Name: Preparazione del campione miniaturizzati per microscopia elettronica di trasmissione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Impara la preparazione miniaturizzata di campioni per microscopia elettronica a trasmissione senza carta assorbente. Questa tecnica riduce la perdita del campione e consente l'analisi di lisati di singole cellule per proteomica visuale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori vorrei ringraziare l'officina del Biozentrum dell'università Basilea per il loro sostegno, S. A. Müller per discussioni critiche e leggendo attentamente il manoscritto, A. fore-LeFebvre per assistenza tecnica con EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann per proteina della membrana testare campioni (tutti dal C-CINA, Biozentrum, Università di Basilea) e r. Engel, emerito università Basilea per le sue conversazioni stimolanti. Campioni di prova sono state gentilmente concesse da P. Ringler, M.-A. Mahi e T. Schwede (Biozentrum, Università di Basilea), p. Leiman (laboratorio di biologia strutturale e biofisica, EPFL) e R. Diaz-Avalos (centro di biologia strutturale di New York, USA). Il progetto è stato sostenuto da Swiss Nanoscience Institute (SNI, progetto P1401, progetto ARGOVIA MiPIS) e la Swiss National Science Foundation (SNF, progetto 200021_162521).

<ol><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%3A+The+resolution+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biochemistry: The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li>
<li>Bai, X. -c, McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).</li>
<li>Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3043536">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen+biological+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen biological suspensions.</a> J Microsc. 129, Pt 1 89-102 (1983).</li>
<li>Baker, L. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+damage+in+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Radiation damage in electron cryomicroscopy.</a> Methods Enzymol. , (2010).</li>
<li>Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1683435">Electron gun using a field emission source.</a> Rev Sci Instrum. , (2003).</li>
<li>Zemlin, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0968432894900264">Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy.</a> Micron. 25 (3), 223-226 (1994).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a, Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat methods. 10, 584-590 (2013).</li>
<li>Milazzo, A. -C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -H., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+evaluation+of+a+direct+detection+device+detector+for+single+particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).</li>
<li>Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+electron+detectors+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).</li>
<li>Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -y, Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+the+potential+of+electron+cryomicroscopy+data+collected+using+direct+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors.</a> J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).</li>
<li>Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+Cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
<li>Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+Cryo-EM+movie+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of Cryo-EM movie data.</a> Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).</li>
<li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+image+alignment+for+cryogenic+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).</li>
<li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+to+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A primer to single-particle cryo-electron microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li>
<li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li>
<li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+can+cryo-EM+become%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">How good can cryo-EM become.</a> Nat Methods. 13, 28-32 (2016).</li>
<li>Engel, A. in . <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642025969">Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology</a>. Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. 96, Springer Berlin. Heidelberg, Berlin. 417-431 (2010).</li>
<li>Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., Müller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22094535">Connecting µ-fluidics to electron microscopy.</a> J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).</li>
<li>Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+sample+conditioning+and+preparation+of+nanoliter+volumes+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy.</a> ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).</li>
<li>Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lysis+for+visual+analysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy.</a> J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).</li>
<li>Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).</li>
<li>Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., Müller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((openBEB%3A+open+biological+experiment+browser+for+correlative+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements.</a> BMC Bioinformatics. 15, 84(2014).</li>
<li>Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+interactome%3A+microfluidic+isolation+of+proteins+and+interacting+partners+for+quantitative+analysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy.</a> Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).</li>
</ol>

Gli autori Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg e Thomas Braun dichiarano gli interessi finanziari concorrenti seguenti: il concetto di cryoWriter è parte della domanda di brevetto PCT / EP2015/065398 ed EP16194230.

