Name: Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per linduzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Scopri un metodo non invasivo per indurre polmonite batterica nei topi mediante aspirazione orofaringea di K. pneumoniae. Questa tecnica semplice permette di quantificare la risposta immunitaria polmonare innata anche in laboratori con limitata esperienza.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dal Programma di Ricerca Intramurale del National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la legge sul benessere degli animali e la politica US Public Health Service su Humane cura e l&#39;uso di animali da laboratorio dopo la revisione dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del NIEHS. 1. Preparazione di K. Cultura pneumoniae Attenzione: eseguire tutti i passaggi del 2 (BSL2) cappuccio o altra area designata BSL2 livello di biosicurezza e gettare i rifiuti secondo le linee guida BSL2 istituto. <ol><li> Per la crescita sospensione K. pneumoniae, scongelare uno stock di glicerolo di batteri e inoculare una cultura del lavoro trasferendo 1 ml di K. pneumoniae stock da 50 ml di brodo di soia trittico (TSB) in un pallone da 500 ml o più grande. </li><li> Fare scorte glicerolo con l&#39;aggiunta di 900 ml di coltura log-fase di K. pneumoniae a 100 ml di glicerolo sterile e congelamento a -20 ° C o -80 ° C. Per la conservazione a lungo termine, si raccomanda -80 ° C. </li><li> Coltura dei batteri da stEP 1.1 agitando matraccio overnight (14 - 18 hr) a 37 ° C a 200-225 rpm.In per promuovere la crescita di fase log, diluire 1-5 ml di questa coltura durante la notte in un pallone contenente 50 ml TSB la mattina e mettere di nuovo a 37 ° C con agitazione per ~ 2,5 ore. </li><li> Trasferire 1 ml di K. cultura pneumoniae dal l&#39;ultimo passo in una provetta da 1,5 ml e far girare a 7.500 xg per 2 minuti. Un pellet bianco dovrebbe essere visibile. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet, risospendere delicatamente i batteri con la pipetta in 1 ml di soluzione fisiologica sterile, e far girare di nuovo a 7.500 xg per 2 minuti. <ol><li> Eseguire questo passaggio di lavaggio 2x, fanalino di finale, pellet lavato in 1 ml di soluzione fisiologica sterile. </li></ol></li><li> Eseguire diluizioni seriali di log-saggio di questo inoculo pulito. Ad esempio, aggiungere 400 ml di inoculo in 3,6 ml di soluzione salina sterile serialmente per effettuare una serie di 10 -1 -10 -9 diluizione. </li><li> Determinare la OD 600 di lavato K. pneumoniae ponendo 1 ml di1:10 e 1: 100 diluizioni in cuvette usa e getta e la misurazione del diametro esterno 600, tranciatura prima con soluzione salina sterile. Misurare i duplicati per garantire l&#39;accuratezza. Un OD 600 di 1,0 equivale all&#39;incirca a 4-7 x 10 8 UFC / ml. Si noti che il rapporto tra OD e CFU / ml non può essere lineare. <ol><li> Utilizzare la OD 600 dalle diluizioni per calcolare la concentrazione di K. pneumoniae, applicando la OD: conversione CFU / ml sopra, e factoring nella diluizione. </li></ol></li><li> Utilizzare il K. concentrazione pneumoniae per preparare la dose di inoculo CFU desiderato in &lt;volume di 100 microlitri per la consegna per topi (vedere sotto). </li><li> Piatto anche 100 ml di 10 -6 -10 -9 diluizioni e 100 ml di soluzione fisiologica sterile su piastre di agar singoli trittico di soia (TSA) a temperatura ambiente. Incubare a 37 ° C per una notte e contare le colonie batteriche per calcolare la concentrazione esatta che è stato utilizzato in esperimenti e controllare la contaminazione. NOTA: la concentrazione batterica effettivo di inoculo finale può essere ± 500 UFC / ml quella prevista dalla assorbanza. Gli sperimentatori dovrebbero idealmente confermare l&#39;OD 600: CFU / ml rapporto in studi pilota preliminari da utilizzare in vivo nel topo, empiricamente riaggiustare la OD 600: UFC / ml di conversione in base alla loro esperienza personale. </li></ol> 2. murino intratracheale (IT) L&#39;aspirazione di K. pneumoniae da Orofaringe <ol><li> Assicurarsi che i topi sono identificati univocamente da Mark coda, tatuaggio, o altro identificativo approvato. </li><li> Elaborare dosaggio inoculo di batteri utilizzando P200 pipetta prima di rimuovere i topi da isoflurano al fine di accelerare procedimento. Per ottenere i migliori risultati con esso aspirazione, utilizzare un volume di &lt;100 microlitri per evitare overflow. Qui, usare 2000 UFC / 50 ml di K. pneumoniae. </li><li> Anestetizzare topi in modo chiaro da camera con gas isoflurano (ad esempio, 2% isoflurano a portata di 1 l / min) o secondo institlinee guida utional. Il numero di topi per anestetizzare insieme è determinata dal livello di comfort dello sperimentatore, tipicamente 1-2 alla volta. Osservare