Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l'induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è fornire una procedura non invasiva e tecnicamente semplice per indurre polmonite batterica nei topi e per la successiva quantificazione della risposta difensiva dell'ospite in vivo nei polmoni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi delle malattie infettive e dell'immunologia, riguardo ai geni e ai percorsi molecolari che controllano la risposta dell'ospite all'infezione. Il principale vantaggio di questo metodo di infezione polmonare è la sua semplicità tecnica.

Il che consente anche ai laboratori con poca esperienza nelle procedure polmonari di studiare la risposta immunitaria innata polmonare. In un impianto di sicurezza biologica di livello due, scongelare una scorta glicerolata di K.pneumoniae e trasferire un millilitro dei batteri in un matraccio da coltura di 500 millilitri contenente 50 millilitri di Brodo Tryptic Soy. Incubare la coltura sospesa tutta la notte a 37 gradi Celsius e da 200 a 225 giri al minuto.

La mattina seguente, diluire da uno a cinque millilitri della coltura batterica in un nuovo flacone contenente 50 millilitri di Brodo Tryptic Soy, e incubare la coltura, nel termoagitatatore, a 37 gradi Celsius per ulteriori 2,5 ore per raggiungere la fase logaritmica. Al termine della seconda incubazione, trasferire un millilitro di batteri dalla seconda coltura in una provetta da 1,5 millilitri per la centrifugazione. Rimuovere il soprannatante senza disturbare il pellet e risospendere delicatamente i batteri in un millilitro di soluzione salina sterile per tre lavaggi separati.

Dopo il terzo lavaggio, risospendere i batteri in un altro millilitro di soluzione salina sterile e preparare diluizioni seriali in scala logaritmica dell'inoculo. Misurare un millilitro delle diluizioni 1:10 e 1:100 in cuvette monouso, in duplicato, per determinare l'OD600 di K. pneumoniae lavato. Un OD600 di 1,0 corrisponde approssimativamente a quattro-sette volte 10 alla ottava UFC per millilitro.

Dopo aver calcolato la concentrazione dei batteri in ciascuna diluizione, risospendere il dosaggio desiderato di UFC in 50-60 microlitri di soluzione salina sterile per ogni animale ricevente di età compresa tra otto e dodici settimane. Per somministrare i batteri agli animali, aspirare l'inoculo nel dosatore usando una punta per pipetta P200 e posizionare il topo anestetizzato in posizione supina semi-recumbente, sospeso per gli incisivi mascellari tramite un elastico fissato ai perni di una lastra di Plexiglas inclinata. Utilizzando una coppia di pinzette smussate e senza scanalature, tirare delicatamente la lingua di lato e depositare l'inoculo nella cavità orale dell'animale, avendo cura di evitare traumi alla lingua o alla faringe orale.

Mantenendo la lingua retratta, occludere delicatamente il naso con un dito guantato, finché l'animale non inspira due o tre volte. Quando non si vede liquido nella cavità orale, trasferire il topo dal piano di inoculazione alla sua gabbia, in posizione supina, per evitare l'occlusione delle narici mentre l'animale si riprende. Eseguire un taglio longitudinale appena al di sotto dello sterno.

Quindi, sollevare lo sterno con una pinzetta, fare un'incisione nel diaframma, permettendo ai polmoni di ritornare nella cavità toracica. Continuare l'incisione lungo la cavità toracica su entrambi i lati della vascolarizzazione e proseguire lungo il collo. Quando la trachea è visibile, tagliare con attenzione al centro del collo e spostare i tessuti ai lati per evitare di danneggiare la vascolarizzazione circostante.

Ora effettuare una piccola incisione nella trachea a circa un quarto della distanza dalla testa e inserire caudalmente una cannula collegata a una siringa da un millilitro, pre-riempita con un millilitro di PBS, all'interno della trachea. Iniettare lentamente il volume nei polmoni, permettendo a tutti i lobi di gonfiarsi completamente. Successivamente, aspirare nuovamente il liquido con la siringa e raccogliere i lavaggi in un tubo da 15 millilitri, mantenendolo sul ghiaccio.

Al termine sperimentale appropriato, prelevare il sangue dal ventricolo sinistro e trasferirlo in un tubo eparinizzato per evitare la coagulazione. Successivamente, raccogliere tutti i lobi polmonari in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di PBS e la milza in un tubo da 15 millilitri contenente due millilitri di PBS. Quindi, utilizzare omogenizzatori monouso individuali per ogni campione per macerare i tessuti sul ghiaccio, seguiti da diluizioni seriali delle sospensioni tissutali.

Piastri le diluizioni, in duplicato, su lati separati di una singola piastra TSA e lascia asciugare brevemente i campioni. Quindi capovolgi le piastre e coltiva i campioni in un incubatore statico a 37 gradi Celsius per tutta la notte, calcolando la media delle colonie batteriche da entrambi i lati della piastra e da ciascuna diluizione la mattina successiva. A 2000 UFC di K.pneumoniae, i topi iniziano tipicamente a mostrare sintomi clinici da 12 a 24 ore dopo l'infezione.

Entro 48 e 72 ore, molti animali sviluppano sintomi di malattia e morbosità, tipicamente preceduti da una perdita di peso media del 20 percento. Tuttavia, una dose LD50 consente di rilevare sia un aumento sia una diminuzione relativi della sopravvivenza all'interno del gruppo sperimentale ed è preferibile per studi a lungo termine. L'infezione del tratto respiratorio inferiore da K. pneumoniae è caratterizzata da un intenso afflusso di leucociti nelle vie aeree entro sei ore dall'infezione, che raggiunge il picco a 24 ore ed è rappresentato principalmente da neutrofili.

Le citochine sono rilevabili nel liquido di lavaggio broncoalveolare a 24 e 48 ore dall'infezione con K.pneumoniae, fornendo informazioni sul microambiente polmonare e sul suo reclutamento immunitario in risposta all'invasione batterica. Il carico batterico nel polmone, nel sangue e nella milza aumenta inoltre in modo significativo tra 24 e 48 ore dall'infezione. Una volta padroneggiato, il metodo di aspirazione orofaringea per l'infezione polmonare può essere eseguito in soli uno o due minuti per topo, se effettuato correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di non utilizzare un volume eccessivo di aspirazione. Un volume compreso tra 50 e 60 microlitri di solito funziona bene per un topo di età compresa tra 8 e 12 settimane. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti diversi metodi sui tessuti polmonari e periferici per consentire la quantificazione della risposta immunitaria nella rimozione del patogeno.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre una polmonite batterica sperimentale mediante somministrazione orofaringea di patogeni e di come determinare il carico di patogeni nei topi. Non dimenticare che lavorare con microrganismi può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è sempre necessario adottare le normali precauzioni e pratiche del livello di sicurezza biologica BSL-2.