Lo strumento di 'cryoWriter' e i protocolli richiesti per preparare griglie campione per NS - e cryo-EM da volumi di campione totale nL dimensioni e completamente evitare il passaggio di carta-blotting classico sono presentati. Principi di microfluidica e un sistema di micromeccanica sono combinati in cryoWriter per rendere questo possibile.
La nostra esperienza dimostra che quando vengono utilizzati i metodi miniaturizzati presentati in questo manoscritto, lo spazio di parametro per la preparazione di EM-griglia è maggiore per i metodi classici e sotto stretto controllo di utente. D'importanza, la maggiore riproducibilità raggiunta permette di pre-schermo con sistema tampone del campione, completata con una proteina di test prontamente disponibile, per determinare i parametri ottimali, prima di eseguita l'esperimento vero e proprio. Questo mantiene il consumo del campione di interesse all'assoluto minimo ed è altamente raccomandato. Fasi critiche per entrambi preparazione griglia NS - e cryo-EM sono: (i) Priming del sistema pompa; per l'erogazione del volume sub-nanolitro, il liquido (acqua) deve essere degassato e bolla libero. (ii) preciso controllo dell'effluvio o al plasma pulizia passo; le caratteristiche della superficie della griglia EM sono fondamentali per ottenere risultati riproducibili. (iii) condizionata campione; il tempo richiesto per il condizionamento, per esempio, con NS, dipende dal tipo di buffer, il contenuto di sale e la concentrazione (Figura 3), nonché la geometria dell'ugello del microcapillary24. (iv) tassi di evaporazione per le preparazioni di NS-EM EM quantitativa; l'effetto di anello di caffè può vietare l'analisi quantitativa delle preparazioni di NS-EM e dovrà essere soppresse dai tassi lenta evaporazione controllati dalla DP-fase.
Diversi aspetti dei metodi di preparazione griglia presentati possono essere combinati liberamente permettendo lo sviluppo di protocolli versatile per gli esempi specifici. Esempi tipici sono la rimozione di una sostanza che impedisce EM ad alta risoluzione, ad esempio, glicerolo, da una fase di condizionamento prima della preparazione di griglia per cryo-EM; l'introduzione di molecole di mediatore, come ligandi, di condizionamento prima le griglie sono preparate; o l'esame della singola cella lysata di NS - o cryo-EM (Figura 6).
L'uso della microfluidica e quantità minime nei metodi presentati rimuove completamente la necessità di passaggi carta-blotting. Questo è un grande vantaggio, perché carta assorbente è un duro trattamento per proteine, potenzialmente contaminare il campione con ioni indesiderati e intrinsecamente portando alla perdita massiccia di campione. D'altra parte, gli effetti potenzialmente causati dall'interfaccia aria-acqua del film campione sottile formato quando cryo-EM i campioni sono preparati nel modo classico non sono evitati quando viene utilizzato il cryoWriter. Griglie per cryo-EM possono essere preparate con un tempo di attesa inferiore a 0,2 s tra l'applicazione di esempio e vetrificazione (dati non mostrati). Tuttavia, come proteine viaggiano a pochi decimi di un nanometro in pochi nanosecondi in diffusione, c'è ancora abbastanza tempo per loro entrare in collisione con l'interfaccia acqua-aria di un film di spessore campione nm 100 diverse volte. Tuttavia, la quantità di proteine che attacca all'interfaccia aria-acqua potrebbe essere significativamente ridotta di queste lacune di breve periodo di tempo e potrebbe prevenire la denaturazione proteica o limitato orientamento delle particelle. Un altro approccio promettente che potrebbe proteggere le proteine sensibili dall'interfaccia aria-acqua è di coprire il film campione di sostanze tensioattive di basso peso molecolare. Questi composti potrebbero essere rapidamente introdotti da una fase di condizionamento in cryoWriter prima della preparazione di griglia. L'elevato rapporto superficie-volume sistemi microfluidici è un'ulteriore limitazione del cryoWriter, come campione può potenzialmente essere perso di adsorbimento non specifico alla superficie microcapillary e disturbare l'analisi quantitativa di conteggio delle particelle. Il problema è risolto in due modi: in primo luogo, il campione non percorrere lunghe distanze all'interno del microcapillary. Infatti, il volume del campione nanolitro rimane all'estremità capillare in tutta l'elaborazione. In secondo luogo, la superficie in rapporto al volume è ulteriormente ridotto utilizzando microcapillari con diametri interni relativamente grandi, per esempio, 180 µm. in terzo luogo, le superfici dei microcapillari possono essere passivate facilmente, se necessario, ad esempio, trattandole con glicoli di etanolo polilisina commercialmente disponibile (PLL-PEG).
L'analisi ad alta risoluzione delle proteine mediante l'approccio di singola particella utilizzato in EM richiede solo 100.000 a qualche milione di immagini di particelle singole proteine. Ciò significa che la microfluidica tecniche possono fornire abbastanza complessi della proteina per l'indagine strutturale. Precedenti28è stato sviluppato un metodo di immuno-precipitazione miniaturizzati per il rapido isolamento dei complessi della proteina (circa 1 ora) dalla quantità di cellule minimal (circa 40.000 cellule). Questo metodo verrà ora essere collegato direttamente alla fase di preparazione del campione miniaturizzati della cryoWriter. L'obiettivo finale è quello di sviluppare una pipeline integrata microfluidici per preparazione griglia isolamento e cryo-EM proteina ultra-veloce che richiede meno di due ore in tutto. Inoltre, come dimostrato dalla Figura 6, la piccola quantita ' e il volume di materiale necessario per la preparazione del campione e la condizionata quasi senza perdita di dati e la procedura di preparazione griglia ottenuta utilizzando il cryoWriter, rendono possibile studiare la proteina complessi di singole celle. Insieme, il metodo miniaturizzati immuno-precipitazione e la cryoWriter porre le fondamenta di un nuovo metodo di proteomica chiamato "singola cella visual proteomics", come abbiamo recentemente dimostrato per shock termico esperimenti24. Algoritmi di analisi di dati orientati all'analisi delle immagini "visual proteomics" sono attualmente in fase di test.

