Preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da Scanning Transmission Electron Tomografia
12 marzo 2017
Questo rapporto descrive un protocollo di preparazione del campione e condizioni di imaging specifiche per eseguire la tomografia elettronica a scansione di trasmissione di campioni biologici spessi.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere una ricostruzione tridimensionale con recupero della profondità di campo di un campione biologico spesso utilizzando la tomografia elettronica a trasmissione a scansione a fascio convergente. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della biologia strutturale sulla tomografia elettronica di campioni biologici spessi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le immagini possono essere acquisite in modalità bit convergente e l'elaborazione dei dati può essere eseguita sulla maggior parte dei software dedicati alla tomografia.
Per iniziare a preparare il campione di coltura cellulare, centrifugare il campione a 5000 x g per cinque minuti. Utilizzare questi parametri di centrifugazione durante la preparazione del campione. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di PBS arricchito con il 4% di paraformaldeide e il 2% di gluteraldeide.
Incubare la sospensione per 30 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la miscela, scartare il surnatante e lavare il pellet tre volte con porzioni da un millilitro di PBS. Utilizzando le stesse condizioni di incubazione e procedura di lavaggio, incubare il pellet in un millilitro di PBS, arricchito con tetrossido di osmio all'1%, e in un millilitro di PBS arricchito con acetato di uranile al 2%.
Quindi, raffreddare il campione a quattro gradi Celsius. Disidratare il pellet mediante incubazioni successive in soluzioni di etanolo sempre più concentrate. Mantenimento della temperatura del campione di quattro gradi Celsius durante l'incubazione, la centrifugazione e il lavaggio.
Risospendere il pellet disidratato in un millilitro di etanolo puro e incubare per una notte a 4 gradi Celsius. Quindi, lasciare che il campione si riscaldi a temperatura ambiente e centrifugare il campione. Incubare il pellet in soluzioni di resina epossidica sempre più concentrate a temperatura ambiente.
Dopo il lavaggio finale, risospendere il pellet in un millilitro di resina epossidica pura e incubare per una notte a temperatura ambiente. Centrifugare il campione e rimuovere il surnatante, quindi risospendere il pellet in 200 microlitri di resina epossidica e indurente. Trasferire la sospensione nella capsula.
Incubare la capsula di plastica a 60 gradi Celsius per 48 ore per polimerizzare la resina. Rimuovere la capsula dall'incubatore e verificare la polimerizzazione della resina. Aggiungere uno strato di resina epossidica e indurente sul campione incorporato e incubare nuovamente la capsula nelle stesse condizioni.
Montare il campione incorporato nella resina capovolto in un portacampioni. Fissare saldamente il campione sul blocco di rifilatura di un ultramicrotomo. Tagliare la capsula di plastica dal campione nella resina.
Modellare la resina esposta in una piramide. Quindi trasferire la capsula e il supporto del campione sul braccio mobile dell'ultramicrotomo. Installa un coltello da taglio e, guidato da un microscopio, affina la forma piramidale.
Sostituire il coltello da taglio con un coltello per istologia. Al microscopio, regolare l'angolo di inclinazione della capsula in modo che la piramide sia perpendicolare al bordo del coltello. Impostare la velocità di taglio e sezionare il campione.
Dopo aver sezionato il campione, trasferire la sezione scelta su una griglia di rame trattata su carta da filtro. Lasciare asciugare il campione, quindi caricarlo nel microscopio elettronico. Per progettare la serie di inclinazione focale passante, calcolare prima la profondità di campo del fascio di elettroni e lo spessore apparente massimo del campione.
Sulla base di questi valori, selezionare un intervallo di messa a fuoco e determinare il numero di passi focali necessari per visualizzare l'intero campione allo spessore apparente massimo. Quindi, a basso ingrandimento, individuare la regione di interesse all'interno del campione. Regola l'altezza eucentrica in modo che la ROI non sembri muoversi quando il campione viene ruotato.
Verificare che il ROI rimanga visibile in tutto l'intervallo di inclinazione. Compila i parametri della serie di inclinazione focale passante per la raccolta automatizzata delle immagini e acquisisci le immagini. Importa la serie di immagini in un programma di elaborazione delle immagini e allinea le immagini raccolte con lo stesso angolo di inclinazione in una gerarchia piramidale.
Trova l'allineamento a ciascun angolo di inclinazione impilando le immagini allineate. Sfoglia lo stack per assicurarti che solo l'area messa a fuoco si sposti da un'immagine all'altra e riallinea le immagini secondo necessità. Una volta verificato l'allineamento in tutto il campione, unire le informazioni a fuoco con le impostazioni alte per ottenere la serie con una singola immagine per angolo di inclinazione.
Eseguire l'allineamento di ricerca della serie di inclinazione in base ai minimi locali o ai marcatori fiduciali. Eseguire una ricostruzione 3D e ispezionare l'immagine risultante. Se la ricostruzione appare sfocata o deformata, riallineare la serie di immagini originale.