la respirazione e confermare il livello di anestesia volta respiri profondi sono visibili e 2-3 secondi possono essere contati tra i respiri. NOTA: Se c&#39;è preoccupazione sui possibili effetti confondenti di anestetici volatili (per via inalatoria), l&#39;anestesia può essere raggiunto invece con iniezione intraperitoneale di ketamina / xylazina. Con il metodo sopra descritto, l&#39;anestesia profonda dura pochi minuti. Se più anestesia prolungata è indotta, pomata oculare dovrebbe essere usato per prevenire l&#39;essiccamento oculare. </li><li> Una volta che il mouse è anestetizzato, posizionarlo in posizione supina semiseduta, sospesa dalle incisivi mascellari da un elastico teso tra pioli su una scheda di plexiglas inclinato (Figura 1). </li><li> Tirare delicatamente la lingua del mouse al lato con un paio di pinze non ridged contundenti e la dose di deposito nella cavità orale con un pipett P200e. Esercitare la massima cura per evitare di indurre traumi sia alla lingua o dell&#39;orofaringe. </li><li> Pur mantenendo la lingua retratta, occludere delicatamente il naso con un dito guantato fino il mouse inala. Continuare a coprire il naso finché il mouse non ha preso due o più inalazioni, e nessun liquido è visibile nella cavità orale. Coprendo il naso aiuta a garantire che il mouse si inalano i batteri nei polmoni, come i topi sono sfiati naso obbligati. </li><li> Rimuovere il mouse dalla scheda di inoculazione e tornare alla sua gabbia, posizionando il mouse sulla sua schiena per evitare lenzuola o detriti bloccando le narici mentre il mouse si sta riprendendo dall&#39;anestesia. </li><li> Una volta che tutti i topi sono stati dosati e hanno risvegliato dall&#39;anestesia, topi casa in una cabina / camera che contengono solo i topi che sono stati dosati con K. pneumoniae. Monitorare i topi al giorno, compresi i pesi corporei se andare al di là di post-infezione 48 ore. </li><li> Utilizzare poltiglia giornaliero e / o di calore supplementare se consentire i topi di andare oltre 48hr. </li></ol> 3. lavaggio broncoalveolare Fluid (BAL) raccolta e analisi <ol><li> Euthanize topi secondo le linee guida istituzionali. Qui, utilizzare un&#39;iniezione letale di 150 mg / kg pentobarbital sodio o dose equivalente di soluzione dell&#39;eutanasia commerciale seguita da dissanguamento, come questo evita possibili complicazioni ai polmoni associata con CO 2 inalazione e dislocazione cervicale. </li><li> del mouse Posizione sulla schiena e sterilizzare il mouse spruzzando pelliccia con il 70% di etanolo in particolare sulla zona del torace e del collo. </li><li> Fare un taglio longitudinale appena sotto lo sterno, quindi si tiene lo sterno con una pinza, Nick il diaframma, permettendo al polmone a ripiegare nella cavità toracica. Tagliare attraverso la cavità toracica su entrambi i lati del sistema vascolare e poi attraverso il collo, esponendo la trachea. </li><li> Poiché la trachea è circondato da muscoli longitudinali su entrambi i lati, accuratamente tagliato nel mezzo e spingere il tessuto ai lati, comequesto evita il taglio della vascolarizzazione circostante, che potrebbe introdurre il sangue nella trachea. Se il sistema vascolare è scalfito, pulire l&#39;area circostante con una garza prima di accedere il lume tracheale. </li><li> Usare le forbici chirurgiche o un ago per nick trachea circa ¼ fino in fondo dalla testa e inserire una cannula collegata ad una siringa da 1 ml precaricato con 1 ml di 1x PBS (PBS) caudalmente nella trachea. Se si utilizzano topi &lt;8 settimane di età o di sesso femminile, ridurre il volume lavaging di 600-800 ml. </li><li> Inserire il volume nei polmoni lentamente, permettendo a tutti i lobi di gonfiarsi e poi tirare il volume sul retro con la siringa, ripetendo 3x. Se PBS fuoriesce narici cannula non è stato spinto abbastanza lontano in trachea o inflazione verificano troppo rapidamente. In alternativa, se i polmoni non sono gonfiando bene, la cannula è stato spinto in troppo, quindi ritirare leggermente. </li><li> Raccogliere lava pool in un tubo da 15 ml su ghiaccio. </li><li> rotazioneil fluido di lavaggio dello spazio aereo a 1200 xg per 5 min, raccogliere il supernatante in una provetta da 1,5 ml e congelare a -80 ° C. Successivamente, utilizzare il surnatante (cioè, BALF) per la misurazione di proteine, citochine, e per vari altri saggi biochimici. Il pellet rappresenta le cellule dallo spazio broncoalveolare. </li><li> Se i globuli rossi (RBC) sono evidenti nel pellet di cellule in base al colore, lisare con 1 ml di tampone di lisi ACK per 1 min seguita da aggiunta di 5 ml di PBS 1x per arrestare la reazione di lisi e diluire il buffer. Trattare tutti i campioni in modo identico, sia trattato o meno con tampone di lisi