Hardware e software per l'analisi strutturale dei complessi della proteina di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha avanzato in maniera massiccia negli ultimi anni. I miglioramenti apportati hanno aperto la strada a una "rivoluzione di risoluzione"1,2 e cambiato fondamentalmente ricerca strutturale. La rivoluzione è iniziata con l'avvento di cryo-elettrone microscopia (cryo-EM)3,4, che permette la preparazione di campioni biologici sotto vicino alle condizioni fisiologiche, diminuendo la sensibilità di radiazione e prevenendo evaporazione di campioni in alto vuoto del microscopio elettronico a trasmissione5. Negli anni successivi, il progresso tecnologico incrementale aumentato gradualmente la risoluzione ottenibile. Tra queste innovazioni erano l'applicazione dell'emissione di campo pistole6,7e, più recentemente, migliorato algoritmi di analisi di dati, ad esempio di massima verosimiglianza metodi8,9. Diretto di elettroni rivelatore telecamere10,11,12,13, film-modalità imaging e l'accompagnamento software sviluppi14,15, 16 , 17, fornito la svolta finale richiesta per raggiungere risoluzione atomica per campioni biologici dall'analisi di singola particella (per una recensione Vedi Cheng, Grigorieff, et al. 18). l'importanza di cryo-EM è stato recentemente riconosciuto dal premio del premio Nobel per la chimica a tre dei pionieri.
Per realizzare l'immagine un campione biologico da TEM, il metodo utilizzato per caricare la griglia EM con il campione (in seguito denominato «preparazione griglia») deve garantire che il livello risultante di campione (i) è abbastanza sottile (&lt; 100 nm) per evitare rumore vasta di anelastica o moltiplicare sparsi gli elettroni, (ii) resiste l'alto vuoto del microscopio elettronico, e (iii) protegge le biomolecole da danno da radiazione. Due metodi principali vengono utilizzati per soddisfare questi prerequisiti: macchia negativa(NS)19,20 procedure (Figura 1A) adsorbire il campione ad una pellicola di carbonio sottile, incorporare le biomolecole amorfo heavy metal e poi permette il montaggio ad asciugare all'aria. Questo è semplice e veloce, e le griglie di EM caricate (in seguito denominate "griglie campione") sono facili da memorizzare e può essere conservata per lunghi periodi di tempo (in genere anni). In TEM, i preparativi esibiscono contrasto elevato dovuto il NS e tollerano dosi più elettroni che cryo-preparati, ma la risoluzione è limitata a circa 20 procedure Å. Cryo-EM (Figura 1B) impiegare holey carbonio supporta. Una sottile pellicola della soluzione del campione è misurata attraverso i fori e la griglia di EM è immerso in un criogeno, solitamente liquefatto etano, raffreddare rapidamente sotto-150 ° C. Il risultato è un amorfo, vetrificati, da 50 a 100 nm di spessore pellicola della soluzione nei fori di supporto. Questa pellicola sottile amorfa resiste l'alto vuoto nel microscopio elettronico e, nel caso ideale, conserva strutture biologiche nel loro stato nativo. La procedura permette di campioni biologici per l'imaging in alta risoluzione. Tuttavia, la griglia di esempio dovrà essere conservata a temperature sotto-150 ° C in ogni momento per evitare devetrificazione. Può essere imaged utilizzando dosi di elettrone relativamente elevato a causa della bassa temperatura, ma il contrasto e rapporto segnale-rumore è comunque basso. Di conseguenza, vengono impiegate tecniche in media per aumentare il contrasto e, purché il campione è ripreso da diverse angolazioni, una mappa ad alta risoluzione tridimensionale (3D) può essere ricostruita. Il più comunemente usato e metodo altamente efficace per la ricostruzione 3D a partire da ora è l'approccio di singola particella. Per una rassegna recente, vedere Cheng altri.18.
Macchia negativa TEM (NS-EM) è importante per la selezione ed il controllo di qualità, quando è necessario ad alto contrasto o quando sono disponibili solo limitate quantità di campione (adsorbimento alla pellicola di carbonio generalmente concentrati nell'esempio). Singola particella cryo-EM è il metodo standard di oro se ricostruzioni 3D ad alta definizione della struttura della proteina sono destinate per.
