Name: Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Scopri il metodo SPLASH per mappare le interazioni RNA-RNA in vivo su scala genomica. Questa tecnica ad alto rendimento utilizza psoralene biotinilato e sequenziamento per studiare lievito, batteri e cellule umane.

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Ringraziamo i membri del laboratorio di Wan e il laboratorio di Nagarajan per le discussioni informative. N.Nagarajan è supportato da finanziamenti da A * STAR. Y.Wan è sostenuto da finanziamenti da A * STAR e dalla Società in borsa Science-Branco Weiss.

<ol><li>Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+transcriptome+through+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Understanding the transcriptome through RNA structure.</a> Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).</li>
<li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Measurement+of+RNA+Folding+Energies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies.</a> Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).</li>
<li>Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+RNA+structure+using+nuclease+digestion+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing.</a> Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking%2C+ligation%2C+and+sequencing+of+hybrids+reveals+RNA-RNA+interactions+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).</li>
<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiCLIP+reveals+the+in+vivo+atlas+of+mRNA+secondary+structures+recognized+by+Staufen+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1.</a> Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+interactions+enable+specific+targeting+of+noncoding+RNAs+to+nascent+Pre-mRNAs+and+chromatin+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites.</a> Cell. 159 (1), 188-199 (2014).</li>
<li>Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+determination+of+RNA+structure+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation.</a> Nat.Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Duplex+Map+in+Living+Cells+Reveals+Higher-Order+Transcriptome+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure.</a> Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).</li>
<li>Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Human+RNA-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions.</a> Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).</li>
<li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Mapping+of+Eukaryotic+RNA+Interactomes+Reveals+Principles+of+Higher-Order+Organization+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation.</a> Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Qui descriviamo in dettaglio il flusso di lavoro sperimentale e computazionale per SPLASH, un metodo che ci permette di identificare le interazioni RNA a due mani in modo genico-wide. Abbiamo utilizzato con successo SPLASH nelle colture batteriche, lieviti e umane e anticipo che la strategia possa essere ampiamente applicata a organismi diversi in diversi stati cellulari. Uno dei passaggi critici del protocollo è quello di iniziare con almeno 20 μg di RNA reticolato per avere materiale adeguato per i processi a valle. L...

Studiare come macromolecole si piegano e interagiscono tra loro è la chiave per comprendere la regolazione del gene nella cellula. Mentre molti sforzi sono stati focalizzati nell&#39;ultimo decennio per comprendere come il DNA e le proteine ​​contribuiscono alla regolazione del gene, è relativamente meno noto circa la regolazione post-trascrizionale dell&#39;espressione genica. L&#39;RNA trasporta informazioni sia nella sequenza lineare che nella struttura secondaria e terziaria 1 . La sua capacità di fondare la coppia con se stessa e con gli altri è importante per la sua funzione in vivo . I progressi recenti nel sondaggio della struttura secondaria RNA a elevata produttività hanno fornito preziosi approfondimenti sulle posizioni delle regioni a doppia e singola banda nel transcriptoma 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer le informazioni sui partner di interazione di coppia sono ancora in gran parte mancanti. Per determinare quale sequenza RNA interagisce con un&#39;altra regione RNA nel trascrittoma, abbiamo bisogno di informazioni globali a livello di coppia. La mappatura delle interazioni RNA in coppia in maniera globale e imparziale è stata tradizionalmente una grande sfida. Mentre gli approcci precedenti, come CLASH 9 , hiCLIP 10 e RAP 11 , vengono utilizzati per identificare le interazioni RNA in modo scalare, queste tecniche tipicamente mappano l&#39;accoppiamento base di RNA per un sottoinsieme di RNA che interagiscono con una particolare specie di proteine ​​o RNA. Gli sviluppi recenti nello studio delle interazioni globali di RNA includono il metodo RPL 12 , che non stabilizza le interazioni RNA in vivo e quindi può solo catturare un sottoinsieme di interazioni in vivo . Per superare queste sfide, noi e gli altri abbiamo sviluppato strategie prive di genoma e maestoseP interazioni di RNA in vivo , utilizzando versioni modificate del psoralen 13 , 14 , 15 del reticolatore. In questo protocollo, descriviamo i dettagli per eseguire l&#39;equilibrio di S di P soralen incrociato, L igato e S eligibriti (SPLASH), che utilizza il psoralene biotinilato in RNA in accoppiamento a base di collegamento in vivo in seguito alla legatura di prossimità e ad alta sequenza di throughput a Individuare i partner RNA base-pairing in tutto il genoma ( Figura 1 ) 15 . In questo manoscritto descriviamo i passaggi per eseguire SPLASH utilizzando cellule aderenti colte, in questo caso le cellule HeLa. Lo stesso protocollo può essere facilmente adattato alle cellule di mammiferi di sospensione e alle cellule di lievito e batteri. In breve, le cellule HeLa vengono trattate con psoralene biotinilato e irradiati a 365 nm per incrociare in coppia le coppie di RNA interattive in vivo. I RNA vengono quindi estratti dalle cellule, frammentati e arricchiti per le regioni di reticolazione usando perline di streptavidina. I frammenti RNA interattivi vengono quindi legati insieme usando la legatura di prossimità e fatti in una libreria di cDNA per la sequenza profonda. Al sequenziamento, gli RNA chimerici vengono mappati sul transcriptome / genoma per identificare le regioni interagenti RNA che sono accoppiate tra loro. Abbiamo utilizzato con successo SPLASH per identificare migliaia di interazioni RNA in vivo in lieviti e diverse cellule umane, tra cui l&#39;accoppiamento base di RNA intramolecolare e intermolecolare in diverse classi di RNA, come snoRNA, lncRNA e mRNA, per intravedere nell&#39;organizzazione strutturale e nei modelli di interazione Di RNA nella cella.