ACK. </li><li> celle Spin a 1.200 xg per 5 minuti, decantare il surnatante, e portare le cellule in 1 ml di PBS 1x. </li><li> cellule Vortex e contare su un emocitometro per il conteggio delle cellule totali di spazio aereo. </li><li> Sulla base di densità delle cellule aggiungere circa 80-150 ml (~ 80 ml per un mouse infetto e ~ 150 per un mouse ingenuo) per una camera di scorrimento su una centrifuga cytospin. cell Spins su vetrini da microscopio per la successiva colorazione per determinare le popolazioni differenziali delle cellule. </li><li> Consentono alle cellule per asciugare su vetrini durante la notte. Cellule macchia con tri-macchia (ad esempio, Hema 3 [vedi tabella]) immergendo le diapositive 7 volte in fissativo, 9 volte in macchia 1, e 7 volte in macchia 2 (senza risciacqui tra macchie), e lasciare asciugare. Dopo macchia si è asciugata, scivoli coprioggetto e manualmente contano differenziali di microscopio. In generale, neutrofili e monociti / macrofagi sono facilmente distinguibili per le loro dimensioni e la morfologia nucleare. </li></ol> 4. Determinazione della carica batterica nel polmone e periferiche tessuti <ol><li> Prima di iniziare: Preparare le provette di diluizione con 900 ml di PBS 1x per polmone e della milza e 90 ml di PBS 1x per il sangue. targhette di identificazione per la coltura di batteri e fissati a temperatura ambiente; di conseguenza, il tempo una volta che il tessuto è stato raccolto sarà ridotto al minimo tra omogeneizzazione e placcatura per la crescita batterica. Nota: A causa della Deposi eterogeneazione di batteri nei polmoni che possono verificarsi con l&#39;aspirazione, si raccomanda che i singoli topi utilizzati per l&#39;analisi di una cellularità vie aeree totale o totale carica batterica (bilaterale) polmone. </li><li> Euthanize il mouse come per passo 3.1 e successivamente raccogliere il sangue dal ventricolo sinistro, mettendo in una provetta eparinizzata per evitare la coagulazione. Rimuovere tutti i lobi polmonari e posto in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di PBS 1x, seguita dalla rimozione della milza e il posizionamento in 2 ml di PBS 1x. Mettere i tubi in ghiaccio. Fare attenzione a pulire gli strumenti con etanolo tra ciascun tessuto / mouse. </li><li> Omogeneizzare il tessuto sul ghiaccio, preferibilmente con omogeneizzatori usa e getta che possono essere modificate tra ogni campione. punte omogeneizzatore monouso possono essere sterilizzati in autoclave per il riutilizzo tra esperimenti. </li><li> Una volta che il tessuto è stato omogeneizzato, eseguire diluizioni seriali e piatto. campioni piastra di un tessuto data / diluizione in duplice copia su un&#39;unica piastra TSA tracciando una linea di demarcazione sulla plastica. Placcatura e disuggerimenti Lution sono riportati di seguito (in tutti i casi, 10 ml di campione si sviluppa sulla piastra) e si basano su un post-infezione necroscopia 24 hr. Se l&#39;analisi dei campioni 48-72 hr, un maggior numero di diluizioni può avere bisogno di essere placcato a causa di aumento della carica batterica in momenti successivi. <ol><li> Per Sangue - diluire 1:10 aggiungendo 10 ml di sangue in 90 ml di sterile PBS 1x. Piatto pulito e 1:10 campioni diluiti in duplicato. Una volta che il sangue è stato placcato, girare sangue residuo a 9.300 xg per 10 min per estrarre plasma per la misurazione delle citochine e chemochine. </li><li> Per Lung - diluire 1:10 - 1: 100 aggiungendo 100 ml di polmone omogeneizzato in 900 ml di sterile PBS 1x serialmente. Piastra omogeneizzato pulito e tutte le diluizioni in duplicato. </li><li> Per Milza - diluire 1: 10-1: 100 con l&#39;aggiunta di 100 ml di milza omogeneizzato in 900 ml di sterile PBS 1x seriale. Piastra omogeneizzato pulito e ambedue le diluizioni in duplicato. </li></ol></li><li> Lasciare che i campioni diffusione ad asciugare brevemente. </li&gt; <li> Capovolgere le piastre TSA e posto in una statica a 37 ° C incubatore per una notte. </li><li> Determinare il numero di batteri colonizzano mediando le colonie batteriche da entrambi i lati della piastra e da ciascuna diluizione. Fattore nelle diluizioni iniziali di 5 ml per polmone e 2 ml per milza per determinare CFU tessuto totali. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Modelli murini di polmonite batterica, collaborato con gene targeting e negli interventi biologiche e farmacologiche in vivo, hanno fornito spunti critici nella risposta difesa ospite polmonare. Grandi progressi sono stati fatti, in particolare, nella nostra comprensione delle chemochine e molecole di adesione che regolano il reclutamento dei neutrofili allo spazio aereo infetto 10,11. Modelli in vivo di polmonite, a differenza di approcci basati su celle o alternativi, hanno anche ...

