Name: Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Scopri come creare idrogel sintonizzabili da matrice extracellulare polmonare per colture cellulari 3D. Questo metodo utilizza decellularizzazione di tessuto polmonare suino per studiare l'interazione cellulare con l'ECM.

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Vorremmo ringraziare le aziende agricole Smithfield per la donazione di tessuto polmonare suino intatto. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Hu Yang, il Dr. Christina Tang e Chirurgia Dipartimento di VCU plastica per averci permesso di utilizzare le loro attrezzature. campioni di idrogel e di tessuto sono stati preparati per SEM presso il Dipartimento VCU di Anatomia e Neurobiologia Microscopia strumento sostenuto, in parte, da un finanziamento NIH-NINDS nucleo centrale di Grant 5 P30 NS047463 e, in parte, dalla forma di finanziamento NIH-NCI Cancer Support Center di Grant P30 CA016059. l&#39;imaging SEM dei campioni presso il VCU Nanotecnologia Nucleo Caratterizzazione Facility (NCC). Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation, CMMI 1.351.162.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Soluzione </td><td> filtro sterile </td><td> Indicazioni </td></tr><tr><td> DIH 2 O </td><td> sì </td><td> DIH 2 O; sterile filtrato </td></tr><tr><td> 0,1% soluzione di Triton X-100 </td><td> sì </td><td> Sotto cappa aggiungere 100 ml Triton-X 100 Soluzione a 100 ml DIH 2 O e agitare fino alla dissoluzione; filtro sterile. </td></tr><tr><td> 2% Desossicolato Soluzione </td><td> sì </td><td> Sotto cappa aggiungere 2 g di sodio soluzione Desossicolato per 100 ml DIH 2 O e agitare fino alla dissoluzione; filtro sterile </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> sì </td><td> Aggiungere 58,44 g di NaCl a 1 L di DIH 2 O; agitare fino a scioglimento; filtro sterile </td></tr><tr><td> soluzione DNasi </td><td> sì </td><td> Aggiungere 12.000unità di DNasi a 1 L DIH 2 O; Aggiungere 0,156 g MgSO 4 (Anidro), e 0,222 g CaCl 2; agitare fino a scioglimento; filtro sterile </td></tr><tr><td> PBS </td><td> sì </td><td> Unire 27,2 g di Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (bibasico eptaidrato), 80 g di NaCl, e 2 g KCl con 10 L DIH 2 O; agitare fino a scioglimento; aggiustare il pH a 7,4; filtro sterile </td></tr></tbody></table> Tabella 1: soluzioni necessarie per Tissue Decellularization. Effettuare le soluzioni di cui sopra per il processo di decellularization. Conservare a 4 ° C. Circa 2,5 L sarà necessario per un polmone suino. 1. Formazione Hydrogel <ol><li> Suina Lung Decellularization (adattato da riferimenti 9,10) <ol><li> Ottenere un blocco normale polmone suino, da un macello, con il cuore e Vasculature intatto. </li><li> Utilizzare forbici di tessuto o un bisturi per sezionare il cuore, vasi più vicino possibile al cuore di taglio, la vascolarizzazione sarà utilizzato in fasi successive per perfusione. </li><li> sezionare cura di collocare il tessuto connettivo circostante la trachea, bronchi e vasi con un bisturi o forbici. NOTA: determinare le migliori polmone da utilizzare per il resto della procedura con la scelta di un polmone, senza grandi tagli o punture attraverso la pleura e grandi quantità di atelettasia o occlusione vascolare che possono ostacolare l&#39;efficacia del processo di decellularization. </li><li> Tagliare il polmone non ottimale lasciando tanto bronchi attaccati alla trachea possibile (cuore, tessuto connettivo e i lobi del polmone rimosso può essere smaltito). Ci dovrebbe essere un polmone rimanendo attaccata alla trachea e vascolare. NOTA: Conservare sezioni per istologia se lo si desidera. 9 </li><li> Chiudere bronchi scollegati con pinze o sutura per prevent riflusso eccesso. </li></ol><ol start="6"><li> Preparare le soluzioni decellularization e conservare in frigorifero a 4 ° C fino al momento (Tabella 1). </li><li> Utilizzando una pompa a mano cannulata per adattare l&#39;arteria polmonare, profumato il tessuto polmonare 3 volte con acqua deionizzata sia attraverso l&#39;arteria polmonare e la trachea. Profumato vascolarizzazione prima volta in volta. Iniziare con circa 1 L nel sistema vascolare e 1,5 L in trachea per ogni perfusione, ma come detriti cellulari viene rimosso più liquido può essere perfusi attraverso il sistema. </li><li> Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con Triton X-100 soluzione. </li><li> Immergere tessuto polmonare