Name: Preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da Scanning Transmission Electron Tomografia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Impara la preparazione di campioni biologici spessi per la tomografia elettronica a scansione in trasmissione. Questo metodo consente ricostruzioni tridimensionali con recupero della profondità di campo per la biologia strutturale.

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Questo lavoro è stato finanziato da due sovvenzioni ANR (ANR-11-BSV8-016 e ANR-10-IDEX-0001-02). Riconosciamo inoltre il PICT-IBiSA per aver fornito l'accesso alle apparecchiature di imaging chimico.

Attenzione: consultare le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) dei vari reagenti prima di utilizzarli. Molti dei prodotti chimici utilizzati durante la preparazione dei campioni sono tossiche, cancerogene, mutagene e / o tossiche per la riproduzione. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (guanti, camice, pantaloni full-length, e scarpe chiuse) e il lavoro sotto una cappa aspirante durante la manipolazione del campione. Sezionamento il campione con un ultramicrotomo prevede l&#39;utilizzo di strumenti appuntiti e attento uso di questi strumenti è obbligatorio. Nei passi descritti di seguito, gli autori assumono che il campione è un campione di coltura cellulare. Il protocollo può essere necessario modificare secondo il tipo di campione, soprattutto le fasi di centrifugazione. 1. Preparazione di buffer e delle miscele <ol><li> Preparare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, e 1,76 mM KH 2 PO 4). </li><li> Preparare soluzioni contenenti il ​​30%, 50% e 70% etHANOL in PBS per la disidratazione del campione. Eseguire campione disidratazione incubando gradualmente il campione in concentrazioni crescenti di etanolo. </li><li> Preparare resina epossidica mescolando bisfenolo-A- (epicloridrina) (20 mL), dodecenil anidride succinica (9 mL), metil-5-norbornene-2,3-dicarbossilico (11 mL), e 2,4,6-tris ( dimetilamminometil) fenolo (0,7 mL); altri rapporti di miscelazione possono essere utilizzate a seconda della durezza desiderata della resina. </li><li> Preparare soluzioni contenenti il ​​30%, 50%, e resina epossidica 70% in etanolo per incorporamento campione. Eseguire embedding resina incubando gradualmente il campione con concentrazioni crescenti di resina. NOTA: I volumi delle soluzioni preparate dipendono dal tipo di campione che viene studiato. Altre soluzioni sono necessarie per tessuti che per colture cellulari. </li></ol> 2. Fissazione e colorazione del campione <ol><li> Centrifugare la coltura cellulare per 5 minuti a 5000 x g. Eseguire tutte le seguenti centrifugazioni utilizzando le stesse condizioni.</li><li> Eliminare il supernatante e fissare il pellet cellulare da risospendere in PBS (1 mL) con 4% paraformaldeide e glutaraldeide al 2%. Incubare a temperatura ambiente per 30 min (Figura 1A). In alternativa, fissare le cellule a 4 ° C durante la notte o durante il fine settimana. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e lavare il pellet 3 volte con PBS (1 mL) per rimuovere completamente gli agenti fissativi. </li><li> Post-fissare il campione con 1% OsO 4 in PBS (1 mL) per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e lavare il pellet 3 volte con PBS (1 mL) per rimuovere completamente i OsO 4. Disattivare la OsO 4 in olio e degli scarti. </li><li> Aggiungere 2% acetato di uranile in PBS (1 mL) come agente di contrasto e incubare il campione per 30 minuti a temperatura ambiente (Figura 1B). </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e lavare il pellet 3 volte con PBS (1 mL) per rimuovere l&#39;ac uranile non legatoetate; acetato di uranile contiene elementi radioattivi e deve essere smaltito in un contenitore dedicato ai rifiuti radioattivi. NOTA: I tempi di incubazione può essere modificato a seconda delle dimensioni del campione. Ad esempio, la fissazione e la colorazione dei campioni più spessi, come i tessuti campioni, richiedono tempi di incubazione più lunghi. tempi di incubazione più lunghi possono anche essere meglio per la disidratazione e le fasi di incorporamento. acetato di uranile può essere sostituita da una soluzione &quot;uranile-less&quot;, che contiene sali di gadolinio. </li></ol> Disidratazione 3. Campione <ol><li> Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e incubare il campione per 30 minuti a 4 ° C in PBS (1 mL) con il 30% di etanolo (Figura 1C). </li><li> Ripetere il passaggio 3.1 utilizzando soluzioni con concentrazioni