<img alt="Schema delle tecniche di micromanipolazione; Include la deposizione di goccioline, l'estrazione della nanostruttura e il trasferimento." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: principi di TEM griglia preparazione e confronto tra il classico (pannello A, B) e un approccio di microfluidica (pannello C, D). A) preparazione griglia classica NS-EM: circa 3 µ l di campione sono pipettati a mano su una griglia di EM coperta con una pellicola di carbonio continuo (in seguito denominata una 'griglia NS-EM') (i). Dopo un'incubazione di circa 10 s, carta da filtro viene utilizzato per cancellare via il liquido in eccesso dal lato (ii), lasciando le biomolecole adsorbite in una pellicola sottile d'acqua. Successivamente, la proteina viene incubata in una soluzione di sale di metallo pesante, per esempio, acetato di uranile 2%, per 20 s (iii) e nuovo il liquido viene rimosso dal macchiare dal lato utilizzando carta da filtro (iv). Infine, la EM-griglia viene lasciata per asciugare all'aria. B) preparazione griglia classica cryo-EM: circa 3 µ l di campione sono pipettati da una mano su una pellicola di carbonio holey. Per formare una pellicola sottile del campione, il liquido in eccesso viene rimosso tramite carta-macchiare il faccia-su da uno o entrambi i lati (ii). Infine, la griglia è rapidamente immerso nell'etano liquido per la vitrificazione (iii). C) preparazione griglia NS-EM utilizzando il programma di installazione di cryoWriter: volume A 5 nL viene aspirato dal calcio campione utilizzando un microcapillary (i). Per condizionamento del campione, la punta di microcapillary è immerso nella soluzione condizionata, ad esempio, 2% di acetato di ammonio. Ioni e piccole molecole vengono scambiati tramite diffusione (ii). Si noti che le dimensioni del microcapillary garantiscono che l'intero processo è guidato di diffusione. Le proteine hanno molto inferiore costanti di diffusione degli ioni di sale e non sono significativamente perso24. Infine, il campione è erogato sulla griglia e lasciato asciugare (iii). D) principi di preparazione griglia cryo-EM utilizzando il metodo basato su cryoWriter: An EM griglia coperto con una pellicola di carbonio holey è posizionato sulla superficie di una piattaforma di controllo della temperatura e tenuto da pinzette. La temperatura della piattaforma è un offset dalla temperatura punto di rugiada dell'ambiente griglia. La griglia viene spostata rispetto a microcapillary contenente il campione e la microcapillary si abbassa fino a quando è alcuni micrometri sopra la griglia. Successivamente, pochi nanolitri di campione sono dispensati da esso, mentre la fase viene spostata in un modello a spirale; il liquido in eccesso è ri-aspirato (i). Dopo la griglia di EM di adescamento, il microcapillary è ritirato e la griglia rimane sulla piattaforma controllata di temperatura (successivamente indicati come punto di rugiada (DP) fase) per un breve periodo consentire una quantità controllata di campione di evaporare. Per immersione di congelamento, la griglia è rapidamente ritirata dal palco con le pinzette (ii), girata di 90° in posizione verticale e immerso in un bagno di criogeno (iii) (in seguito denominato 'pick-e-immersione' meccanismo). <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I metodi di preparazione griglia utilizzati per NS e cryo-EM, purtroppo, non hanno migliorato significativamente da quando sono stati inventati. Svantaggi attuali sono il consumo di campionamento elevate (ca. 3 µ l di proteina di 1 mg/mL) e la grande quantità (&gt; 99%) del campione ha perso (Figura 1A, B). Inoltre, il metodo classico utilizzato per preparare le griglie per cryo-EM è una procedura dura per proteine: in primo luogo, si tratta di un vasto faccia-su carta-blotting passo (Figura 1B, ii), e, in secondo luogo, la proteina è esposto all'interfaccia aria-acqua per una quantità significativa di tempo21. Qui, un metodo alternativo per esempio pre-condizionamento, preparazione del campione griglia e post-elaborazione (griglia essiccazione o vitrificazione) per NS-EM (Figura 1,C) o cryo-EM (Figura 1D) è presentato. L'installazione di costruito in-House, chiamato "cryoWriter", utilizza miniaturizzato campione gestione principi di tecnologia e microfluidica per aspirare, condizione e dispensare campione, evitando carta assorbente completamente e fornendo metodi alternativi ai campioni sottili per Cryo-EM. Si significativamente riduce il consumo del campione e migliora il controllo utente sulla preparazione del campione nel suo complesso. Inoltre, il metodo consente applicazioni sperimentali innovative; ad esempio la preparazione di componenti biologici isolati di singole celle in un approccio chiamato "singola cella visual proteomics"22,23,24,25.

