Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Questo protocollo ci ha permesso di risolvere la struttura del TRPC3 umano, membro di una famiglia importante, ma poco disostidita, di canali ionici. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'alta efficienza con cui può essere applicata per esprimere e purificare una varietà di proteine, sia per studi strutturali che funzionali. Questo metodo può fornire un efficiente sistema di espressione e purificazione delle proteine, da utilizzare nello studio della biochimica e della biofisica proteica e può essere applicato a un'ampia varietà di canali ionici e altre proteine di membrana.

In primo luogo, controllare l'espressione relativa del virus visualizzando la fluorescenza GFP del virus in un campione della coltura che produce virus. In un pallone di coltura Erlenmeyer inferiore sconcertato di dimensioni sufficienti, preparare un volume desiderabile di una coltura di sospensione cellulare di mammiferi HEK293, ad una concentrazione da 3,5 a 3,8 milioni di cellule per millilitro nel mezzo di espressione, integrato con FBS sterile all'1%. Aggiungere l'8% in volume della soluzione di stock di virus P2 preparata e incubare in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius e 135 RPM.