progressivamente crescenti di etanolo (50%, 70%, e fino al 100%). Durante queste fasi di disidratazione, di mantenere il campione a 4 ° C per scopi di conservazione del campione. </li><li> Dopo la centrifugazione, scartare il supernatformica e risospendere il pellet in etanolo puro (1 ml); incubare una notte a 4 ° C. </li></ol> 4. Resina Embedding <ol><li> Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in etanolo con resina epossidica 30% (1 ml) per 30 minuti a RT (Figura 1D). </li><li> Ripetere passaggio 4,1 utilizzando soluzioni con concentrazioni resina gradualmente crescente epossidiche (50%, 70% e fino al 100%). </li><li> Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in resina epossidica pura (1 mL); incubare una notte a temperatura ambiente. La presenza di indurimento DMP-30 potrebbe innescare la polimerizzazione della resina; Se questo accade, preparare due lotti di resina epossidica, con e uno senza DMP-30. </li><li> Dopo centrifugazione, risospendere il pellet in 200 ml di resina epossidica pura (contenente il catalizzatore) in una capsula di plastica; il campione deve essere in fondo della capsula in plastica. </li></ol> 5. Resina polimerizzazione <ol><li> ioncubate la capsula di plastica contenente il campione in un incubatore a 60 ° C per 48 h; altri tipi di resina possono polimerizzare con impostazioni diverse. </li><li> Rimuovere la capsula dal termostato e verificare che la resina è polimerizzata; la resina dovrebbe essere difficile se premuto contro una superficie dura. </li><li> Aggiungere resina epossidica pura (contenente il catalizzatore) sulla parte superiore della resina polimerizzata contenente il campione; questo strato aggiuntivo di resina sarà più facile per tagliare il campione. Incubare la capsula a 60 ° C per 48 h. </li></ol> Sezioni 6. Campione <ol><li> Montare il campione capovolto in un portacampioni in modo che il campione sia verso l&#39;alto e fissarlo sul blocco rifilatura del ultramicrotomo. chiudere strettamente la leva per fissare il blocco di taglio al ultramicrotomo. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio o simile strumento tagliente, tagliare la capsula di plastica per separarlo dalla resina polimerizzata. Tagliare la resina in modo che il campione sia contieneed in resina o meno nella forma di una piramide. Non vi è alcuna necessità di rimuovere l&#39;intera capsula di plastica; rimuovere solo la parte che copre il campione polimerizzato. </li><li> Prendete la capsula e il titolare del campione fuori del blocco di taglio e installarli sul braccio mobile del ultramicrotomo. </li><li> Installare un coltello taglio sul blocco coltello e tagliare con precisione le facce della piramide. Si consiglia l&#39;uso di un binocolo per dare una forma perfetta alla piramide; meglio piramide, meglio sezioni saranno. </li><li> Rimuovere la lama di taglio e sostituirlo con un coltello istologico che può essere usato per tagliare sezioni che sono più spessi di 0,5 micron. </li><li> Dopo aver riempito la cuvetta del coltello istologico con la giusta quantità di acqua, portare il tagliente del coltello alla superficie del campione e utilizzare le binocoli per regolare l&#39;angolo capsule passo in modo che il coltello taglierà perpendicolarmente alla piramide. </li><li> Regolare la velocità di taglio secondo l&#39;desiderataspessore della sezione per recuperare sezioni omogenee. </li><li> Sia il galleggiante sezione sull&#39;acqua e pesce con un ciclo. </li><li> Spostare il loop verso una griglia di rame microscopia elettronica che è stato posto sopra la carta filtro. NOTA: La griglia deve essere stato precedentemente trattato per aumentare la sua idrofilia. Questo può essere eseguito con una penna grid-rivestimento. </li><li> A causa di assorbimento di acqua dalla carta da filtro, lasciare che la sezione bastone alla rete. Lasciare asciugare per qualche minuto prima di inserirla nel microscopio elettronico. </li></ol> 7. Progettazione del Attraverso-focale Tilt-series <ol><li> Raccogliere immagini attraverso-focale a intervalli costanti di messa a fuoco. NOTA: L&#39;inclinazione serie passante focale consiste di una serie di immagini attraverso focali che sono raccolti ad ogni angolo di inclinazione del tilt-serie. Il fuoco intero ampiezza dovrebbe essere sufficiente a coprire tutto lo spessore del campione. </li><li> Determinare il valore dell&#39;intervallo di messa a fuoco. Se l&#39;intervallo è uguale al dapprofondito lavoro di campo, raccogliere l&#39;intero campione a fuoco; questa impostazione rappresenta