in Triton X-100 soluzione per 24 ore a 4 ° C. </li><li> Perfuse vascolare e trachea 3 volte con acqua deionizzata per sciacquare. </li><li> Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con la soluzione desossicolato. </li><li> Immergere le sezioni di tessuto in desossicolato per 24 ore a 4 ° C. </li><li> Perfuse vascolare e trachea 3 volte con acqua deionizzata per sciacquare. </li><li>Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con soluzione di NaCl. </li><li> Immergere il tessuto in soluzione NaCl filtrata per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Perfuse vascolare e trachea 3 volte con acqua deionizzata per sciacquare. </li><li> Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con una soluzione di DNasi. </li><li> Immergere il tessuto in soluzione DNasi filtrata per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Profumato sia vascolare e la trachea 5 volte con PBS. </li><li> Sezionare via tessuto cartilagineo evidente, trachea e tutto tubuli 2 mm o più di diametro (che si trova principalmente attorno l&#39;ilo e porzioni mediali dei polmoni) di condurre le vie aeree, lasciando solo le zone respiratorie (soprattutto le aree periferiche). </li><li> Sezionare il tessuto in 1 sezioni pollici o più piccoli. Orientamento del tessuto non ha importanza per questo passo. </li><li> Eliminare il tessuto liquido in eccesso e in 50 ml provette coniche. Congelare il tessuto a -80 ° C. NOTA: Mantieni sezioni per l&#39;esame istologico per garantire la rimozione di cellule e debri cellulares, se desiderato. Usiamo H &amp; E, α-galattosidasi, PicoGreen, idrossiprolina, ninidrina, Alcian blu, SDS-PAGE, e spettrometria di massa per la caratterizzazione. 9 </li></ol></li><li> Lung Processing <ol><li> Rimuovere i coperchi da tubi congelati contenenti tessuto polmonare decellularized. </li><li> Mettere carta da filtro sopra l&#39;apertura del tubo e fissare con nastro di gomma. NOTA: Tube e contenuto deve ancora essere congelati comunque di trovarsi in -80 ° C fino congelati. </li><li> Lyophilize il tessuto fino a quando tutto il liquido in eccesso è andato, utilizzando un liofilizzatore secondo le istruzioni del produttore. Conservare a -80 ° C fino al momento di mulino. </li><li> Prima di iniziare aggiungere azoto liquido fresare freezer per raffreddare isolamento e componenti interni alle condizioni di lavoro. </li><li> Rimuovere la barra mulino magnetica dal tubo di mulino e aggiungere il tessuto per coprire fondo. </li><li> Sostituire bar mulino e aggiungere il tessuto poco compresso. La barra mulino deve ancora muoversi liberamente. </li><li> Chiudere la provetta mulino e PLAce nel mulino congelatore. </li><li> Riempire azoto liquido per la linea di riempimento massimo. </li><li> Mulino Congelatore tutto il tessuto in polvere fine (circa 5 minuti, il tasso di compressione pari a ~ 600 min -1), in un cilindro di policarbonato con un dispositivo di simulazione in acciaio inox così come tappi terminali in acciaio inox con il mulino congelatore secondo le istruzioni del produttore. Conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Micro-porosa formazione di gel (8 mg / ml) (adattato da riferimenti 9,11) <ol><li> Aggiungere 1% (w / v) di polvere decellularized e 0,1% (w / v) di pepsina per 0,01 M HCl, sotto costante agitazione (dovrebbe essere in grado di vedere il flusso a livello superiore del liquido), a temperatura ambiente, per 48 hr. NOTA: La polvere viene caricata staticamente, in modo da aggiungere il HCl dopo la polvere offre la possibilità di lavare l&#39;eccesso al largo delle pareti del tubo. </li><li> Dopo la digestione per 48 h, porre la soluzione e reagenti in ghiaccio per 5 min. </li><li> Utilizzando refrigerato 10% (v / v) 0,1 M NaOH, und 11.11% (v / v) 10x PBS (per portare l&#39;intera soluzione a 1x concentrazione), portare la soluzione proteica digerita a pH fisiologico di 7,4. NOTA: La soluzione può essere conservato a 4 ° C per una settimana. Eseguire la cinetica di gelificazione utilizzando reometria 9 se lo si desidera. </li></ol></li></ol> 2. Cross-collega idrogeli per migliorare la resistenza meccanica <ol><li> Soluzioni di 1%, 0,1% e 0,01% w / v soluzione genipina reticolazione sono state preparate sciogliendo la necessaria quantità di polvere genipina in 10% DMSO. </li><li> Agitare la soluzione ogni 15 min per 1 ora. </li><li> Aggiungere la soluzione genipina per coprire idrogel ECM (100 microlitri per ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti) che sono stati precedentemente assemblati in parte 1.3.4. </li><li> Lasciare ogni idrogel ECM per reticolare per 24 ore a 37 ° C. </li><li> Risciacquare l&#39;idrogel ECM 3 volte con PBS fino a quando la soluzione di lavaggio non è più blu. Gli idrogel reticolati saranno quindi pronto per l&#39;ulteriore caratterizzazione e cestudi su colture ll. </li></ol> 3. coltura cellulare con microporosa Gel <ol><li> Rivestimento bidimensionale <ol><li> Utilizzando la soluzione dalla 1.3.3, aggiungere 20 ml di soluzione pregel a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti non trattate. </li><li> durante la notte in frigorifero a 4 ° C per consentire la proteina adsorbimento al piatto. </li><li> Aspirare soluzione PreGel e risciacquare con PBS. </li><li> Cellule Passage 9. </li><li> Aggiungere 10.000 cellule / cm 2 per pozzi. </li><li> Aumentare la media per 100 pl per pozzetto e incubare a 37 ° C. </li></ol></li><li> Tre coltura cellulare dimensionale 9 <ol><li> Utilizzando la soluzione da 1.3.3, risospendere le cellule pellet ad una concentrazione di 1.000.000 cellule / ml di soluzione pregel. </li><li> erogare rapidamente 16 ml di sospensione PreGel cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, in modo da formare un idrogel di spessore ~ ​​500 micron per la coltura delle cellule 3D. </li><li> Incubare a 37 ° C per 30min per il gel per formare. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di media all&#39;inizio idrogel formati e incubare a 37 ° C. </li></ol></li><li> Tre coltura cellulare tridimensionale su gel di rigidità variabili <ol><li> Utilizzando la soluzione da 1.3.3, pipetta 100 ml di soluzione di PreGel in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. </li><li> Incubare a 37 ° C per 30 minuti per gel di forma. Nota: Cross-collega passi dalla parte 2 può essere usato qui. </li><li> Cellule Passage 9. </li><li> Aggiungere 10.000 cellule / cm 2 per pozzi. </li><li> Aumentare la media per 100 pl per pozzetto e incubare a 37 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+J+%22Three-Dimensional+Cell+Culture+Matrices%3A+State+of+the+Art%22">Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art</a>. 14, (2008).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaycock%2C+JW+%223D+Cell+Culture%22">3D Cell Culture</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Walker, J. M., Ed, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22Epithelial+cell+culture+protocols%22">Epithelial cell culture protocols</a>. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+as+a+biological+scaffold+material%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function.</a> Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+evaluation+of+gardenia+extract%2C+geniposide+and+genipin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin.</a> J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).</li>
<li>Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+Material+Properties+of+Cardiac+Matrix+Hydrogels+to+Induce+Endothelial+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).</li>
<li>Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+bone+regeneration+using+porcine+small+intestinal+submucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa.</a> J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).</li>
<li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Res.+J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPouliot%2C+RA+%22J.Biomed.Mater.Res.A%22">J.Biomed.Mater.Res.A</a>. , (2016).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).</li>
<li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).</li>
<li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PloS One. 5 (9), e12905(2010).</li>
<li>Ratner, B. D., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials%3A+where+we+have+been+and+where+we+are+going%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomaterials: where we have been and where we are going.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).</li>
<li>Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+initiation+and+growth+of+tumor+cell+lines%2C+cancer+stem+cells+and+biopsy+material+in+mice+using+basement+membrane+matrix+protein+%28Cultrex+or+Matrigel%29+co-injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).</li>
