetenti.

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A seguito in tempo reale l&#39;impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

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Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l&#39;induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

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Un sistema preciso di distribuzione e recupero di patogeni per i modelli Murine di polmonite batterica secondaria

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