Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Questo è un metodo per creare un 3-dimensionale scaffold coltura cellulare dalla matrice extracellulare polmonare. polmone Intact è trasformato in idrogel in grado di sostenere la crescita delle cellule in tre dimensioni.

L'obiettivo generale di questo metodo per realizzare idrogel personalizzati è studiare le cellule e le condizioni di coltura che replicano la complessità della matrice extracellulare polmonare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo polmonare, come ad esempio come interagiscono le cellule polmonari con la MEC in condizioni sane e patologiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli idrogel ECM polmonari sono adattabili alla vostra applicazione in coltura 2D o 3D.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della complessità delle tecniche di decellularizzazione, che a volte richiedono più persone e attenzione ai dettagli per ottimizzare la quantità di tessuto vitale. Per questo protocollo, avere un polmone suino pronto per la decellularizzazione. I dettagli sulla sua preparazione sono disponibili nel protocollo di testo.

Una volta preparato il polmone, utilizzare una pompa a mano incannulata per adattarsi all'arteria polmonare. Per prima cosa, perfondere circa un litro d'acqua nel sistema vascolare e poi 1,5 litri nella trachea. Fallo tre volte, aumentando il volume di acqua perfusa man mano che i detriti cellulari vengono rimossi.

Successivamente, perfondere il fazzoletto con Triton X-100, utilizzando anche la pompa a mano. Quindi, immergere il tessuto in un bagno di soluzione Triton X-100 a quattro gradi Celsius per 24 ore. Dopo 24 ore, sciacquare tre volte il sistema vascolare e la trachea con acqua distillata.

Dopo i risciacqui, utilizzare la pompa a mano per perfondere il tessuto con desossicolato. E poi immergere il tessuto nel desossicolato per 24 ore a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, sciacquare il fazzoletto tre volte con acqua distillata, come prima.

Dopo i risciacqui, utilizzare la pompa a mano per perfondere il fazzoletto con cloruro di sodio filtrato. Quindi immergere il tessuto in cloruro di sodio filtrato per un'ora a quattro gradi Celsius. Dopo il bagno, perfondere il sistema vascolare e la trachea tre volte con acqua distillata per risciacquare.

Dopo i risciacqui, perfondere il fazzoletto con la soluzione di DNasi, quindi immergerlo in soluzione di DNasi per un'ora a quattro gradi Celsius. Dopo un'ora, perfondere il sistema vascolare e la trachea cinque volte utilizzando il PBS, non l'acqua. Ora, usando solo un tessuto bianco opaco, seziona tutti i tubuli che hanno un diametro di due millimetri o più.

Si trovano principalmente intorno all'ilo e alle porzioni mediali dei polmoni. Lasciare intatte le zone respiratorie, che si trovano per lo più in periferia. Dopo aver rimosso i tubuli, sezionare il tessuto in sezioni di un pollice o più piccole.

L'orientamento di questi blocchi non è importante. Dopo aver scolato i blocchi di tessuto, trasferirli in una provetta conica da 50 millilitri e congelarli a 80 gradi Celsius. Alcuni blocchi possono essere messi da parte per l'istologia per confermare la rimozione delle cellule e dei detriti.

Per trasformare il tessuto polmonare in polvere decellularizzata, riposizionare il coperchio del tubo di tessuto congelato con una carta da filtro e fissarlo con un elastico. Quindi, liofilizzare il fazzoletto fino a quando tutto il liquido in eccesso non è sparito utilizzando un liofilizzatore secondo le indicazioni del produttore. Quindi, conservare il fazzoletto a 80 gradi Celsius fino a quando non può essere macinato.

Per preparare il mulino, caricarlo prima con azoto liquido, lasciando spazio per il tubo del mulino. Quindi, dal tubo del mulino, rimuovere la barra magnetica del mulino e coprire il fondo del tubo con un fazzoletto. Quindi, sostituire la barra del mulino e impacchettare liberamente altro tessuto per riempire il tubo.

Quindi, chiudere il tubo del mulino, metterlo nel congelatore/mulino e riempire il mulino con azoto liquido fino alla sua capacità massima. Ora, fai funzionare il mulino per circa cinque minuti con una velocità di impatto di circa 600 al minuto. Quindi, conservare la polvere decellularizzata a 80 gradi Celsius, fino al momento del bisogno.