<table><tbody><tr><td>Manipolazione dei liquidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punta microcapillare</td><td>Nuovo obiettivo</td><td>FS360-100-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &; m ID punta, 100 & micro; m ID , pk. 20</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FS360-150-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &micro; m ID punta, 150 & micro; m ID , pk. 20</td></tr><tr><td>Manicotto conduttivo</td><td>Nuovo obiettivo</td><td>CONGAS-1&nbsp;</td><td>Elastomero conduttivo per contatto HV, 12" di lunghezza</td></tr><tr><td>Tubo in silice fusa</td><td>BGB-Analytik</td><td>TSP-150375</td><td>TSP Tubo FS standard, 150 & micro; m ID, 363 &; m OD, 5 metri</td></tr><tr><td>Connettore PressFit</td><td>BGB-Analytik</td><td>2525LD</td><td>Deact. Connettore PressFit da 0,25 a 0,25 mm ID, pk. 25&nbsp;</td></tr><tr><td>Siringa 10 & micro; l</td><td>BGB-Analytik</td><td>HA-80001</td><td>Hamilton 1701 LT - Luer Tip (ago non incluso)&nbsp;</td></tr><tr><td>Controllore per pompe a siringa</td><td>Cetoni</td><td>A3921000093</td><td>Controllore neMESYS</td></tr><tr><td>Unità di dosaggio per pompa a siringa</td><td>Cetoni</td><td>A3921000095</td><td>Dosatore neMESYS</td></tr><tr><td>Controllo della temperaturaSensore del punto di</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>rugiada</td><td>Meltec</td><td>UFT75-AT</td><td>Sensore di umidità/temperatura, calcolo del punto di rugiada, USB e DLL integrata</td></tr><tr><td>Temperatura sensore</td><td>Sensorshop24.ch</td><td>LS7-PT1000-1.0-3L</td><td>Sensore di temperatura montabile in superficie Pt1000</td></tr><tr><td>Controllore Peltier</td><td>Cooltronic</td><td>TC2812&nbsp;</td><td>Regolatore di temperatura PID per l'attivazione di sistemi azionati da Peltier con uscita a tensione costante</td></tr><tr><td>Elemento Peltier</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-127-14-15-S</td><td>40x40 mm</td></tr><tr><td>Blocco di raffreddamento ad acqua</td><td></td><td></td> <td>- Blocco di raffreddamento ad acqua per elemento Peltier 40x40 mm, base in rame</td></tr><tr><td>Pompa dell'acqua</td><td>Digitec.ch</td><td>294877</td><td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4</td></tr><tr><td>Blocco scambiatore di calore ad acqua</td> <td>-</td><td></td> <td>Blocco scambiatore di calore ad acqua con 2 ventole per raffreddare l'acqua circolante</td></tr><tr><td>Refrigeratori d'acqua piccoli</td><td>PCHC.ch</td><td>223050</td><td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pz</td></tr><tr><td>Piccoli elementi Peltier</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-031-10-15-S</td><td>Laird 15x15 mm 3,4 A 8,1 W 3,8 V 74 &deg; C, 2 pz</td></tr><tr><td>Meccanica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stadio lineare asse z</td><td>Dyneos AG</td><td>M-404.2PD</td><td>Stadio traslazionale di precisione ad alto carico, corsa di 50 mm, motore DC</td></tr><tr><td>Stage controller</td><td>Dyneos AG</td><td>C-863</td><td>Mercury Servo Controller</td></tr><tr><td>Microscopio stadio asse xy</td><td>Prior Scientific</td><td>H117EIL5</td><td>Stadio motorizzato per Zeiss Axiovert 200 Microscopio invertito</td></tr><tr><td>Magneti permanenti piccoli</td><td>Supermagnete</td><td>S-05-08-N</td><td>Cilindro magnetico &Oslash; 5 mm, altezza 8,47 mm, neodimio, N45, nichelato, pk. 10</td></tr><tr><td>Elettromagnete piccolo</td><td>Schramme</td><td>EG1025A02/110</td><td>Elettromagnete 24V 220 N 150 N 2,5 W</td></tr><tr><td>Elettromagnete di controllo</td><td>Conrad.ch</td><td>MST-1630.001 7</td><td>Scheda PCB di controllo elettromagnete</td></tr><tr><td>Mozzo</td> <td>solenoideDistrelec.ch</td><td>HD8286-R-F-24V100%</td><td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td></tr><tr><td>Mini pinzette</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 0302-M5S-PS</td><td>Dumont Tipo 5 mini, punte super sottili</td></tr><tr><td>Varie parti optomeccaniche</td><td>Thorlabs</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Varie parti meccaniche</td><td>Officina Biozentrum, Università di Basilea-Piastre</td><td></td> <td>adattatrici progettate su misura, supporti, ecc. vedi file CAD allegati</td></tr><tr><td>Optics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser diodo</td><td>Thorlabs</td><td>CPS780S</td><td>780 nm modulo diodo laser 2,5 mW</td></tr><tr><td>Rivelatore fotografico</td><td>Thorlabs</td><td>PDA100A-EC</td><td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2,4 MHz BW, 100 mm2</td></tr><tr><td>EM grids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DURASIN FILM TEM</td><td></td> <td>emsdiasum.comDTF-03523</td><td>30 nm DuraSiN&trade; membrane in nitruro di silicio per TEM, confezione da 5</td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffers / Neg. stain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537&nbsp; SIGMA</td><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td></tr><tr><td>NanoVan 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Colorazione negativa a base di vanadio</td></tr><tr><td>NanoW 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Colorazione negativa a base di tungsteno</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>openBEB</td><td></td><td></td><td>Il framework openBEB 2 è disponibile su richiesta, la versione 3 sarà scaricabile</td></tr><tr><td> software (plug-in openBEB)</td><td></td><td>Disponibile su richiesta, potrebbero essere applicati costi aggiuntivi per il software del driver di terze parti.</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione del campione miniaturizzati per microscopia elettronica di trasmissione