<li>Zhang, W. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstruction+of+lung+alveolus-like+structure+in+collagen-matrigel%2Fmicrocapsules+scaffolds+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+Normal+and+Fibrotic+Human+Lung+Matrices+as+a+Culture+System+for+In+Vitro+Investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).</li>
<li>Matsuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+human+lung+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for human lung stem cells.</a> N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).</li>
<li>Zuo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63%2BKrt5%2B+distal+airway+stem+cells+are+essential+for+lung+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration.</a> Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).</li>
<li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li>
<li>Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Uno degli aspetti integranti della biologia è l&#39;auto-organizzazione di molecole in strutture gerarchiche che svolgono un compito specifico. 13 Nel laboratorio, auto-assemblaggio dipende da numerosi fattori quali la concentrazione di sale, il pH e la durata digestione. Come si vede, un auto-organizzazione forme idrogel quando le proteine ​​solubilizzati torna a una temperatura fisiologica. L&#39;idrogel formatosi è in grado di promuovere l&#39;attaccamento cellulare e la proliferazione in vitro. <...

Tradurre i risultati in vitro in clinica è uno dei problemi più impegnativi che i ricercatori biomedici devono affrontare. La ricerca in vitro sulla plastica per colture tissutali è più facile, più conveniente e mantiene un'elevata vitalità cellulare. 1 Questo approccio è un punto di partenza ragionevole, ma i risultati hanno una traduzione clinica limitata. Sempre più spesso, i laboratori stanno incorporando costrutti tridimensionali per sostituire i tradizionali metodi bidimensionali. Sono disponibili revisioni per molti ambienti tridimensionali, dagli scaffold biologici agli scaffold polimerici. 2,3
Le strutture biologiche possono imitare le caratteristiche degli ambienti in vivo poiché contengono molte delle proteine e dei glicosaminoglicani componenti della matrice nativa e forniscono siti di legame familiari a cui le cellule possono attaccarsi e riconoscere. È stato dimostrato che i materiali derivati dalla matrice extracellulare (ECM) sono scaffold capaci per l'adesione e la proliferazione cellulare. 4 Una sfida che limita l'applicazione delle piattaforme di idrogel ECM deriva dalle loro proprietà meccaniche intrinsecamente deboli dopo la gelificazione. Il tessuto nativo ha spesso proprietà meccaniche che sono di grandezza superiore a quelle degli idrogel. Gli agenti reticolanti non tossici possono aumentare le proprietà meccaniche degli idrogel per imitare meglio l'ambiente tissutale nativo. La genipina è un reticolante naturale non tossico derivato dalle piante di Gardenia con la capacità di adattare da vicino le proprietà meccaniche della ECM con variazioni della concentrazione di genipina5,6. 
Quasi tutte le cellule del corpo esistono e si organizzano su ECM che producono o mantengono. La nuova attenzione all'importanza universale della MEC nell'organizzazione, nelle condizioni e nella funzione di ogni organo o sistema ha stimolato la produzione di piattaforme basate su matrici per l'indagine in vitro. La sottomucosa dell'intestino tenue suino è l'impalcatura di derivazione naturale più studiata ed è stata utilizzata per rigenerare tendini, legamenti, muscolo scheletrico4 e persino osso7. Anche le matrici di altri organi e specie di donatori hanno dimostrato un buon potenziale di rigenerazione tissutale. L'uso di componenti ECM estranei causa problemi minimi con l'immunomodulazione. Dopo l'eliminazione della materia cellulare ospite, la ECM rimanente sarà simile nel contenuto di aminoacidi e nell'organizzazione a tutte le altre specie di mammiferi8. C'è una crescente linea di pensiero secondo cui il modo migliore per esaminare le interazioni cellula-ECM in vitro è quello di utilizzare scaffold ECM specifici per organo. Ogni organo fornisce una composizione unica di proteine e proteoglicani per creare nicchie cellulari. Le nicchie forniscono la rottura strutturale, funzionale e persino enzimatica della matrice extracellulare contribuendo alla segnalazione biofisica. Per ottenere un microambiente in vitro più simile al microambiente in vivo, l'uso di ECM tessuto-specifici ottimizzerebbe le nicchie cellulari per la ricerca. 
