Una polmonite Modello robusto in immunocompetenti roditori per valutare antibatterico efficacia contro S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa o A. baumannii

L'obiettivo generale di questa procedura di infezione intrabronchiale non chirurgica è stabilire una robusta polmonite batterica nei roditori immunocompetenti. Questo metodo aggiunge valore per la scoperta e lo sviluppo di antibatterici, consentendo di valutare l'efficacia di potenziali trattamenti in un modello immunocompetente di polmonite grave. Il vantaggio principale di questa tecnica è che stabilisce un'infezione polmonare robusta e riproducibile con molti isolati, compresi quelli che in genere richiedono che gli animali siano neutropenici o isolati che non producono un'infezione vitale con altri metodi.

In generale, le persone nuove a questa procedura avranno difficoltà. Una corretta intubazione è una procedura alla cieca che richiede l'apprendimento della giusta sensazione per intubare la trachea invece dell'esofago. Una corretta intubazione è diversa per ogni scienziato.

L'angolo esatto della cannula potrebbe non essere lo stesso per tutti. Sentire le creste della trachea è la chiave. A dimostrare questa tecnica, sarà Cindy Mininger, scienziata del nostro laboratorio.

Per iniziare, preparare sospensioni batteriche saline da colture di brodo durante la notte, come indicato nel protocollo di testo, o da piastre di agar, come dimostrato qui. Raccogli la crescita notturna dalle piastre di agar utilizzando un anello sterile per raschiare le colonie dalla superficie. Trasferire il materiale raccolto in cinque millilitri di soluzione fisiologica sterile fino ad ottenere una sospensione torbida e opaca e agitare delicatamente la coltura fino a renderla omogenea.

Diluire quindi in serie e impiattare un'aliquota da ciascuna diluizione secondo il protocollo di testo. Dopo aver preparato l'agar e assemblato gli strumenti necessari per il processo di infezione, secondo il protocollo di testo, aliquotare nove millilitri di agar in una provetta sterile e quindi posizionare la provetta nel bagno d'acqua fino a quando l'agar non si equilibra a circa 42 gradi Celsius. Aggiungere un millilitro della sospensione batterica salina precedentemente preparata nel tubo di agar.

Quindi, capovolgere più volte il tubo per mescolare e rimetterlo nell'acqua. Posizionare un tappetino usa e getta pulito sulla superficie di lavoro vicino al bagnomaria. Per preparare il piano di lavoro e il dispositivo di intubazione, sterilizzare prima la cannula metallica e il tubo in polietilene secondo il protocollo di testo e poi trasferirlo nel suo tubo di vetro sul piano di lavoro.

Quindi, rimuovere il tappo dal tubo di conservazione e far scorrere l'estremità dell'impugnatura della cannula verso l'estremità aperta del tubo. Utilizzando una pinza sterile, rimuovere un pezzo di tubo in polietilene dal becher e inserirlo all'interno della cannula metallica sterile, assicurandosi che si muova liberamente. Posizionare un segno guida in una posizione predeterminata con una penna indelebile.

Quindi, inserire un ago sterile monouso da 25 gauge sull'estremità libera del tubo in polietilene facendo scorrere l'ago di diversi millimetri nel tubo. Quindi, utilizzare una soluzione fisiologica sterile per riempire una nuova siringa monouso da un millilitro. Collegare la siringa all'ago montato sul tubo in polietilene e far scorrere l'intero volume di soluzione fisiologica attraverso il tubo.

Gettare la siringa usata nel contenitore per oggetti taglienti. Quindi, riempire una nuova siringa sterile monouso da un millilitro con l'inoculo a base di agar dal bagnomaria. Ricollegare l'ago e il tubo calibro 25 e far scorrere l'agar attraverso il tubo premendo lo stantuffo fino a quando il tubo non è completamente pieno di agar.

Dopo aver anestetizzato il ratto secondo il protocollo di testo, posizionare l'animale in posizione supina sul tappetino monouso con la testa rivolta a destra e la coda rivolta a sinistra. Quindi, inserisci l'estremità libera della cannula metallica nella bocca dell'animale. Ruotare la cannula in modo che l'estremità libera sia angolata verso l'alto e farla avanzare delicatamente nella trachea, bypassando accuratamente le strutture laringee con un leggero movimento rotatorio.

Confermare l'inserimento nella trachea, anziché nell'esofago, facendo scorrere delicatamente la cannula leggermente in avanti e indietro più volte mentre si utilizza l'indice sinistro per palpare gli anelli tracheali. Per garantire l'intubazione nella trachea e non nell'esofago, muovere leggermente la cannula avanti e indietro e sentire le creste. Se la cannula scivola dolcemente lungo la gola e le creste non possono essere percepite, rimuovere il dispositivo e riprovare.