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

A causa di recenti progressi tecnologici, cRIO-microscopia elettronica (cryo-EM) sta rapidamente diventando un metodo standard per l'analisi strutturale dei complessi della proteina a risoluzione atomica. Tuttavia, tecniche di isolamento della proteina e metodi di preparazione del campione per EM rimangono un collo di bottiglia. Un numero relativamente piccolo (100.000 per un paio di milioni) di particelle singole proteine devono essere imaged per l'analisi ad alta risoluzione delle proteine di singola particella approccio EM, rendendo miniaturizzato esempio gestione tecniche e principi di microfluidica fattibile.
Un metodo del preparazione di griglia EM miniaturizzato, carta-macchiare-gratuito per esempio pre-condizionata, adescamento griglia EM e post-elaborazione che consuma solo nanolitro-volumi di campione è presentato. Il metodo utilizza un sistema di erogazione con precisione sub-nanolitro per l'assorbimento di liquido di controllo ed EM griglia innesco, una piattaforma per controllare la temperatura della griglia definendo così l'umidità relativa di sopra della griglia di EM e un pick-e-tuffo-meccanismo per esempio vetrificazione. Per cryo-EM, una griglia di EM è disposto sulla fase a temperatura controllata e il campione viene aspirato in un capillare. La punta capillare è posizionata in prossimità di superficie della griglia, la griglia viene caricata con il campione ed eccesso è ri-aspirato nella microcapillary. Successivamente, il film campione è stabilizzato e leggermente assottigliato per evaporazione controllata acqua regolata dall'offset della temperatura piattaforma rispetto al punto di rugiada. In un dato punto viene attivato il meccanismo di prelievo-e-immersione, trasferire rapidamente la griglia EM innescata in etano liquido per la vitrificazione di campione. In alternativa, sono disponibili per preparare volumi di campione di dimensione nanolitro macchia negativa (NS) EM campione-condizionata metodi.
Le metodologie notevolmente riducono il consumo del campione ed evitare approcci potenzialmente dannosi alle proteine, come la carta da filtro assorbente usato nei metodi convenzionali. Inoltre, la minuscola quantità di campione richiesto consente nuove strategie sperimentali, come campione veloce condizionata, combinazione con cella singola Lisi per "visual proteomics", o "lossless" preparazione del campione totale per analisi quantitativa di campioni complessi.

Metodi per la preparazione di volumi di campione dimensioni nanolitro per microscopia elettronica di trasmissione e uno strumento è presentato. Non macchiare di carta sono necessari passaggi, evitando così le conseguenze pregiudizievoli, che questo può avere per le proteine, significativamente riducendo la perdita del campione e consentendo l'analisi della singola cella lysata per proteomica di visual.

Preparazione del campione miniaturizzati per microscopia elettronica di trasmissione