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10787026</td><td>Scala</td></tr><tr><td>DNA 10 bp Scala DNA</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10821-015</td><td>Scala DNA</td></tr><tr><td>20% Soluzione SDS</td><td>Prima BASE</td><td>BUF-2052-1L&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>First BASE</td><td>BUF-3050-20X1L</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M Soluzione di acetato di sodio</td><td>First BASE</td><td>BUF-1151-1L-pH5.2&nbsp; &nbsp;</td><td>Necessario per la precipitazione degli acidi nucleici</td></tr><tr><td>Soluzione di acrilammide/bis al 40%, 19:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610145</td><td>TBE Componente in gel di urea</td></tr><tr><td>Kit tampone Ambion</td> Life <td>Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio, grado molecolare&nbsp; &nbsp;</td><td>Promega</td><td>V3131&nbsp;</td><td>TBE Componente in gel di urea</td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Merck</td><td>1.02445.1000</td><td>Estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>DNA ligasi a filamento singolo</td><td>Epicentro</td><td>CL9025K</td><td>CircLigasi II ssDNA Ligasi</td></tr><tr><td>Filtri per provette da centrifuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8160-96EA</td><td>Costar Spin-X filtri per provette</td></tr><tr><td>D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628-1G</td><td>Per il trattamento cellulare</td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator&nbsp;</td><td>Clare Chemical Research</td><td>Dark Reader DR89X Transilluminatore</td> a <td>luce blu Transilluminatore</td></tr><tr><td>DNA Gel Caricamento colorante (6x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>R0611</td><td>Necessario per l'elettroporazione su gel di agarosio</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium Pan</td><td>BioTech</td><td>P04-03500</td><td>Per colture cellulari Hela</td></tr><tr><td>Perle magnetiche di streptavidina</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>65002</td><td>Dynabeads MyOne Streptavidina C1&nbsp;</td></tr><tr><td>Supporto magnetico per 15&nbsp; mL tubi</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12301D</td><td>DynaMag-15</td></tr><tr><td>Supporto magnetico per 15&nbsp; provette da ml</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.015</td><td>Eppendorf ThermoMixer&nbsp; C</td></tr><tr><td>Psoralene biotinilato</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>29986</td><td>EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotina</td></tr><tr><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>Lampadina UV da 365 nm</td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino Life Technologies</td><td>Holdings Pte Ltd</td><td>10270106&nbsp; &nbsp;</td><td>Componenti di Hela medium</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Promega</td><td>H5052&nbsp; &nbsp;</td><td>Componente nel buffer di ibridazione</td></tr><tr><td>G8T5</td><td>Sankyo-Denki</td><td>G8T5</td><td>254 nm Lampadina UV</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10814010</td><td>Necessario per la precipitazione dell'acido nucleico</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Spettrofotometro Nanodrop 2000</td><td>per la quantificazione dell'acido nucleico</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi&nbsp;</td><td>Prima BASE</td><td>BUF-1180-500ml&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15140122&nbsp; &nbsp;</td><td>Componenti di Hela medium</td></tr><tr><td>DNA polimerasi ad alta fedeltà (2x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>F531L&nbsp;</td><td>Phusion Master Mix PCR ad alta fedeltà con tampone HF (2x)</td></tr><tr><td>Set di primer 1</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335L&nbsp;</td><td>Primer per PCR</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel di DNA</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>Kit di estrazione del gel QIAquick</td></tr><tr><td>Kit di quantificazione fluorimetrica</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Q32854</td><td>Qubit dsKit di analisi HS</td></tr> del DNA <tr><td>Kit di pulizia dell'RNA</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNeasy Mini Kit Colonna della membrana di silice</td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM2696</td><td>SUPERase In</td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>18080400</td><td>SuperScript