il più alto campionamento possibile. Se l&#39;intervallo è maggiore della profondità di campo, alcune parti del campione non verranno acquisiti a fuoco, il che significa che alcune parti del campione non verranno raccolti a fuoco. </li><li> Calcolare la profondità di campo di un fascio di elettroni dalla lunghezza d&#39;onda del elettrone e la convergenza semi-angolo del fascio di elettroni. Considerando che la lunghezza d&#39;onda di elettroni è direttamente collegato alla tensione di accelerazione, utilizzare la convergenza semi-angolo fornito dal produttore microscopio elettronico o determinare sperimentalmente dal modello di diffrazione di un campione noto 16. Poiché elettroni accelerati ad una lunghezza d&#39;onda λ colpire il campione con una convergenza semi-angolo α in un microscopio elettronico, utilizzare la seguente equazione per determinare la profondità di campo-(DOF): <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq1.jpg" /></li><li> Designla serie focale, in modo che il fuoco intero ampiezza coprirà il campione a suo spessore apparente massimo (cioè, al massimo di inclinazione). NOTA: Un campione micron di spessore 0,75 avrà uno spessore apparente di 2.19 micron ad una inclinazione di 70 °, quindi l&#39;ampiezza attenzione dovrebbe essere maggiore di 2,19 micron. Per questo esempio, se l&#39;intervallo di messa a fuoco sopra determinato è pari a 50 nm, che richiederà 44 immagini (2.19 micron / 50 nm) per coprire il campione al suo spessore massimo apparente. Il fuoco intero ampiezza è uguale al valore dell&#39;intervallo fuoco moltiplicato per il numero di passaggi focali. Alla massima inclinazione (θ), lo spessore apparente campione è definito come segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq2.jpg" /></li></ol> Imaging 8. Campione NOTA: E &#39;oltre lo scopo di questo protocollo per descrivere come impostare un microscopio elettronico in modalità STEM; la maggior parte di queste informazioni si possono trovare in il manuale di riferimento fornito dal produttore microscopio elettronico. Tuttavia, tenere presente quanto segue: i) la dimensione del punto deve essere scelto in base alla ingrandimento desiderato; ii) il Ronchigram deve essere ben allineato; e iii) in modalità BF, la lunghezza telecamera deve essere regolata per selezionare elettroni unscattered pur mantenendo una buona illuminazione del rivelatore. sezioni resina depositati su griglie di rame di microscopia elettronica devono essere illuminati prima di acquisizione delle immagini per evitare il restringimento. ritiro in resina e gli effetti di ricarica potrebbero essere confusi durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. L&#39;uso di una apertura lente obiettivo potrebbe migliorare la stabilità di esempio quando si verificano effetti ricarica. Tuttavia, nel caso specifico delle configurazioni gambo, l&#39;apertura obiettivo non è compatibile con la modalità di imaging HAADF, e molto piccole aperture oggettivi non sono compatibili con la modalità di imaging BF. <ol><li> Utilizzando basso ingrandimento (circa 20,000X in STEM), sfogliare il campione e individuare la regione di interesse. </li><li> regolare tha eucentrica altezza (asse Z) in modo che la regione di interesse non allontanarsi durante la rotazione del campione. </li><li> Verificare che l&#39;oggetto di interesse rimarrà visibile su tutto il campo di inclinazione. </li><li> A causa del consistente numero di immagini acquisite nel corso di un passante focale tilt-serie, utilizzare un software automatico di raccolta. Utilizzare una soluzione commerciale o di progettare un software di raccolta dati personalizzati se lo si desidera. Verificare che il programma software è in grado di eseguire le seguenti tre fasi: <ol><li> Traccia e mettere a fuoco come in un sistema di raccolta tilt-serie standard. </li><li> Assicurarsi che le immagini attraverso-focale sovrappongono con la Z-posizione del campione. </li><li> acquisire automaticamente una serie di immagini attraverso focale ad ogni angolo di inclinazione. </li></ol></li><li> Dare il programma software i principali parametri del tilt-serie attraverso-focale (ovvero, gli intervalli di focale, passo focale, angolo minimo di inclinazione, angolo di inclinazione massima, passo inclinazione e velocità di scansione). </li><li> Inizioil processo di raccolta di immagini e attendere che il programma software per terminare. </li></ol> Processing 9. Immagine NOTA: In questo protocollo, il trattamento attraverso focale tilt-serie è eseguita utilizzando