Un campione di t. brucei è stato ripreso e analizzato utilizzando questo metodo. Con un angolo di inclinazione di zero gradi, sono visibili diversi dettagli della tasca flagellare.
Con l'angolo di inclinazione più alto di 70 gradi, solo una parte di ciascuna immagine raccolta nella serie focale passante è a fuoco. Questa posizione cambia nel corso della serie. Unendo le sezioni a fuoco, viene prodotta un'unica immagine con una zona a fuoco più ampia.
Questo effetto è ancora più pronunciato quando vengono evidenziate le aree ad alta frequenza della serie Through Focal Tilt. Le informazioni ad alta frequenza coprono la maggior parte dell'immagine combinata, indicando che la serie di inclinazione focale passante è stata elaborata bene. Una volta padroneggiata, la parte di elaborazione delle immagini può essere eseguita in circa tre o quattro ore, a seconda dei parametri di allineamento e ricostruzione scelti.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la qualità della ricostruzione finale dipende in gran parte dalla qualità dei precedenti test di allineamento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la raccolta e l'elaborazione delle immagini di una serie di tilt focale passante.
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Panoramica
Questo rapporto descrive un protocollo di preparazione del campione e condizioni di imaging specifiche per eseguire la tomografia elettronica a trasmissione di scansione di campioni biologici spessi. Il metodo mira a ottenere una ricostruzione tridimensionale con recupero del campo di profondità, affrontando questioni chiave nella biologia strutturale.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Biologia strutturale
- Tomografia elettronica
- Tecniche di preparazione del campione
Sfondo
- La tomografia elettronica a trasmissione di scansione a fascio convergente viene utilizzata per l'imaging di campioni biologici spessi.
- Questa tecnica consente il recupero del campo di profondità nelle ricostruzioni tridimensionali.
- Fornisce informazioni sull'organizzazione strutturale dei campioni biologici.
- L'elaborazione dei dati può essere eseguita utilizzando software di tomografia standard.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo di preparazione del campione affidabile per la tomografia elettronica.
- Migliorare le tecniche di imaging per campioni biologici spessi.
- Facilitare ricostruzioni tridimensionali che possono informare la ricerca in biologia strutturale.
Metodi utilizzati
- Centrifugazione dei campioni di coltura cellulare a 5000 x g per cinque minuti.
- Risospensione delle cellule in PBS con 4% di paraformaldeide e 2% di glutaraldeide.
- Applicazione di condizioni di imaging specifiche per la tomografia elettronica.
- Utilizzo della modalità a fascio convergente per l'acquisizione dell'immagine.
Principali risultati
- Preparazione riuscita dei campioni per la tomografia elettronica a trasmissione di scansione.
- Dimostrazione del recupero del campo di profondità nelle ricostruzioni tridimensionali.
- Acquisizione di immagini di alta qualità adatte per l'analisi strutturale.
- Validazione del metodo per rispondere a questioni chiave nella biologia strutturale.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato è efficace per la preparazione di campioni biologici spessi.
- La tomografia elettronica a trasmissione di scansione a fascio convergente migliora le capacità di imaging.
- Questo metodo può contribuire significativamente alla ricerca in biologia strutturale.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables high-resolution 3D imaging of thick biological specimens, supporting structural biology research in drug target characterization and mechanism of action studies. By recovering depth of field through through-focal tilt series, it improves data quality for complex samples that challenge conventional electron microscopy. The approach enhances predictive confidence in target validation by providing detailed ultrastructural context for phenotypic observations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of subcellular architecture in native-like states to clarify target localization and pathway context.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating structural phenotypes with genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for correlative light and electron microscopy workflows to enrich assay readouts.
- Operational Value: Standardizes sample preparation for reproducible ultrastructural screening of compound-induced morphological changes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant ultrastructural detail to align with histopathological findings and biomarker studies.
- Operational Value: Enables mechanistic de-risking by visualizing target engagement effects on cellular architecture in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, offering structural insights that inform lead optimization and safety evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing target distribution and organelle remodeling in response to modulators.
- Screening: Delivers quantitative morphological outputs for high-content analysis of compound libraries in disease-relevant systems.
- Analytics: Generates 3D volumetric data enabling morphometric analysis and statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to tissue-level pathology through conserved ultrastructural phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for iterative structural characterization across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by providing direct visualization of structural consequences of modulation.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, contrasting, and embedding protocols compatible with core facility workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying off-target structural effects early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by delivering ultrastructural evidence for target specificity and safety margins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron microscopy sample preparation and tomography data collection.
- Dependent on access to scanning transmission electron microscopes with tomography holders and stable stages.
- Necessitates cross-team standardization between biology and imaging groups for consistent sample handling.
- Involves adaptation considerations for different cell types, tissue densities, and resin compatibility.
- Limited by sample thickness constraints and potential radiation sensitivity during prolonged tilt-series acquisition.