Polmonite acquisita in comunità rimane la principale causa di morte per infezioni negli Stati Uniti, con poca variazione complessiva dei tassi di mortalità nel corso degli ultimi 40 anni, nonostante i miglioramenti nella vaccinazione e le strategie di antibiotici 1,2. Nonostante la mancanza di progressi sensibili a livello della salute pubblica, in anni recenti progressi drammatici sono stati fatti nella comprensione della patogenesi molecolare e cellulare di polmonite, con molti di questi passi avanti reso possibile dall&#39;utilizzo di modelli murini di infezione polmonare. La trattabilità genetica del topo, la somiglianza del murino e sistema immunitario umano, e la vasta gamma di reagenti immunologici murini mirati che si sono resi disponibili in commercio hanno facilitato insieme rapido progresso del campo. modelli murini di polmonite batterica descritti in letteratura sono generalmente invocato uno dei quattro percorsi tecnici per l&#39;inoculazione dei patogeni: i) aerosol; ii) intrconsegna Anasal; iii) la consegna per via orale; e iv) iniezione intratracheale chirurgica (cioè, tracheotomia) 3. Tutte le vie di infezione presentano vantaggi e svantaggi 3. In particolare, l&#39;esposizione relativa delle vie aeree superiori, possibilità di mescolanza di flora oronasali, i requisiti per l&#39;anestesia generale, la variabilità della inoculo consegnato al polmone distale, la distribuzione lobare dei patogeni consegnati, i requisiti di perizia tecnica, e la morbilità procedurali variano ampiamente tra questi approcci. Comunemente tecniche di infezione orale per utilizzati includono incannulamento endotracheale (translaringea) sia tramite un approccio &#39;blind&#39; (non visualizzato), o sotto la visualizzazione della laringe diretta 3-5. Entrambi i metodi, mentre robusti, richiedono una formazione sostanziale e portano anche il rischio di traumi per le vie aeree superiori. Nella presente relazione, si descrive un metodo tecnicamente non intensivo, non invasivo, economico, e la rapida delle infezioni per via orale, wdichiara batteri Klebsiella pneumoniae (nell&#39;esempio fornito) pipettati in orofaringe di un mouse anestetizzato vengono consegnati ai polmoni tramite aspirazione (vale a dire, per inalazione). Noi e altri abbiamo utilizzato la tecnica polmonite ab ingestis successo 6-9. Questo metodo polmone recapito versatile e di facile apprendimento può essere esteso alla consegna di molti agenti non corrosivi aggiuntivi ai polmoni, quali citochine e altre proteine, molecole associati ai patogeni (ad esempio, lipopolisaccaride), cellule (cioè, trasferimento adottivo), e le tossine (ad esempio, bleomicina). Oltre a discutere importanti considerazioni tecniche, abbiamo anche descriviamo un approccio integrato, quantitativa per valutare la successiva risposta dell&#39;ospite alla polmonite, compresa la misurazione a valle della clearance batterica (ad esempio, unità formanti colonia [CFU] quantificazione negli organi polmone e periferici) e dei leucociti accumulo nello spazio aereo.