Per realizzare il materiale pre-gel, aggiungere polvere di tessuto decellularizzato e pepsina in un tubo conico. Quindi aggiungere 0,01 molare di acido cloridrico alla provetta, per una concentrazione finale dell'1% di polvere di tessuto decellularizzato e dello 0,01% di pepsina. Tenere questa soluzione sotto costante agitazione a temperatura ambiente per 48 ore per digerire i tessuti.

Trascorse le 48 ore, mettere la soluzione in ghiaccio per cinque minuti. Ora regolare il pH della soluzione a 7,4 utilizzando idrossido di sodio molare freddo da 0,1 molari, quindi portare la concentrazione di PBS della soluzione a 1X aggiungendo 10X PBS. Abbiamo una certa esperienza con l'alterazione dei tempi e del pH del pre-gel.

C'è una certa flessibilità nell'intervallo che può essere utilizzato, ma le proprietà possono cambiare drasticamente se la procedura viene modificata in modi minori. La soluzione non è considerata pre-gel e può essere utilizzata per rivestire piastre non trattate per formare idrogel su cui formare cellule, per formare idrogel in cui formare cellule, oppure può essere ulteriormente modificata prima di formare idrogel per aumentare la rigidità degli idrogel. Per coltivare le cellule su un rivestimento bidimensionale in gel microporoso, aggiungere 20 microlitri di soluzione pre-gel ai pozzetti di una piastra di coltura tissutale non trattata a 96 pozzetti.

Quindi, refrigerare il piatto per una notte a quattro gradi Celsius in modo che le proteine vengano assorbite dal piatto. Il giorno successivo, aspirare la soluzione pre-gel e sciacquare i pozzetti con PBS. Quindi, aggiungere 3.200 celle a ciascun pozzetto e rabboccare il volume del terreno in ciascun pozzetto a 100 microlitri.

Le piastre possono quindi essere incubate. Per una coltura cellulare tridimensionale con cellule all'interno del gel microporoso, risospendere le cellule di interesse a un milione per millilitro in soluzione pre-gel. Quindi, erogare rapidamente 16 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti per formare una coltura cellulare 3D con uno spessore di circa 500 micron.

Il gel si formerà in 30 minuti una volta incubato a 37 gradi Celsius. Dopo che i gel si sono formati, aggiungere il terreno ai pozzetti fino a 100 microlitri. Per una coltura cellulare tridimensionale con cellule sopra il gel microporoso, aggiungere i 100 microlitri della soluzione pre-gel ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti non trattata.

Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti per la gelificazione. Una volta formati i gel, aggiungere 3.200 cellule in un terreno da 100 microlitri sopra gli idrogel e procedere all'incubazione della piastra. Gli idrogel sono stati prodotti da polmoni normali di maiale, ratto e topo utilizzando il metodo descritto.

I test reologici hanno confermato che oltre il 90% della gelificazione avviene nei primi minuti dopo aver raggiunto i 37 gradi Celsius. Gli idrogel formati sono rimasti stabili per lunghi periodi nella PBS, ma l'attaccamento e la proliferazione cellulare possono cambiare nel tempo. La soluzione pre-gel è stata testata come codifica per migliorare l'adesione cellulare.

L'attacco e la proliferazione delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana sono stati misurati utilizzando un MTTSA. I miglioramenti sono stati osservati rivestendo i pozzetti con ECM. Nella produzione di gel 3D, l'aggiunta di genipina ha aumentato la reticolazione dell'idrogel.

Utilizzando gli sweep di frequenza su un reometro, la rigidità dell'idrogel è stata direttamente correlata alla concentrazione di genipina, con la concentrazione mediana e più rilevante dello 0,01% Testando i gel più rigidi, la proliferazione cellulare è stata misurata in modo più elevato da un MTTSA sui gel con maggiore reticolazione. Una volta padroneggiata, la decellularizzazione può essere eseguita in otto ore in quattro giorni. La soluzione pre-gel può essere preparata in un'ora in due giorni e la formazione del gel può essere realizzata in due ore in due giorni.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come AFM, western blot, colorazione e immunoistochimica per rispondere a ulteriori domande, come il modulo elastico, la composizione proteica e la risposta cellulare al materiale.