Preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da Scanning Transmission Electron Tomografia

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere una ricostruzione tridimensionale con recupero della profondità di campo di un campione biologico spesso utilizzando la tomografia elettronica a trasmissione a scansione a fascio convergente. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della biologia strutturale sulla tomografia elettronica di campioni biologici spessi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le immagini possono essere acquisite in modalità bit convergente e l'elaborazione dei dati può essere eseguita sulla maggior parte dei software dedicati alla tomografia.

Per iniziare a preparare il campione di coltura cellulare, centrifugare il campione a 5000 x g per cinque minuti. Utilizzare questi parametri di centrifugazione durante la preparazione del campione. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di PBS arricchito con il 4% di paraformaldeide e il 2% di gluteraldeide.

Incubare la sospensione per 30 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la miscela, scartare il surnatante e lavare il pellet tre volte con porzioni da un millilitro di PBS. Utilizzando le stesse condizioni di incubazione e procedura di lavaggio, incubare il pellet in un millilitro di PBS, arricchito con tetrossido di osmio all'1%, e in un millilitro di PBS arricchito con acetato di uranile al 2%.

Quindi, raffreddare il campione a quattro gradi Celsius. Disidratare il pellet mediante incubazioni successive in soluzioni di etanolo sempre più concentrate. Mantenimento della temperatura del campione di quattro gradi Celsius durante l'incubazione, la centrifugazione e il lavaggio.

Risospendere il pellet disidratato in un millilitro di etanolo puro e incubare per una notte a 4 gradi Celsius. Quindi, lasciare che il campione si riscaldi a temperatura ambiente e centrifugare il campione. Incubare il pellet in soluzioni di resina epossidica sempre più concentrate a temperatura ambiente.

Dopo il lavaggio finale, risospendere il pellet in un millilitro di resina epossidica pura e incubare per una notte a temperatura ambiente. Centrifugare il campione e rimuovere il surnatante, quindi risospendere il pellet in 200 microlitri di resina epossidica e indurente. Trasferire la sospensione nella capsula.

Incubare la capsula di plastica a 60 gradi Celsius per 48 ore per polimerizzare la resina. Rimuovere la capsula dall'incubatore e verificare la polimerizzazione della resina. Aggiungere uno strato di resina epossidica e indurente sul campione incorporato e incubare nuovamente la capsula nelle stesse condizioni.

Montare il campione incorporato nella resina capovolto in un portacampioni. Fissare saldamente il campione sul blocco di rifilatura di un ultramicrotomo. Tagliare la capsula di plastica dal campione nella resina.

Modellare la resina esposta in una piramide. Quindi trasferire la capsula e il supporto del campione sul braccio mobile dell'ultramicrotomo. Installa un coltello da taglio e, guidato da un microscopio, affina la forma piramidale.

Sostituire il coltello da taglio con un coltello per istologia. Al microscopio, regolare l'angolo di inclinazione della capsula in modo che la piramide sia perpendicolare al bordo del coltello. Impostare la velocità di taglio e sezionare il campione.

Dopo aver sezionato il campione, trasferire la sezione scelta su una griglia di rame trattata su carta da filtro. Lasciare asciugare il campione, quindi caricarlo nel microscopio elettronico. Per progettare la serie di inclinazione focale passante, calcolare prima la profondità di campo del fascio di elettroni e lo spessore apparente massimo del campione.

Sulla base di questi valori, selezionare un intervallo di messa a fuoco e determinare il numero di passi focali necessari per visualizzare l'intero campione allo spessore apparente massimo. Quindi, a basso ingrandimento, individuare la regione di interesse all'interno del campione. Regola l'altezza eucentrica in modo che la ROI non sembri muoversi quando il campione viene ruotato.

Verificare che il ROI rimanga visibile in tutto l'intervallo di inclinazione. Compila i parametri della serie di inclinazione focale passante per la raccolta automatizzata delle immagini e acquisisci le immagini. Importa la serie di immagini in un programma di elaborazione delle immagini e allinea le immagini raccolte con lo stesso angolo di inclinazione in una gerarchia piramidale.

Trova l'allineamento a ciascun angolo di inclinazione impilando le immagini allineate. Sfoglia lo stack per assicurarti che solo l'area messa a fuoco si sposti da un'immagine all'altra e riallinea le immagini secondo necessità. Una volta verificato l'allineamento in tutto il campione, unire le informazioni a fuoco con le impostazioni alte per ottenere la serie con una singola immagine per angolo di inclinazione.

Eseguire l'allineamento di ricerca della serie di inclinazione in base ai minimi locali o ai marcatori fiduciali. Eseguire una ricostruzione 3D e ispezionare l'immagine risultante. Se la ricostruzione appare sfocata o deformata, riallineare la serie di immagini originale.

Un campione di t. brucei è stato ripreso e analizzato utilizzando questo metodo. Con un angolo di inclinazione di zero gradi, sono visibili diversi dettagli della tasca flagellare.

Con l'angolo di inclinazione più alto di 70 gradi, solo una parte di ciascuna immagine raccolta nella serie focale passante è a fuoco. Questa posizione cambia nel corso della serie. Unendo le sezioni a fuoco, viene prodotta un'unica immagine con una zona a fuoco più ampia.

Questo effetto è ancora più pronunciato quando vengono evidenziate le aree ad alta frequenza della serie Through Focal Tilt. Le informazioni ad alta frequenza coprono la maggior parte dell'immagine combinata, indicando che la serie di inclinazione focale passante è stata elaborata bene. Una volta padroneggiata, la parte di elaborazione delle immagini può essere eseguita in circa tre o quattro ore, a seconda dei parametri di allineamento e ricostruzione scelti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la qualità della ricostruzione finale dipende in gran parte dalla qualità dei precedenti test di allineamento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la raccolta e l'elaborazione delle immagini di una serie di tilt focale passante.