<table><tbody><tr><td>Klebsiella pneumoniae, sierotipo 2</td><td>ATCC</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di soia triptico</td><td>Cateteri Becton Dickenson</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Excel Safelet IV, 18 G x 1 1/4"</td><td>Claflin Medical Equipment</td><td>MEDC-031122</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Soluzione 1</td><td>Fisher</td><td>23-122-937</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Soluzione 2</td><td>Fisher</td><td>23-122-952</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 Fissativo</td><td>Fisher</td><td>23-122-929</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; siringhe per tubercolina Fisher</td><td></td><td>14-826-87</td><td></td></tr><tr><td>Collettori al plasma di litio eparina Fisher</td><td></td><td>2675187</td><td></td></tr><tr><td>spalmatori monouso a forma di L</td><td>Lab Scientific</td><td>DSC</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, pH 7.4</td><td>preparato internamente</td><td>n/a</td><td>Acqua distillata (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5,75 g), KH2PO4 (1 g)&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Tampone di lisi ACK</td><td>preparato internamente</td><td>n/a</td><td>NH4Cl (4,145 g), KHCO3 (0,5 g), EDTA (18,6 mg), portare fino a 500 ml con acqua distillata e pH a 7,4</td></tr></tbody></table>

un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l&#39;induzione e fenotipizzazione sperimentale polmonite batterica nei topi