ImageJ plug-17. Supplementare dei dati 1 mostra una macro ImageJ per la fase di allineamento (Turboreg) e per unire le informazioni di messa a fuoco (profondità di campo estesa) per un tilt-serie attraverso focale progettato con tre valori di messa a fuoco. <ol><li> Allineare le immagini raccolte con lo stesso angolo di inclinazione (ad esempio, le immagini attraverso-focale). Dal momento che le immagini non hanno le stesse informazioni di messa a fuoco, non porto le stesse caratteristiche di allineamento; eseguire l&#39;allineamento allineando immagini adiacenti a due a due (cioè, dopo una gerarchia piramidale, con i valori di messa a fuoco più vicini prime) utilizzando Turboreg 18, un plugin ImageJ. </li><li> Coerentemente verificare l&#39;allineamento delle immagini attraverso focali ad ogni angolo di inclinazione.Stack i allineate immagini attraverso-focale per migliorare l&#39;ispezione visiva. NOTA: solo la zona che è a fuoco dovrebbe muoversi durante la navigazione attraverso lo stack. allineamento accurato è la cosa più importante, poiché il passo successivo consiste nel recupero delle informazioni che è a fuoco da diverse immagini. </li><li> Unire le informazioni che è a fuoco con profondità di campo estesa 19, un plugin ImageJ; questo puo &#39;generare una singola immagine dalla pila di immagini. Diverse impostazioni possono essere utilizzati durante il recupero della profondità di campo, ma utilizzano le impostazioni più alte per preservare le informazioni dell&#39;immagine. NOTA: L&#39;inclinazione-serie è ora composta da una singola immagine per angolo di inclinazione, ogni immagine contenente le informazioni in-focus recuperato dalle immagini attraverso focali. </li><li> Elaborare i dati. NOTA: Gli strumenti standard per l&#39;allineamento e la ricostruzione può essere utilizzato in quanto i dati ora è stato ridotto a un tilt-serie standard. In questo protocollo, TomoJ noi èEd per l&#39;allineamento dei dati e la ricostruzione dei dati 20, 21. Maggiori informazioni su come utilizzare TomoJ possono essere trovati nella pubblicazione originale 22. </li><li> Eseguire bene allineamento del tilt-serie. NOTA: Una buona strategia è quella di utilizzare oro perle come marcatori fiduciali di monitorare con precisione spostamenti tra le immagini. minimi locali può essere utilizzata anche se perline oro non possono essere aggiunte al campione. </li><li> Eseguire una ricostruzione in 3D dei dati allineati; diversi algoritmi sono disponibili per eseguire le ricostruzioni nello spazio reale o spazio di Fourier, ciascuno con vantaggi e limitazioni. </li><li> Se l&#39;allineamento finale del tilt-serie è povero, apportare alcuni miglioramenti, ottimizzando le fasi iniziali. Ribadire le fasi di allineamento se la ricostruzione 3D finale appare sfuocata o deformata; in pratica, maggiore è il numero di piani focali raccolti, migliore è il contrasto e dettagli della ricostruzione 3D. NOTA: Seprogrammi software veral possono essere utilizzati per elaborare il passante focale tilt-serie. Tuttavia, gli strumenti utilizzati in questo protocollo sono stati scelti perché, nella nostra esperienza, si sono esibiti i migliori. Turboreg 18 risultati migliori in termini di allineare le immagini quando un gradiente di concentrazione era presente. Maggiori informazioni possono essere trovate sul sito dedicato 23. La profondità di campo estesa plug-19 è comportato molto bene in termini di recupero delle informazioni di messa a fuoco da diverse immagini, mentre altri strumenti provocato pixel visibili modifiche. Maggiori informazioni, soprattutto per quanto riguarda la scrittura di script, si possono trovare su questo sito web dedicato 24. </li></ol>

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<li>Dahmen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ettention+software+package%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The Ettention software package.</a> Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).</li>
<li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li>
<li>Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+electron+microscopy+for+serial+image+acquisition+of+neuronal+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles.</a> Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).</li>
<li>Levin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterial+datasets+to+advance+tomography+in+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy.</a> Sci Data. 3, 160041(2016).</li>
</ol>

Non abbiamo alcun conflitto di interessi da rivelare.