L'obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo per stabilire un'impalcatura di idrogel unica per la ECM polmonare. Questo metodo fornisce una piattaforma per la ricerca in vitro sulle interazioni cellula polmonare-ECM.

<table><tbody><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Utilizzo in cappa aspirante con protezione per gli occhi e guanti.</td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100g</td><td>Utilizzare in cappuccio con protezione per gli occhi e guanti.</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500g</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-500g</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>DNasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td>Utilizzare con protezione per gli occhi e guanti.</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td>Utilizzare in cappa aspirante con protezione per gli occhi e guanti.</td></tr><tr><td>Idrossido di Sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td>Utilizzare con protezione per gli occhi e guanti.</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Wako Chemicals</td><td>078-03021</td><td>Utilizzare in cappa aspirante con protezione per gli occhi e guanti.</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Qualità Biologica</td><td>119-069-151</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-448</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pompa a mano</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-239-1</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Bicchiere graduato</td><td>VitLab</td><td>445941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cryomill</td><td>SPEX</td><td>6700</td><td>Utilizzare cryogloves e occhio protezione.</td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>FTS FlexiDry</td><td></td><td>Utilizzare i guanti.</td></tr><tr><td>Reometro</td><td>Discovery</td><td>HR-2</td><td>Utilizzare guanti e protezione per gli occhi.</td></tr></tbody></table>

sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3d

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Qui vi presentiamo un metodo per stabilire più idrogel di coltura cellulare di componenti per vitro coltura cellulare del polmone in. Cominciando con sano en bloc tessuto polmonare da suini, ratti, o il mouse, il tessuto è perfuso e immerso in successive detergenti chimici per rimuovere i detriti cellulari. Confronto istologica del tessuto prima e dopo l&#39;elaborazione conferma rimozione di oltre il 95% della doppia elica colorazione del DNA e alfa galattosidasi suggerisce la maggioranza dei detriti cellulari viene rimosso. Dopo decellularization, il tessuto è liofilizzata e quindi cryomilled in una polvere. La polvere matrice viene digerito per 48 ore in una soluzione di pepsina di digestione acida e quindi neutralizzato per formare la soluzione pregel. Gelificazione della soluzione pregel può essere indotta da incubazione a 37 ° C e può essere utilizzato immediatamente dopo neutralizzazione o conservato a 4 ° C per un massimo di due settimane. I rivestimenti possono essere formati usando la soluzione pregel su una lastra non trattata per cattaccamento ell. Le celle possono essere sospesi in pregel prima autoassemblaggio per ottenere una coltura 3D, placcato sulla superficie di un gel costituito da cui le cellule possono migrare attraverso il ponteggio, o placcato sui rivestimenti. Modifiche alla strategia presentati possono influenzare la temperatura di gelificazione, la forza, o taglie frammento di proteina. Al di là di formazione idrogel, la rigidità idrogel può essere aumentata mediante genipina.

Utilizzando questo metodo, abbiamo prodotto idrogel di maiale normale, ratto, e polmoni del mouse (Figura 1). polmoni trasformati forniscono una stima rispettivamente 5 mg, 40 mg e 10 g di polvere di ECM. Una panoramica del processo è mostrato nella figura 2. visualizzazioni chiave durante il processo sono: l&#39;aspetto bianco dei polmoni dopo il risciacquo desossicolato; dopo la formazione pregel, la soluzione deve essere opaco e la soluzione deve appa...