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle strutture, come la preparazione di proteine sensibili, dove è disponibile una quantità limitata di proteine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, rispetto ai metodi standard di preparazione dei campioni, sono necessarie solo piccole quantità di campione e che non è coinvolta alcuna fase di carta assorbente brusca. Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'analisi di singole cellule mediante proteomica visiva o alla diagnosi di malattie correlate alle proteine.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando avevamo a disposizione la tecnologia per risolvere strutture ad alta risoluzione con solo circa 100.000 singole particelle. Per iniziare, preparare il campione come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi, assembla la tazza di etano, il supporto della scatola criogenica e il ragno.E riempi il contenitore del criogeno fino all'orlo con azoto liquido. Dopo qualche minuto, la tazza sarà fredda e priva di azoto liquido. Quindi apri la bombola del gas etano e lascia che il gas fluisca lentamente nella tazza dell'etano.Lascia che la tazza si riempia di etano liquido fino a quando il livello è di due o tre millimetri sotto la parte superiore. Questo richiederà alcuni minuti e richiede circa cinque millilitri di etano liquido. Rimuovere il ragno, posizionare il coperchio in polistirolo sopra e posizionare il contenitore del criogeno sul supporto nella crioscrittore.Afferrare la griglia EM scaricata dal bagliore con le pinzette per crioscrittore, annodare le pinzette sull'elettromagnete e avvitare il micromanipolatore per allineare la griglia piatta sul palco, con il lato della pellicola di carbonio rivolto verso l'alto. Torna al software, fai doppio clic su grid_save. Quindi regolare la posizione dei microcapillari, in modo che la punta si trovi a circa 10 micrometri sopra la superficie della griglia.Assicurarsi che il microcapillare possa muoversi liberamente attraverso la griglia, senza toccarla da nessuna parte. E se necessario, prelevare il microcapillare di alcuni micrometri. Quindi riportalo in posizione al centro della griglia e salva la nuova posizione come griglia.Riportare il microcapillare nella posizione iniziale. Quindi, sciacquare il microcapillare con alcune decine di nanolitri di liquido di sistema e utilizzare un tessuto privo di lanugine per rimuovere eventuali gocce dal microcapillare. Con tutto ora pronto, avvia lo script macro.Il macro si sposta prima in posizione ed eroga cinque nanolitri di liquido del sistema per rimuovere eventuali bolle d'aria sulla punta, quindi si sposta sulla posizione dei campioni. Successivamente, aspira 65 nanolitri di campione, quindi infonde nuovamente cinque nanolitri nella provetta del campione. Ciò tiene conto del gioco del sistema e consente la scrittura sincronizzata.Dopo essersi spostato nella posizione della griglia, avvia uno schema di scrittura, che farà muovere il microcapillare attraverso la griglia e contemporaneamente erogherà 45 nanolitri di campione. Quindi sposta il microcapillare al centro della griglia, lo abbassa di altri 10 micrometri e preleva il liquido campione in eccesso. Infine, il macro ritira il microcapillare e spegne l'elettromagnete, che avvia il meccanismo di congelamento a tuffo.Una volta rilasciato dal magnete, rilasciare con cautela l'adattatore magnetico dallo stantuffo e trasferire rapidamente la griglia dalla tazza di etano nel contenitore criogenico, contenente la scatola criogenica, posizionando la griglia in una fessura libera. Per iniziare, preparare le cellule come descritto nel protocollo di testo allegato e montare il vetrino di ossido di indio e stagno sull'inserto del microscopio. Utilizzare due viti per fissare la guida sull'inserto in alluminio e per garantire il contatto elettrico tra il rivestimento in ossido di indio e stagno della guida e il telaio in alluminio con messa a terra elettrica.Quindi rimuovere il terreno di coltura cellulare dal pozzetto e lavare le cellule due volte con 300 microlitri di tampone di elettroporazione. Dopo l'ultimo lavaggio, conservare le celle nel tampone di elettroporazione. Quindi, posizionare l'inserto in alluminio che tiene il vetrino di ossido di indio e stagno nello stadio dell'incubatore di cellule vive, sulla configurazione.Usando il microscopio, individua la coltura cellulare e scegli un'area senza cellule. Avvicinare la punta microcapillare sulla superficie del vetrino e toccarla delicatamente. Quindi estrarre la punta in 100 micrometri e salvare la posizione come celle.Ora lasciate rapidamente la coltura cellulare e lavate la punta microcapillare con alcune decine di nanolitri di liquido di sistema, quindi reinseritela nella coltura cellulare. Erogare alcuni nanolitri durante l'immersione nel pozzetto del PDMS per assicurarsi che non rimangano intrappolate bolle d'aria sulla punta. Fare doppio clic sulla posizione della cella e avvicinarsi delicatamente alla superficie del vetrino di ossido di indio stagno e, al contatto, ritrarre la punta di 10 micrometri.A questo punto, selezionare una cellula vicina per la lisi e posizionare la punta del microcapillare sopra la cellula bersaglio. Quindi avviare il macro script per la lisi a singola cellula.Una volta avviato, lo script chiederà una posizione in cui il microcapillare deve essere spostato dopo che una cellula è stata lisata con successo. Inserire la posizione desiderata, ad esempio griglia, per la griglia EM. La macro procederà quindi senza l'intervento dell'utente e inizierà spostando il tavolino del microscopio in coltura cellulare di 100 micrometri a sinistra, dove scatterà un'istantanea della cellula bersaglio.Quindi 15 nanolitri di acqua a doppia distillazione vengono erogati dal tubo microcapillare, spostando e diluendo il tampone ad alto contenuto di sale, applicando una pressione osmotica alla cellula. Successivamente, lo stadio torna indietro per posizionare nuovamente la punta sopra la cella di destinazione. Lì, viene applicato un burst di tensione predefinito e, dopo 500 millisecondi, il sistema di pompaggio inizia ad aspirare tre nanolitri di campione a una portata di due microlitri al minuto.Infine, il tavolino si sposta di nuovo a sinistra, il che consente l'ispezione della cella. Viene visualizzata una finestra che richiede l'input dell'utente. Se la cella ha avuto esito positivo, immettere sì per scattare un'istantanea della cella lisata.Successivamente, il microcapillare si sposta nella posizione endo, immerso nel liquido del serbatoio. Lasciare il microcapillare immerso per otto-12 minuti, a seconda della geometria dell'ugello. Quindi, erogare cinque nanolitri del lisato cellulare condizionato sulla griglia.Prelevare il microcapillare e lasciare asciugare lentamente il campione condizionato su una fase del punto di rugiada. Infine, rimuovere la griglia dal tavolino e conservarla a temperatura ambiente in una scatola a griglia. Di seguito sono mostrate le tipiche immagini criogeniche di campioni congelati utilizzando la configurazione CryoWriter descritta.Nella panoramica della griglia, la periferia del ghiaccio vitreo può essere vista chiaramente. Dopo un esame più attento di una fessura della griglia con la pellicola di carbonio forata contenente ghiaccio vetroso, si possono trovare buchi bianchi, indicando che non tutti i fori sono stati riempiti con il tampone del campione. In uno dei campioni contenenti fori di carbonio, la coda di un batteriofago può essere vista chiaramente con dettaglio.Utilizzando la configurazione CryoWriter per eseguire la proteomica visiva su singola cellula, è possibile vedere cose come singole proteine, ad esempio actina filamentosa e patch di membrana con proteine attaccate. L'immagine che si può vedere nel pannello 6b è colorata negativamente con una colorazione negativa al 2%, basata su un composto organotungsteno. Il pannello c mostra un lisato a cellula singola preparato per la crioterapia EM. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare griglie negative con colorazione negativa o crioEM, da volumi totali di nanolitri di campioni proteici o estratti di singole cellule.Non dimenticare che lavorare con etano liquido e azoto può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio, eseguendo questa procedura.