In questo articolo, vi presentiamo un protocollo convenzionale preparazione del campione insieme a una guida passo-passo per l&#39;esecuzione di analisi 3D su campioni biologici spessi usando STEM attraverso focale tomografia. Resina incasso di campioni biologici è stato utilizzato per decenni 26 e protocolli alternativi che si adattano a diversi tipi di campioni si trovano in tutta la letteratura 27. Al contrario, di imaging campioni spessi in staminali utilizzando metodi...

Dall&#39;inizio degli anni 1970, tomografia avvicina in microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono stati ampiamente utilizzati per la caratterizzazione strutturale di campioni biologici 1, 2, 3. Il ricorso della tomografia elettronica a trasmissione era che potrebbe essere utilizzata per studiare una vasta gamma di strutture biologiche su scala nanometrica, dall&#39;architettura delle cellule e l&#39;ultrastruttura di organelli alla struttura di complessi macromolecolari e proteine. Tuttavia, tomografia elettronica a trasmissione non può essere usato per studiare campioni molto spessi (superiore a 0,5 micron). In effetti, i campioni di spessore producono troppi elettroni sparsi, generando basso rapporto segnale-rumore (SNR) immagini. Inoltre, tomografia comporta la raccolta di immagini di campioni inclinati, con lo spessore apparente del campione aumenta con l&#39;angolo di inclinazione. Anche se scattering anelastico può essere filtratautilizzando filtri di energia, la quantità critica di elettroni necessari per le immagini ad alta SNR è a malapena raggiunto in TEM. Quindi, campioni biologici di spessore sono stati studiati solo mediante sezionamento 4. Alcuni campioni non possono essere tagliati: alcuni potrebbero deteriorarsi se non vengono tagliati, e gli altri devono essere studiati nella loro interezza al fine di comprendere la loro complessità. Un approccio alternativo consiste nell&#39;utilizzare TEM in modalità 5, 6, 7, 8 scansione. In scansione microscopia elettronica a trasmissione (STEM), il percorso ottico degli elettroni è diversa da quella in TEM convenzionale. Gli elettroni che passano attraverso il campione senza dispersione possono essere raccolti sull&#39;asse ottico con un rivelatore 9 campo chiaro (BF), mentre quelli sparsi elasticamente possono essere raccolti in un certo angolo rispetto all&#39;asse ottico con un rivelatore di campo scuro (DF).L&#39;altro vantaggio di STEM è che il fascio elettronico focalizzato viene scansionato alla superficie del campione, consentendo la raccolta di pixel-per-pixel delle immagini. Anche se il fascio elettronico allarga mentre passa attraverso il campione 10, questo particolare sistema di raccolta è meno sensibile agli elettroni anelasticamente sparsi rispetto TEM convenzionale. Inoltre, non vi è nessun obiettivo post-campione in STEM, evitando le aberrazioni cromatiche che possono verificarsi in TEM. La lunghezza telecamera può essere regolata in modo che il rilevatore BF rileva principalmente elettroni unscattered. Utilizzando il rilevatore di DF per studiare campioni di spessore non è raccomandato a causa di scattering multiplo, che produce immagini imprecise. Invece, il rivelatore BF può essere utilizzato 11. Mentre staminali possono produrre alti immagini SNR, ha una relativamente bassa profondità di campo per la convergenza relativamente elevato fascio rispetto al TEM, diminuendo la quantità di informazioni approfondite che possono essere recuperate da spessaesemplari. Nel caso di microscopi STAMINALI aberrazione-corretto, in cui l&#39;angolo di convergenza può essere alto come 30 mrad, la profondità di campo-può essere sufficientemente bassa in modo che le informazioni che è a fuoco proviene da un piano focale di solo pochi nanometri . Impostazione del fascio di elettroni in modo parallelo aumenta la profondità di campo del fascio di elettroni a scapito della risoluzione 12. Tuttavia, questa configurazione non è sempre possibile. Qualora sia necessario utilizzare un fascio convergente di elettroni, si dovranno impiegare tecniche che esaltano la profondità di campo del fascio elettronico