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Anche se polmonite acquisita in comunità rimane un importante problema di salute pubblica, modelli murini di polmonite batterica hanno recentemente facilitato significativi progressi preclinici nella nostra comprensione della patogenesi cellulare e molecolare di base. In vivo modelli murini catturare la fisiologia integrata e la resilienza della risposta di difesa ospitante un modo non rivela, ex vivo approcci semplificati alternativi. Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per l&#39;inoculazione intrapolmonare di batteri nei topi, compresi aerosolizzazione, consegna intranasale, perorale cannulazione endotracheale in condizioni &#39;ciechi&#39; e visualizzate, e transcutanea cannulazione endotracheale. Tutti i metodi hanno meriti relativi e limitazioni. Qui, descriviamo in dettaglio un metodo non invasivo, tecnicamente non intensivo, poco costoso, e rapido per la consegna intratracheale di batteri che coinvolge l&#39;aspirazione (cioè, inalazione) per il mousedi un inoculo infettiva pipettati in orofaringe, mentre in anestesia generale. Questo metodo può essere utilizzato per la consegna polmonare di un&#39;ampia varietà di agenti biologici e chimici non corrosivi, ed è relativamente facile da imparare, anche per laboratori con minima esperienza precedente con procedure polmonari. Oltre a descrivere il metodo di polmonite ab ingestis, forniamo anche procedure passo-passo per saggiare la successiva in vivo polmonare risposta immunitaria innata del mouse, in particolare, i metodi per quantificare la clearance batterica e la risposta immunitaria cellulare delle vie aeree infetto. Questo approccio integrato e semplice valutazione polmonite consente di valutazione rapida e robusta dell&#39;effetto delle manipolazioni genetiche e ambientali upon polmonare immunità innata.

