Preparazione del campione miniaturizzati per microscopia elettronica di trasmissione

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle strutture, come la preparazione di proteine sensibili, dove è disponibile una quantità limitata di proteine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, rispetto ai metodi standard di preparazione dei campioni, sono necessarie solo piccole quantità di campione e che non è coinvolta alcuna fase di carta assorbente brusca. Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'analisi di singole cellule mediante proteomica visiva o alla diagnosi di malattie correlate alle proteine.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando avevamo a disposizione la tecnologia per risolvere strutture ad alta risoluzione con solo circa 100.000 singole particelle. Per iniziare, preparare il campione come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi, assembla la tazza di etano, il supporto della scatola criogenica e il ragno.

E riempi il contenitore del criogeno fino all'orlo con azoto liquido. Dopo qualche minuto, la tazza sarà fredda e priva di azoto liquido. Quindi apri la bombola del gas etano e lascia che il gas fluisca lentamente nella tazza dell'etano.

Lascia che la tazza si riempia di etano liquido fino a quando il livello è di due o tre millimetri sotto la parte superiore. Questo richiederà alcuni minuti e richiede circa cinque millilitri di etano liquido. Rimuovere il ragno, posizionare il coperchio in polistirolo sopra e posizionare il contenitore del criogeno sul supporto nella crioscrittore.

Afferrare la griglia EM scaricata dal bagliore con le pinzette per crioscrittore, annodare le pinzette sull'elettromagnete e avvitare il micromanipolatore per allineare la griglia piatta sul palco, con il lato della pellicola di carbonio rivolto verso l'alto. Torna al software, fai doppio clic su grid_save. Quindi regolare la posizione dei microcapillari, in modo che la punta si trovi a circa 10 micrometri sopra la superficie della griglia.

Assicurarsi che il microcapillare possa muoversi liberamente attraverso la griglia, senza toccarla da nessuna parte. E se necessario, prelevare il microcapillare di alcuni micrometri. Quindi riportalo in posizione al centro della griglia e salva la nuova posizione come griglia.

Riportare il microcapillare nella posizione iniziale. Quindi, sciacquare il microcapillare con alcune decine di nanolitri di liquido di sistema e utilizzare un tessuto privo di lanugine per rimuovere eventuali gocce dal microcapillare. Con tutto ora pronto, avvia lo script macro.

Il macro si sposta prima in posizione ed eroga cinque nanolitri di liquido del sistema per rimuovere eventuali bolle d'aria sulla punta, quindi si sposta sulla posizione dei campioni. Successivamente, aspira 65 nanolitri di campione, quindi infonde nuovamente cinque nanolitri nella provetta del campione. Ciò tiene conto del gioco del sistema e consente la scrittura sincronizzata.

Dopo essersi spostato nella posizione della griglia, avvia uno schema di scrittura, che farà muovere il microcapillare attraverso la griglia e contemporaneamente erogherà 45 nanolitri di campione. Quindi sposta il microcapillare al centro della griglia, lo abbassa di altri 10 micrometri e preleva il liquido campione in eccesso. Infine, il macro ritira il microcapillare e spegne l'elettromagnete, che avvia il meccanismo di congelamento a tuffo.

Una volta rilasciato dal magnete, rilasciare con cautela l'adattatore magnetico dallo stantuffo e trasferire rapidamente la griglia dalla tazza di etano nel contenitore criogenico, contenente la scatola criogenica, posizionando la griglia in una fessura libera. Per iniziare, preparare le cellule come descritto nel protocollo di testo allegato e montare il vetrino di ossido di indio e stagno sull'inserto del microscopio. Utilizzare due viti per fissare la guida sull'inserto in alluminio e per garantire il contatto elettrico tra il rivestimento in ossido di indio e stagno della guida e il telaio in alluminio con messa a terra elettrica.

Quindi rimuovere il terreno di coltura cellulare dal pozzetto e lavare le cellule due volte con 300 microlitri di tampone di elettroporazione. Dopo l'ultimo lavaggio, conservare le celle nel tampone di elettroporazione. Quindi, posizionare l'inserto in alluminio che tiene il vetrino di ossido di indio e stagno nello stadio dell'incubatore di cellule vive, sulla configurazione.