Questo è un metodo per creare un 3-dimensionale scaffold coltura cellulare dalla matrice extracellulare polmonare. polmone Intact è trasformato in idrogel in grado di sostenere la crescita delle cellule in tre dimensioni.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

L'obiettivo generale di questo metodo per la produzione di idrogeli personalizzati è lo studio delle cellule e delle condizioni di coltura che riproducono la complessità della matrice extracellulare polmonare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo pneumologico, come ad esempio in che modo le cellule polmonari interagiscono con la matrice extracellulare in condizioni fisiologiche e patologiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che gli idrogeli derivati dalla matrice extracellulare polmonare possono essere adattati all'applicazione desiderata in colture bidimensionali o tridimensionali.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà a causa della complessità delle tecniche di descellularizzazione, che a volte richiedono più persone e attenzione ai dettagli per ottimizzare la quantità di tessuto vitale. Per questo protocollo, avere un polmone suino pronto per la descellularizzazione. I dettagli sulla sua preparazione sono disponibili nel protocollo testuale.Una volta preparato il polmone, utilizzare una pompa manuale cannulata per adattarsi all'arteria polmonare. Per prima cosa, perfondere circa un litro di acqua nella vascolarizzazione, quindi 1,5 litri nella trachea. Ripetere questa procedura tre volte, aumentando progressivamente il volume di acqua perfusa man mano che vengono rimossi i detriti cellulari.Successivamente, perfondere il tessuto con Triton X-100, utilizzando anche in questo caso la pompa manuale. Poi, immergere il tessuto in un bagno di soluzione di Triton X-100 a quattro gradi Celsius per 24 ore. Dopo 24 ore, sciacquare la vascolarizzazione e la trachea tre volte con acqua distillata.Dopo i risciacqui, utilizzare la pompa manuale per perfondere il tessuto con deossicolato. Successivamente, immergere il tessuto in deossicolato per 24 ore a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, risciacquare il tessuto tre volte con acqua distillata, come in precedenza.Dopo i risciacqui, utilizzare la pompa manuale per perfondere il tessuto con cloruro di sodio filtrato. Successivamente, immergere il tessuto in cloruro di sodio filtrato per un'ora a quattro gradi Celsius. Dopo il bagno, perfondere la vascolarizzazione e la trachea tre volte con acqua distillata per risciacquare.Dopo i lavaggi, perfondere il tessuto con soluzione di DNasi, quindi immergerlo in soluzione di DNasi per un'ora a quattro gradi Celsius. Dopo un'ora, perfondere cinque volte la vascolarizzazione e la trachea utilizzando PBS, non acqua. A questo punto, utilizzando esclusivamente tessuto bianco opaco, dissezionare tutti i tubuli con un diametro di due millimetri o superiore.Si trovano principalmente intorno al ilo e alle porzioni mediali dei polmoni. Lasciare intatte le zone respiratorie, che si trovano soprattutto in periferia. Dopo aver rimosso i tubuli, dissezionare il tessuto in sezioni di un pollice o più piccole.L'orientamento di questi blocchi non è importante. Dopo aver drenato i blocchi di tessuto, trasferirli in un tubo conico da 50 millilitri e congelarli a 80 gradi Celsius. Alcuni blocchi possono essere messi da parte per l'istologia, al fine di confermare la rimozione delle cellule e dei detriti.Per trasformare il tessuto polmonare in polvere descellularizzata, sostituire il tappo del tubo contenente il tessuto congelato con un foglio di carta filtro, fissandolo con un elastico. Successivamente, liofilizzare il tessuto fino alla completa rimozione del liquido in eccesso, utilizzando un liofilizzatore secondo le istruzioni del produttore. Quindi, conservare il tessuto a 80 gradi Celsius fino al momento della macinazione.Per preparare il mulino, caricatelo prima con azoto liquido, lasciando spazio per il tubo del mulino. Successivamente, rimuovete la barra magnetica dal tubo del mulino e coprite la base del tubo con tessuto. Quindi, reinserite la barra del mulino e riempite il tubo con altro tessuto, inserendolo in modo allentato.Quindi, chiudere il tubo del mulino, posizionarlo nel congelatore/mulino e riempire il mulino con azoto liquido fino alla sua capacità massima. A questo punto, eseguire il mulino per circa cinque minuti con una frequenza di impatto di circa 600 al minuto. Successivamente, conservare la polvere descellularizzata a 80 gradi