C57BL / 6 topi sono stati infettati con 2.000 UFC di K. pneumoniae 43816 (sierotipo 2) tramite aspirazione orofaringea nei polmoni. A questa dose, i topi di solito iniziano a mostrare sintomi clinici dopo l&#39;infezione 12-24 ore tra cui letargia, pelliccia arruffata, e perdita di peso del 5-10% (Figura 2A). All&#39;interno di post-infezione 48-72 ore, molti dei topi mostrano sintomi della malattia e morbilità che in genere viene preceduto da una media di perdi...

Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per modellare la polmonite batterica nei topi. Qui, descriviamo un non invasivo, economico, rapido metodo per indurre la polmonite tramite aspirazione (vale a dire, l&#39;inalazione) di un inoculo batterico pipettati in orofaringe. metodi di valle per la valutazione della risposta immunitaria innata polmonare sono anche dettagliata.

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l&#39;induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è fornire una procedura non invasiva e tecnicamente semplice per indurre polmonite batterica nei topi e per la successiva quantificazione della risposta difensiva dell'ospite in vivo nei polmoni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi delle malattie infettive e dell'immunologia, riguardo ai geni e ai percorsi molecolari che controllano la risposta dell'ospite all'infezione. Il principale vantaggio di questo metodo di infezione polmonare è la sua semplicità tecnica.Il che consente anche ai laboratori con poca esperienza nelle procedure polmonari di studiare la risposta immunitaria innata polmonare. In un impianto di sicurezza biologica di livello due, scongelare una scorta glicerolata di K.pneumoniae e trasferire un millilitro dei batteri in un matraccio da coltura di 500 millilitri contenente 50 millilitri di Brodo Tryptic Soy. Incubare la coltura sospesa tutta la notte a 37 gradi Celsius e da 200 a 225 giri al minuto.La mattina seguente, diluire da uno a cinque millilitri della coltura batterica in un nuovo flacone contenente 50 millilitri di Brodo Tryptic Soy, e incubare la coltura, nel termoagitatatore, a 37 gradi Celsius per ulteriori 2,5 ore per raggiungere la fase logaritmica. Al termine della seconda incubazione, trasferire un millilitro di batteri dalla seconda coltura in una provetta da 1,5 millilitri per la centrifugazione. Rimuovere il soprannatante senza disturbare il pellet e risospendere delicatamente i batteri in un millilitro di soluzione salina sterile per tre lavaggi separati.Dopo il terzo lavaggio, risospendere i batteri in un altro millilitro di soluzione salina sterile e preparare diluizioni seriali in scala logaritmica dell'inoculo. Misurare un millilitro delle diluizioni 1:10 e 1:100 in cuvette monouso, in duplicato, per determinare l'OD600 di K. pneumoniae lavato. Un OD600 di 1,0 corrisponde approssimativamente a quattro-sette volte 10 alla ottava UFC per millilitro.Dopo aver calcolato la concentrazione dei batteri in ciascuna diluizione, risospendere il dosaggio desiderato di UFC in 50-60 microlitri di soluzione salina sterile per ogni animale ricevente di età compresa tra otto e dodici settimane. Per somministrare i batteri agli animali, aspirare l'inoculo nel dosatore usando una punta per pipetta P200 e posizionare il topo anestetizzato in posizione supina semi-recumbente, sospeso per gli incisivi mascellari tramite un elastico fissato ai perni di una lastra di Plexiglas inclinata. Utilizzando una coppia di pinzette smussate e senza scanalature, tirare delicatamente la lingua di lato e depositare l'inoculo nella cavità orale dell'animale, avendo cura di evitare traumi alla lingua o alla faringe orale.Mantenendo la lingua retratta, occludere delicatamente il naso con un dito guantato, finché l'animale non inspira due o tre volte. Quando non si vede liquido nella cavità orale, trasferire il topo dal piano di inoculazione alla sua gabbia, in posizione supina, per evitare l'occlusione delle narici mentre l'animale si riprende. Eseguire un taglio longitudinale appena al di sotto dello sterno.Quindi, sollevare lo sterno con una pinzetta, fare un'incisione nel diaframma, permettendo ai polmoni di ritornare nella cavità toracica. Continuare l'incisione lungo la cavità toracica su entrambi i lati della vascolarizzazione e proseguire lungo il collo. Quando la trachea è visibile, tagliare con attenzione al centro del collo e spostare i tessuti ai lati per evitare di danneggiare la vascolarizzazione circostante.Ora effettuare una piccola incisione nella trachea a circa un quarto della distanza dalla testa e inserire caudalmente una cannula collegata a una siringa da un millilitro, pre-riempita con un millilitro di PBS, all'interno della trachea. Iniettare lentamente il volume nei polmoni, permettendo a tutti i lobi di gonfiarsi completamente. Successivamente, aspirare nuovamente il liquido con la siringa e raccogliere i lavaggi in un tubo da 15 millilitri, mantenendolo sul ghiaccio.Al termine sperimentale appropriato, prelevare il sangue dal ventricolo sinistro e trasferirlo in un tubo eparinizzato per evitare la coagulazione. Successivamente, raccogliere tutti i lobi polmonari in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di PBS e la milza in un tubo da 15 millilitri contenente due millilitri di PBS. Quindi, utilizzare omogenizzatori monouso individuali per ogni campione per macerare i tessuti sul ghiaccio, seguiti da diluizioni seriali delle sospensioni tissutali.Piastri le diluizioni, in duplicato, su lati separati di una singola piastra TSA e lascia asciugare brevemente i campioni. Quindi capovolgi le piastre e coltiva i campioni in un incubatore statico a 37 gradi Celsius per tutta la notte, calcolando la media delle colonie batteriche da entrambi i lati della piastra e da ciascuna diluizione la mattina successiva. A 2000 UFC di K.pneumoniae, i topi iniziano tipicamente a mostrare sintomi clinici da 12 a 24 ore dopo l'infezione.Entro 48 e 72 ore, molti animali sviluppano sintomi di malattia e morbosità, tipicamente preceduti da una perdita di peso media del 20 percento. Tuttavia, una dose LD50 consente di rilevare sia un aumento sia una diminuzione relativi della sopravvivenza all'interno del gruppo sperimentale ed è preferibile per studi a lungo termine. L'infezione del tratto respiratorio inferiore da K. pneumoniae è caratterizzata da un intenso afflusso di leucociti nelle vie aeree entro sei ore dall'infezione, che raggiunge il picco a 24 ore ed è rappresentato principalmente da neutrofili.Le citochine sono rilevabili nel liquido di lavaggio broncoalveolare a 24 e 48 ore dall'infezione con K.pneumoniae, fornendo informazioni sul microambiente polmonare e sul suo reclutamento immunitario in risposta all'invasione batterica. Il carico batterico nel polmone, nel sangue e nella milza aumenta inoltre in modo significativo tra 24 e 48 ore dall'infezione. Una volta padroneggiato, il metodo di aspirazione orofaringea per l'infezione polmonare può essere eseguito in soli uno o due minuti per topo, se effettuato correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di non utilizzare un volume eccessivo di aspirazione. Un volume compreso tra 50 e 60 microlitri di solito funziona bene per un topo di età compresa tra 8 e 12 settimane. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti diversi metodi sui tessuti polmonari e periferici per consentire la quantificazione della risposta immunitaria nella rimozione del patogeno.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre una polmonite batterica sperimentale mediante somministrazione orofaringea di patogeni e di come determinare il carico di patogeni nei topi. Non dimenticare che lavorare con microrganismi può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è sempre necessario adottare le normali precauzioni e pratiche del livello di sicurezza biologica BSL-2.