studiando campioni spessi. Recenti studi hanno riportato l&#39;acquisizione di immagini multiple in diversi piani focali per tutto il campione di recuperare la massima quantità di informazioni di messa a fuoco 13, 14. I due studi descrivono modi diversi per gestire le informazioni dai diversi piani focali. Hovden et al.combinati nello spazio di Fourier le immagini che sono stati raccolti in diversi piani focali, e la ricostruzione finale è stato ottenuto direttamente dalla inversa 3D trasformata di Fourier 13. Al contrario, Dahmen et al. sviluppato un motore ricostruzione fascio convergente ricostruire nello spazio reale volume 3D dai vari piani focali 14. Il nostro laboratorio ha anche sviluppato un metodo per l&#39;imaging campioni biologici spessi. La nostra strategia era diverso dai due metodi descritti in precedenza in quanto ci siamo fusi l&#39;informazione che è a fuoco nei vari piani focali e ricostruito il volume 3D finale nello spazio reale utilizzando un proiettore fascio parallelo 15. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo che può essere facilmente eseguito in qualsiasi laboratorio di microscopia elettronica. A questo scopo, abbiamo voluto raccogliere le immagini focali in una quantità limitata di tempo, paragonabile al lasso di tempo di esperimenti tomografia convenzionali. Inoltre, il metodo proposto could essere adattato per l&#39;uso con differenti tipi di allineamento e software di ricostruzione. Nel contesto della nostra pubblicazione dal 2015 15, volevamo visualizzare e caratterizzare il recupero della profondità di campo, quindi abbiamo usato una grande convergenza semi-angolo di 25 mrad. Qui, vi presentiamo un protocollo step-by-step per l&#39;esecuzione tramite-focale di imaging in STEM secondo il metodo messo a punto nel nostro laboratorio nel 2015 15, e presentiamo come i dati a partire dal 2015 è stato elaborato. Questo metodo recupera informazioni a fuoco da diversi piani focali tutta una (750 nm) campione biologico spessore e permette ricostruzioni 3D di alta qualità. Se del caso, vengono anche presentate le differenze in questa metodologia rispetto i metodi utilizzati da altri gruppi.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Resina epossidica</td><td>EMS</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Aggiungere polvere di paraformaldeide al PBS riscaldato a circa 60 °C. Aumentare il pH aggiungendo 1 N di NaOH fino a quando non è visibile la polvere di PFA.</td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Capsula di gelatina</td><td>EMS</td><td>70110</td><td></td></tr><tr><td>Coltelli per rifilatura e histo</td> Coltelli diamantati per <td>diatomee</td><td></td><td>di distribuzione LFG</td></tr><tr><td>Griglia per microscopia elettronica Penna</td> per rivestimento a <td></td><td>griglia LFG G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Distribuzione LFG</td><td>70624</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per campioni</td><td>JEOL</td><td>EM-21311 Microscopio elettronico HTR</td><td></td></tr><tr><td></td><td>JEOL</td><td>JEM-2200FS</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da scanning transmission electron tomografia

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Questo rapporto descrive un protocollo per preparare campioni biologici spessi per ulteriori osservazioni utilizzando un microscopio elettronico a scansione di trasmissione. Descrive inoltre un metodo di imaging per lo studio della struttura 3D di campioni biologici spessi mediante tomografia elettronica a scansione a trasmissione. Il protocollo di preparazione del campione si basa su metodi convenzionali in cui il campione viene fissato utilizzando agenti chimici, trattato con un agente di contrasto al sale di atomi pesanti, disidratato in una serie di bagni di etanolo e incorporato nella resina. Vengono quindi descritte le condizioni di imaging specifiche per l'osservazione di campioni spessi mediante microscopia elettronica a trasmissione a scansione. Le sezioni del campione vengono osservate utilizzando un metodo di messa a fuoco passante che prevede la raccolta di diverse