Quando la cannula raggiunge la biforcazione in cui la trachea si divide nei bronchi sinistro e destro, fare un leggero movimento di torsione verso il lato sinistro dell'animale per assicurarsi che la cannula sia inserita nel bronco sinistro. Un errore comune è non posizionare l'inoculo abbastanza in profondità nel polmone, che può bloccare le vie aeree e inibire la respirazione. Quando la cannula viene ruotata all'angolazione corretta, dovrebbe scivolare facilmente nel bronco sinistro e avanzare dolcemente fino alla profondità appropriata.

Far avanzare la cannula metallica fino a metà corsa a tre quarti del polmone sinistro, utilizzando il segno guida precedentemente posizionato per confermare che sia stata raggiunta la profondità appropriata. Con la cannula metallica in posizione, far avanzare il tubo in polietilene di diversi millimetri utilizzando il segno guida precedentemente posizionato sul tubo per assicurarsi che sia avanzato solo quanto basta per uscire dall'estremità della cannula metallica e non perforare il polmone. Con entrambe le cannule in posizione, utilizzare la siringa in dotazione per instillare 100 microlitri di sospensione di agar in profondità nel grande lobo del polmone sinistro.

Estrarre alcuni millimetri del tubo e rimuovere delicatamente il dispositivo di intubazione intatto. Rimettilo nel tubo di vetro e sposta l'animale in una gabbia fresca per riprenderlo. Preparare il piano di lavoro e la cannula come appena dimostrato per i ratti, utilizzando l'attrezzatura per topi di dimensioni adeguate.

Utilizzare una siringa sterile monouso da 1 millilitro e un ago sterile da 25 gauge per riempire la siringa di vetro per microiniezione con soluzione fisiologica sterile. Quindi, lavare la soluzione salina attraverso il dispositivo riassemblato. Quindi, utilizzare una nuova siringa sterile monouso da un millilitro e un ago sterile da 25 gauge per riempire la siringa per microiniezione con l'inoculo di agar.

Quindi, rimontare il dispositivo e far scorrere l'agar attraverso il tubo fino a quando il tubo non è completamente riempito di agar. Dopo aver anestetizzato il topo secondo il protocollo di testo, posizionare l'animale nello stesso orientamento dimostrato per il ratto e usare una pressione costante ma delicata per intubare la trachea in modo simile a come con il ratto. Evita di usare la forza poiché la tecnica è più delicata nei topi.

Assicurarsi che la cannula sia inserita nella trachea sentendo gli anelli tracheali. Ruotare leggermente e far avanzare la cannula nel bronco sinistro, inserendola in profondità nel polmone utilizzando i segni guida precedentemente posizionati. Con la cannula metallica in posizione, far avanzare il tubo in polietilene di diversi millimetri e infondere 20 microlitri di sospensione di agar.

Qui è mostrato un esempio rappresentativo di colonie che crescono su una piastra di agar dopo la diluizione seriale e la triplicazione di un campione di omogeneizzato polmonare. Come dimostrato in questo grafico con S. pneumoniae, un aumento della carica batterica di diversi log base dieci CFU al di sopra dei controlli basali è tipicamente osservato nei polmoni infetti per la maggior parte degli isolati batterici, anche a 96 ore dopo l'infezione, e la variabilità tra gli animali è bassa. In questo esperimento, due composti sono stati valutati rispetto a isolati di S. pneumoniae sensibili ai chinoloni o ai chinoloni per illustrare che questo modello di infezione polmonare può essere utilizzato durante l'ottimizzazione di una serie chimica guida per supportare le relazioni struttura-attività.

Ogni simbolo rappresenta le CFU determinate dai polmoni di un ratto. Qui sono mostrati i modelli E max creati utilizzando dati di efficacia dose-ranging in topi immunocompetenti infettati nel polmone con isolati di S. pneumoniae o H. influenzae per determinare bersagli farmacocinetici e farmacodinamici per un nuovo inibitore della deformilasi polipeptidica. I cerchi rappresentano la carica batterica media da quattro a cinque topi per gruppo trattati con dosi variabili di composto.

I cerchi aperti rappresentano l'area libera sotto la curva e i cerchi pieni rappresentano l'area sotto la curva del tempo di concentrazione rispetto alla concentrazione inibitoria minima. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa 30 secondi per animale, con un massimo di cinque o sei animali inoculati per siringa di inoculo di agar. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire questo metodo di infezione intrabronchiale non chirurgica ed essere in grado di utilizzarlo per stabilire infezioni polmonari con molti isolati batterici diversi.

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