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Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

Fonte: Madenspacher, J. H. e Fessler, M. B. Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensivo per l'induzione e la fenotipizzazione della polmonite batterica sperimentale nei topi. J. Vis. Esp. (2016)Questo video mostra il processo di quantificazione del carico batterico nella milza di un topo infetto per valutare la gravità dell'infezione. La milza omogeneizzata viene diluita serialmente e placcata per determinare il carico batterico totale. I dati risultanti forniscono indicazioni sulle...

Valutazione della carica batterica nella milza del topo per studi di infezione

Questo video dimostra l'instaurazione di un'infezione polmonare in un modello di roditore immunocompetente tramite intubazione e installazione di sospensioni batteriche nei lobi polmonari. Questo modello consente studi di efficacia antibatterica in animali immunocompetenti.

Instillazione intrabronchiale di Streptococcus pneumoniae in modelli di roditori immunocompetenti

Streptococcus pneumoniae è il patogeno principale che causa una grave polmonite acquisita in comunità e responsabile per oltre 2 milioni di decessi in tutto il mondo. L'impatto dei fattori batterici implicati in palestra o virulenza può essere monitorato in tempo reale in un mouse polmonite o batteriemia modello acuta con batteri bioluminescenti.

A seguito in tempo reale l&#39;impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

La risposta immunitaria dell'ospite all'infezione patogeno è un processo strettamente regolata. Utilizzando un polmone modello di esposizione lipopolisaccaride nei topi, è possibile effettuare valutazioni ad alta risoluzione dei complessi meccanismi associati alla patogenesi della malattia.

L&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

Dimostriamo la procedura per l'inoculazione intra-tracheale di Haemophilus influenzae nel tratto respiratorio inferiore dei topi. Questo è uno strumento molto utile per studiare le vie di segnalazione che regolano l'infiammazione delle vie aeree nei modelli murini.

Intra-tracheale Amministrazione<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Viene descritto un metodo per stabilire infezioni polmonari in roditori immunocompetenti. Con competenza, questo metodo può essere eseguito rapidamente e facilmente per indurre un'infezione stabile con molti isolati di S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae e A. baumannii.

Una polmonite Modello robusto in immunocompetenti roditori per valutare antibatterico efficacia contro<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; A. baumannii</em

Polmonite infettiva è tra le più comuni infezioni nell'uomo. Un modello appropriato in vivo è fondamentale per comprendere la patogenesi della malattia e dell'efficacia di nuove terapie. Con questo modello di polmonite di aspirazione orofaringea murino, si può esaminare la patogenesi ed i nuovi trattamenti contro queste infezioni mortali.

Modello murino aspirazione orofaringea di polmonite batterica associata a ventilazione e acquisite in ospedale

Qui presentiamo un elegante protocollo per la valutazione in vivo di vaccino efficacia e host le risposte immunitarie. Questo protocollo può essere adattato per i modelli di vaccino che studiano virale, batterica o parassitari patogeni.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Qui, presentiamo metodi per migliorare gli studi secondari sulla polmonite batterica fornendo un percorso non invasivo di instillazione nel tratto respiratorio inferiore seguito dal recupero di patogeni e dall'analisi della trascrizione. Queste procedure sono riproducibili e possono essere eseguite senza apparecchiature specializzate come cannula, cavi guida o cavi in fibra ottica.

Un sistema preciso di distribuzione e recupero di patogeni per i modelli Murine di polmonite batterica secondaria

Questo manoscritto descrive la creazione di un modello infettivo di polmonite nei topi e la rispettiva caratterizzazione della risoluzione delle lesioni insieme ai metodi per la crescita dei batteri e l'instillazione intratracheale. Viene inoltre descritto un nuovo approccio che utilizza la citometria a flusso ad alta dimensione per valutare il panorama immunitario.

Modello sperimentale per valutare la risoluzione della polmonite

Scopri un metodo non invasivo per indurre polmonite batterica nei topi mediante aspirazione orofaringea di K. pneumoniae. Questa tecnica semplice permette di quantificare la risposta immunitaria polmonare innata anche in laboratori con limitata esperienza.

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l'induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

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