immagini su vari piani focali. Ciò consente il recupero di informazioni a fuoco a varie altezze in tutto il campione. Questo particolare modello di raccolta viene eseguito ad ogni angolo di inclinazione durante la raccolta dei dati della tomografia. Viene quindi generata una singola immagine, unendo le informazioni a fuoco provenienti da tutti i diversi piani focali. Viene quindi generato un classico set di dati della serie tilt. Il vantaggio del metodo è che l'allineamento e la ricostruzione in serie di inclinazione possono essere eseguiti utilizzando strumenti standard. La raccolta di immagini attraverso la focale consente la ricostruzione di un volume 3D che contiene tutti i dettagli strutturali del campione a fuoco.

Nel nostro studio, gli elettroni sono stati accelerati a 200 kV nel microscopio elettronico a trasmissione pistola emissione di campo. Le immagini sono state raccolte in modalità STEM BF utilizzando un tempo di sosta di 20 ms. Per quanto riguarda il disegno del tilt-serie passante focale, abbiamo riscontrato che gli intervalli di messa a fuoco di 150 nm hanno dato risultati soddisfacenti per lo studio ultrastrutturale di un campione, anche se la profondità di campo-del fascio di elettron...

Questo rapporto descrive un protocollo di preparazione del campione e condizioni di imaging specifiche per eseguire la tomografia elettronica a scansione di trasmissione di campioni biologici spessi.

Preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da Scanning Transmission Electron Tomografia

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere una ricostruzione tridimensionale con recupero della profondità di campo di un campione biologico spesso utilizzando la tomografia elettronica a trasmissione a scansione a fascio convergente. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della biologia strutturale sulla tomografia elettronica di campioni biologici spessi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le immagini possono essere acquisite in modalità bit convergente e l'elaborazione dei dati può essere eseguita sulla maggior parte dei software dedicati alla tomografia.Per iniziare a preparare il campione di coltura cellulare, centrifugare il campione a 5000 x g per cinque minuti. Utilizzare questi parametri di centrifugazione durante la preparazione del campione. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di PBS arricchito con il 4% di paraformaldeide e il 2% di gluteraldeide.Incubare la sospensione per 30 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la miscela, scartare il surnatante e lavare il pellet tre volte con porzioni da un millilitro di PBS. Utilizzando le stesse condizioni di incubazione e procedura di lavaggio, incubare il pellet in un millilitro di PBS, arricchito con tetrossido di osmio all'1%, e in un millilitro di PBS arricchito con acetato di uranile al 2%.Quindi, raffreddare il campione a quattro gradi Celsius. Disidratare il pellet mediante incubazioni successive in soluzioni di etanolo sempre più concentrate. Mantenimento della temperatura del campione di quattro gradi Celsius durante l'incubazione, la centrifugazione e il lavaggio.Risospendere il pellet disidratato in un millilitro di etanolo puro e incubare per una notte a 4 gradi Celsius. Quindi, lasciare che il campione si riscaldi a temperatura ambiente e centrifugare il campione. Incubare il pellet in soluzioni di resina epossidica sempre più concentrate a temperatura ambiente.Dopo il lavaggio finale, risospendere il pellet in un millilitro di resina epossidica pura e incubare per una notte a temperatura ambiente. Centrifugare il campione e rimuovere il surnatante, quindi risospendere il pellet in 200 microlitri di resina epossidica e indurente. Trasferire la sospensione nella capsula.Incubare la capsula di plastica a 60 gradi Celsius per 48 ore per polimerizzare la resina. Rimuovere la capsula dall'incubatore e verificare la polimerizzazione della resina. Aggiungere uno strato di resina epossidica e indurente sul campione incorporato e incubare nuovamente la capsula nelle stesse condizioni.Montare il campione incorporato