miniaturized-sample-preparation-for-transmission-electron-microscopy

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Cryo Electron Microscopi, sia a scansione (SEM) o trasmissione (TEM), sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione di campioni biologici o di altri materiali con un elevato contenuto di acqua 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) viene utilizzato per identificare le caratteristiche di interesse in campioni ed estrarre una lamella sottile elettrone-trasparente per il trasferimento ad un crio-TEM.

Cryo-microscopia elettronica Preparazione del campione per mezzo di un Focused Ion Beam

Qui, presentiamo un protocollo per preparare campioni con un basso numero di cellule per l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM).

Un approccio alternativo per la preparazione del campione con un basso numero di cellule per l&#39;analisi TEM

Questo rapporto descrive un protocollo di preparazione del campione e condizioni di imaging specifiche per eseguire la tomografia elettronica a scansione di trasmissione di campioni biologici spessi.

Preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da Scanning Transmission Electron Tomografia

Questo studio presenta procedure affidabili e facili per ottenere sezioni ultrasottili seriale di un microorganismo senza costose attrezzature in microscopia elettronica di trasmissione.

Un metodo per ottenere il seriale sezioni ultrasottili di microrganismi in microscopia elettronica a trasmissione

Questo protocollo descrive le varie tecniche necessarie per microscopia elettronica di trasmissione tra cui macchiatura negativa, sezionamento ultrasottile per struttura dettagliata e immuno-oro etichettatura per determinare le posizioni di specifiche proteine in esosomi.

Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

Qui presentiamo un protocollo per la combinazione di due tecniche di elaborazione del campione, ad alta pressione congelamento e trattamento dei campioni assistita da microonde, seguita da minima resina incorporamento per l'acquisizione di dati con un microscopio elettronico a scansione di fascio ionico focalizzato (FIB-SEM). Questo è dimostrato utilizzando un mouse del nervo tibial campione e Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

Questo rapporto fornisce una nuova procedura di preparazione del campione per la visualizzazione delle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila . Questo metodo è più efficace nel prevenire l'arricciamento dei campioni rispetto al metodo tradizionale ed è particolarmente utile per l'analisi ultrastrutturale della giunzione neuromuscolare della Drosophila .

Ottimizzazione del processo di preparazione dei campioni per la microscopia elettronica a trasmissione delle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila

Questo protocollo presenta un metodo pratico che utilizza Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) come esempio per affrontare la distribuzione irregolare delle particelle attraverso l'ottimizzazione della preparazione del campione, fornendo un riferimento per i ricercatori per chiarire in modo efficiente le strutture macromolecolari utilizzando la microscopia elettronica criogenica (cryo-EM).

Ottimizzazione della preparazione dei campioni per la microscopia elettronica criogenica

Questo protocollo video illustra come eseguire la tomografia al microscopio elettronico a scansione a trasmissione di campioni virologici. Per ottenere risultati ottimali, i campioni vengono preparati mediante congelamento ad alta pressione e successiva sostituzione con congelamento.

Tomografia al microscopio elettronico a scansione a trasmissione in virologia: imaging 3D di campioni congelati ad alta pressione, liofilizzati

Descriviamo un processo di fissazione, inclusione, sezionamento, e l'imaging di stadio...

Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

Impara la preparazione miniaturizzata di campioni per microscopia elettronica a trasmissione senza carta assorbente. Questa tecnica riduce la perdita del campione e consente l'analisi di lisati di singole cellule per proteomica visuale.

Preparazione del campione miniaturizzati per microscopia elettronica di trasmissione

Esplora altri video