Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l'induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è quello di fornire una procedura non invasiva e tecnicamente non intensiva per indurre la polmonite batterica nei topi e la successiva quantificazione della risposta di difesa dell'ospite in vivo nei polmoni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie infettive e dell'immunologia, sui geni e sui percorsi molecolari che controllano la risposta dell'ospite all'infezione. Il vantaggio principale di questo metodo di infezione polmonare è la sua semplicità tecnica.

Il che consente anche ai laboratori con poca esperienza nelle procedure polmonari di studiare la risposta immunitaria innata polmonare. In una struttura di livello due di biosicurezza, scongelare una scorta di glicerolo di K. pneumoniae e trasferire un millilitro di batteri in un pallone di coltura da 500 millilitri contenente 50 millilitri di brodo di soia triptica. Incubare la coltura delle sospensioni durante la notte a 37 gradi Celsius e da 200 a 225 giri/min.

La mattina successiva, diluire da uno a cinque millilitri di coltura batterica in un nuovo pallone contenente 50 millilitri di brodo di soia triptico e incubare la coltura, nell'agitatore, a 37 gradi Celsius per altre 2,5 ore per ottenere la fase logaritmica. Al termine della seconda incubazione, trasferire un millilitro di batteri dalla seconda coltura in una provetta da 1,5 millilitri per la centrifugazione. Rimuovere il surnatante senza disturbare la tavolozza e risospendere delicatamente i batteri in un millilitro di soluzione fisiologica sterile per tre lavaggi separati.

Dopo il terzo lavaggio, risospendere i batteri in un altro millilitro di soluzione fisiologica sterile e impostare diluizioni seriali log-wise dell'inoculo. Misurare un millilitro di diluizioni da uno a 10 e da uno a 100 in cuvette monouso, in duplicato, per determinare l'OD600 del K.pneumoniae lavato. Un OD600 di 1,0 equivale all'incirca a quattro-sette volte 10 all'ottavo CFU per millilitro.

Dopo aver calcolato la concentrazione dei batteri in ciascuna diluizione, risospendere la dose di CFU dell'inoculo desiderata in 50-60 microlitri di soluzione fisiologica sterile per animale ricevente di età compresa tra otto e 12 settimane. Per somministrare i batteri agli animali, aspirare l'inoculo dosatore in un puntale di pipetta P200 e posizionare il topo anestetizzato in posizione supina semi-sdraiata, sospeso dagli incisivi mascellari, da un elastico teso tra i pioli di una tavola di plexiglas inclinata. Utilizzando un paio di pinze smussate e non increspate, tirare delicatamente la lingua di lato e depositare la dose nella cavità orale dell'animale, facendo attenzione a non indurre traumi alla lingua o alla faringe orale.

Mantenendo la lingua retratta, occludi delicatamente il naso con un dito guantato, fino a quando la casa inspira due o tre volte. Quando non è visibile alcun liquido nella cavità orale, trasferire il topo dalla tavola di inoculazione alla sua gabbia, in posizione supina, per evitare l'ostruzione delle narici mentre il topo si sta riprendendo. Fai un taglio longitudinale appena sotto lo sterno.

Quindi, sollevando lo sterno con una pinza, intacca il diaframma, permettendo al polmone di ricadere nella cavità toracica. Continuare l'incisione verso l'alto attraverso la cavità toracica su entrambi i lati del sistema vascolare e verso l'alto attraverso il collo. Quando la trachea è visibile, tagliare con cura il centro del collo e spingere il tessuto ai lati per evitare di danneggiare la vascolarizzazione circostante.

Ora intacca la trachea a circa un quarto della discesa dalla testa e inserisci caudalmente una cannula attaccata a una siringa da un millilitro precaricata con un millilitro di PBS nella trachea. Spingi il volume nei polmoni, lentamente, permettendo a tutti i lobi di gonfiarsi. Quindi estrarre nuovamente il volume con la siringa e raccogliere i lavaggi raccolti in un tubo da 15 millilitri, con ghiaccio.

Al punto finale sperimentale appropriato, raccogliere il sangue dal ventricolo sinistro e trasferirlo in un tubo eparinizzato per evitare la coagulazione. Quindi raccogliere tutti i lobi polmonari in una provetta da 15 millilitri contenente cinque millilitri di PBS e la milza in una provetta da 15 millilitri contenente due millilitri di PBS. Successivamente, utilizzare omogeneizzatori individuali e monouso per campione, per macerare i tessuti sul ghiaccio, seguito da una diluizione seriale dei fanghi tissutali.

Placcare le diluizioni, in duplicato, su lati separati di una singola piastra TSA e lasciare asciugare brevemente i campioni. Quindi capovolgere le piastre e coltivare i campioni in un incubatore statico a 37 gradi Celsius durante la notte, facendo la media delle colonie batteriche da entrambi i lati della piastra e da ogni diluizione la mattina successiva. A 2000 CFU di K. pneumoniae, i topi, in genere, iniziano a mostrare sintomi clinici da 12 a 24 ore dopo l'infezione.

Entro 48-72 ore, molti degli animali mostrano sintomi di malattia e morbilità che sono tipicamente preceduti da una perdita di peso media del 20%. Una dose di LD50, tuttavia, consente di rilevare sia la sopravvivenza relativamente aumentata che quella diminuita all'interno del gruppo sperimentale e può essere preferita per studi a lungo termine. L'infezione da K. pneumoniae del tratto respiratorio inferiore è caratterizzata da un robusto afflusso di leucociti nelle vie aeree entro sei ore dall'infezione, che raggiunge il picco entro 24 ore ed è rappresentato principalmente da neutrofili.

Le citochine sono rilevabili nel liquido di lavaggio broncoalveolare sia a 24 che a 48 ore dopo l'infezione da K. pneumoniae e forniscono informazioni sul microambiente polmonare e sul suo auto-reclutamento immunitario in risposta all'invasione batterica. Anche la carica batterica nei polmoni, nel sangue e nella milza aumenta drasticamente tra le 24 e le 48 ore dall'infezione. Una volta padroneggiato, il metodo di aspirazione orofaringea dell'infezione polmonare può essere eseguito in soli uno o due minuti per topo se eseguito correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non utilizzare un volume di aspirazione eccessivo. Un volume da 50 a 60 microlitri in genere funziona bene per un topo di 8-12 settimane. A seguito di questa procedura, è possibile eseguire una varietà di metodi sul polmone e sui tessuti periferici per consentire la quantificazione della risposta immunitaria nella rimozione dei patogeni.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come indurre la polmonite batterica sperimentale attraverso la somministrazione di patogeni orofaringei e di determinare il carico di patogeni nei topi. Non dimenticare che lavorare con i microbi può essere pericoloso e che le precauzioni e le pratiche di base BSL-2 dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.