nella resina capovolto in un portacampioni. Fissare saldamente il campione sul blocco di rifilatura di un ultramicrotomo. Tagliare la capsula di plastica dal campione nella resina.Modellare la resina esposta in una piramide. Quindi trasferire la capsula e il supporto del campione sul braccio mobile dell'ultramicrotomo. Installa un coltello da taglio e, guidato da un microscopio, affina la forma piramidale.Sostituire il coltello da taglio con un coltello per istologia. Al microscopio, regolare l'angolo di inclinazione della capsula in modo che la piramide sia perpendicolare al bordo del coltello. Impostare la velocità di taglio e sezionare il campione.Dopo aver sezionato il campione, trasferire la sezione scelta su una griglia di rame trattata su carta da filtro. Lasciare asciugare il campione, quindi caricarlo nel microscopio elettronico. Per progettare la serie di inclinazione focale passante, calcolare prima la profondità di campo del fascio di elettroni e lo spessore apparente massimo del campione.Sulla base di questi valori, selezionare un intervallo di messa a fuoco e determinare il numero di passi focali necessari per visualizzare l'intero campione allo spessore apparente massimo. Quindi, a basso ingrandimento, individuare la regione di interesse all'interno del campione. Regola l'altezza eucentrica in modo che la ROI non sembri muoversi quando il campione viene ruotato.Verificare che il ROI rimanga visibile in tutto l'intervallo di inclinazione. Compila i parametri della serie di inclinazione focale passante per la raccolta automatizzata delle immagini e acquisisci le immagini. Importa la serie di immagini in un programma di elaborazione delle immagini e allinea le immagini raccolte con lo stesso angolo di inclinazione in una gerarchia piramidale.Trova l'allineamento a ciascun angolo di inclinazione impilando le immagini allineate. Sfoglia lo stack per assicurarti che solo l'area messa a fuoco si sposti da un'immagine all'altra e riallinea le immagini secondo necessità. Una volta verificato l'allineamento in tutto il campione, unire le informazioni a fuoco con le impostazioni alte per ottenere la serie con una singola immagine per angolo di inclinazione.Eseguire l'allineamento di ricerca della serie di inclinazione in base ai minimi locali o ai marcatori fiduciali. Eseguire una ricostruzione 3D e ispezionare l'immagine risultante. Se la ricostruzione appare sfocata o deformata, riallineare la serie di immagini originale.Un campione di t. brucei è stato ripreso e analizzato utilizzando questo metodo. Con un angolo di inclinazione di zero gradi, sono visibili diversi dettagli della tasca flagellare.Con l'angolo di inclinazione più alto di 70 gradi, solo una parte di ciascuna immagine raccolta nella serie focale passante è a fuoco. Questa posizione cambia nel corso della serie. Unendo le sezioni a fuoco, viene prodotta un'unica immagine con una zona a fuoco più ampia.Questo effetto è ancora più pronunciato quando vengono evidenziate le aree ad alta frequenza della serie Through Focal Tilt. Le informazioni ad alta frequenza coprono la maggior parte dell'immagine combinata, indicando che la serie di inclinazione focale passante è stata elaborata bene. Una volta padroneggiata, la parte di elaborazione delle immagini può essere eseguita in circa tre o quattro ore, a seconda dei parametri di allineamento e ricostruzione scelti.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la qualità della ricostruzione finale dipende in gran parte dalla qualità dei precedenti test di allineamento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la raccolta e l'elaborazione delle immagini di una serie di tilt focale passante.

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La tomografia crio-STEM fornisce un mezzo per visualizzare organelli di cellule intatte senza incorporamento, sezionamento o altre preparazioni invasive. La risoluzione 3D ottenuta è attualmente nell'intervallo di pochi nanometri, con un campo visivo di diversi micrometri e uno spessore accessibile nell'ordine di 1 μm.

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