Celsius, fino al momento dell'utilizzo.Per preparare il materiale pre-gel, aggiungere la polvere di tessuto descelularizzato e la peptina a un tubo conico. Quindi aggiungere al tubo acido cloridrico 0,01 molare, fino a ottenere una concentrazione finale di 1% di polvere di tessuto descelularizzato e 0,01% di peptina. Mantenere questa soluzione sotto agitazione costante a temperatura ambiente per 48 ore per digerire i tessuti.Dopo 48 ore, mettere la soluzione sul ghiaccio per cinque minuti. Ora regolare il pH della soluzione a 7,4 utilizzando idrossido di sodio 0,1 molare freddo, quindi portare la concentrazione di PBS della soluzione a 1X aggiungendo PBS 10X. Abbiamo alcune esperienze con la modifica dei tempi e del pH del pre-gel.Esiste una certa flessibilità nell'intervallo utilizzabile, ma le proprietà possono cambiare in modo significativo se la procedura viene modificata anche in modo minimo. La soluzione non è considerata pre-gel e può essere utilizzata per rivestire piastre non trattate al fine di formare idrogeli su cui coltivare cellule, per formare idrogeli all'interno dei quali coltivare cellule, oppure può essere ulteriormente modificata prima della formazione degli idrogeli per aumentarne la rigidità. Per coltivare cellule su un rivestimento gelatinoso micro-poroso bidimensionale, aggiungere 20 microlitri di soluzione pre-gel nei pozzetti di una piastra da coltura tessutale a 96 pozzetti non trattata.Successivamente, conservare la piastra in frigorifero durante la notte a quattro gradi Celsius affinché le proteine vengano assorbite sulla piastra. Il giorno seguente, aspirare la soluzione pre-gel e risciacquare le pozzette con PBS. Quindi, aggiungere 3.200 cellule a ciascuna pozzetta e portare il volume del mezzo a 100 microlitri in ogni pozzetta.I piatti possono quindi essere incubati. Per una coltura cellulare tridimensionale con cellule all'interno del gel micro-poroso, sospendere le cellule di interesse a un milione per millilitro nella soluzione pre-gel. Quindi, distribuire rapidamente 16 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti per formare una coltura cellulare 3D spessa circa 500 micron.Il gel si formerà in 30 minuti una volta incubato a 37 gradi Celsius. Dopo la formazione dei gel, aggiungere il mezzo nei pozzetti fino ai segni dei 100 microlitri. Per una coltura cellulare tridimensionale con cellule poste sopra il gel micro-poroso, aggiungere i 100 microlitri della soluzione pre-gel nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti non trattata.Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti per la gelificazione. Una volta formati i gel, aggiungere 3.200 cellule in 100 microlitri di mezzo sopra gli idrogel e procedere con l'incubazione della piastra. Gli idrogel sono stati prodotti da polmoni normali di maiale, ratto e topo utilizzando il metodo descritto.I test reologici hanno confermato che oltre il 90% della formazione del gel avviene nei primi minuti dopo aver raggiunto i 37 gradi Celsius. Gli idrogel formati sono risultati stabili per lunghi periodi in PBS, ma l'adesione e la proliferazione cellulare possono variare nel tempo. La soluzione pre-gel è stata testata come rivestimento per migliorare l'adesione cellulare.Il legame e la proliferazione delle cellule endoteliali provenienti dalla vena ombelicale umana sono stati misurati utilizzando un MTTSA. Sono state osservate migliorie rivestendo le pozzette con ECM. Nella preparazione di gel 3D, l'aggiunta di Genipin ha aumentato il reticolaggio dell'idrogel.Mediante scansioni in frequenza su un reometro, la rigidità dell'idrogel è stata direttamente correlata alla concentrazione di Genipina, con una concentrazione mediana e più rilevante pari a 0,01%. Testando i gel più rigidi, la proliferazione cellulare è risultata maggiore in un saggio MTTSA sui gel con un maggior grado di reticolazione. Una volta acquisita padronanza della tecnica, la descellularizzazione può essere eseguita in otto ore distribuite in quattro giorni. La soluzione pre-gel può essere preparata in un'ora distribuita in due giorni, e la formazione del gel può essere completata in due ore distribuite in due giorni.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la microscopia a forza atomica (AFM), i blotting western, le colorazioni e l'immunohistochimica per rispondere a ulteriori domande, come il modulo elastico, la composizione proteica e la risposta cellulare al materiale.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

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