Usando il microscopio, individua la coltura cellulare e scegli un'area senza cellule. Avvicinare la punta microcapillare sulla superficie del vetrino e toccarla delicatamente. Quindi estrarre la punta in 100 micrometri e salvare la posizione come celle.

Ora lasciate rapidamente la coltura cellulare e lavate la punta microcapillare con alcune decine di nanolitri di liquido di sistema, quindi reinseritela nella coltura cellulare. Erogare alcuni nanolitri durante l'immersione nel pozzetto del PDMS per assicurarsi che non rimangano intrappolate bolle d'aria sulla punta. Fare doppio clic sulla posizione della cella e avvicinarsi delicatamente alla superficie del vetrino di ossido di indio stagno e, al contatto, ritrarre la punta di 10 micrometri.

A questo punto, selezionare una cellula vicina per la lisi e posizionare la punta del microcapillare sopra la cellula bersaglio. Quindi avviare il macro script per la lisi a singola cellula.

Una volta avviato, lo script chiederà una posizione in cui il microcapillare deve essere spostato dopo che una cellula è stata lisata con successo. Inserire la posizione desiderata, ad esempio griglia, per la griglia EM. La macro procederà quindi senza l'intervento dell'utente e inizierà spostando il tavolino del microscopio in coltura cellulare di 100 micrometri a sinistra, dove scatterà un'istantanea della cellula bersaglio.

Quindi 15 nanolitri di acqua a doppia distillazione vengono erogati dal tubo microcapillare, spostando e diluendo il tampone ad alto contenuto di sale, applicando una pressione osmotica alla cellula. Successivamente, lo stadio torna indietro per posizionare nuovamente la punta sopra la cella di destinazione. Lì, viene applicato un burst di tensione predefinito e, dopo 500 millisecondi, il sistema di pompaggio inizia ad aspirare tre nanolitri di campione a una portata di due microlitri al minuto.

Infine, il tavolino si sposta di nuovo a sinistra, il che consente l'ispezione della cella. Viene visualizzata una finestra che richiede l'input dell'utente. Se la cella ha avuto esito positivo, immettere sì per scattare un'istantanea della cella lisata.

Successivamente, il microcapillare si sposta nella posizione endo, immerso nel liquido del serbatoio. Lasciare il microcapillare immerso per otto-12 minuti, a seconda della geometria dell'ugello. Quindi, erogare cinque nanolitri del lisato cellulare condizionato sulla griglia.

Prelevare il microcapillare e lasciare asciugare lentamente il campione condizionato su una fase del punto di rugiada. Infine, rimuovere la griglia dal tavolino e conservarla a temperatura ambiente in una scatola a griglia. Di seguito sono mostrate le tipiche immagini criogeniche di campioni congelati utilizzando la configurazione CryoWriter descritta.

Nella panoramica della griglia, la periferia del ghiaccio vitreo può essere vista chiaramente. Dopo un esame più attento di una fessura della griglia con la pellicola di carbonio forata contenente ghiaccio vetroso, si possono trovare buchi bianchi, indicando che non tutti i fori sono stati riempiti con il tampone del campione. In uno dei campioni contenenti fori di carbonio, la coda di un batteriofago può essere vista chiaramente con dettaglio.

Utilizzando la configurazione CryoWriter per eseguire la proteomica visiva su singola cellula, è possibile vedere cose come singole proteine, ad esempio actina filamentosa e patch di membrana con proteine attaccate. L'immagine che si può vedere nel pannello 6b è colorata negativamente con una colorazione negativa al 2%, basata su un composto organotungsteno. Il pannello c mostra un lisato a cellula singola preparato per la crioterapia EM. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare griglie negative con colorazione negativa o crioEM, da volumi totali di nanolitri di campioni proteici o estratti di singole cellule.

Non dimenticare che lavorare con etano liquido e azoto può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio, eseguendo questa procedura.