III Sintesi del primo filamento SuperMix</td></tr><tr><td>Gel di acido nucleico Colorazione</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>S11494</td><td>SYBR GOLD ACIDO NUCLEICO 500 UL</td></tr><tr><td>T4 Polinucleotide chinasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>Enzima di riparazione finale</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligasi 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>Enzima per legatura di prossimità</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligasi 2, troncato KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373L</td><td>Enzima per la legatura dell'adattatore</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>TBE Componente in gel di urea</td></tr><tr><td>Guanidinium tiocianato-fenolo-cloroformio</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15596018</td><td>TRIzol&reg; Reagente per estrazione RNA</td></tr><tr><td>Urea</td><td>First BASE</td><td>BIO-2070-5kg&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reticolante UV</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV Stratalinker 1800</td></tr><tr><td>Transilluminatore UV</td><td>UVP</td><td>95-0417-01</td><td>Per la visualizzazione delle</td></tr><tr><td>bande Xilene Cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>Pulizia del DNA Zymo</td><td>Research&nbsp;</td><td>D4004</td><td>Concentratore di DNA Zymo-5&nbsp;</td></tr><tr><td>Elenco dei software richiesti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software FastQC</td><td>0.11.4</td><td>Software http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td></tr> <tr><td>SeqPrep</td><td>1.0.7</td><td>https://github.com/jstjohn/SeqPrep</td><td></td></tr><tr><td>Software BWA</td><td>0.7.12</td><td>Software http://bio-bwa.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>SAMTOOLS</td><td>1.2.1</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>PULLSEQ software</td><td>1.0.2</td><td>https://github.com/bcthomas/pullseq</td><td></td></tr><tr><td>STAR software</td><td>2.5.0c</td><td>https://github.com/alexdobin/STAR</td><td></td></tr><tr><td>rem_dups.py script PYTHON PYTHON</td><td>2.7.11</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>find_chimeras.py script PYTHON</td><td>2.7.11</td><td></td><td></td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</tr><tr><td>pickJunctionReads.awk Script AWK AWK</td><td>GNU 4.1.2</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>Composizione del buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampone di eluizione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 M acetato</td><td></td><td></td><td></td> di sodio</tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td> Aggiungere sempre Superase-in fresco prima dell'uso<td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>tranne quando si lavano perline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K Buffer&nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl pH 7,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Tampone di ibridazione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>750 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15% formamide (conservare al buio a 4 &deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aggiungere sempre Superase-in fresco prima dell'uso</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>2x SSC Wash Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>x NaCl e citrato di sodio (SSC) (diluito da 20x SSC Invitrogen stock)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x RNA fragmentation buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM Tris-Cl pH 8,3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>2x caricamento dell'RNA Colorante</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% Formamide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,02% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,02% blu</td><td></td> di bromofenolo<td></td><td></td></tr><tr><td>0,01% Xilene Cianolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">3' Sequenza adattatore RNA: 
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC</td></tr><tr><td colspan="4">RT sequenza di primer: 
AGATCGGAAGAGCGTGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG</td></tr></tbody></table>

mappatura delle interazioni rna-rna globalmente utilizzando psoralen biotinilato

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Sapere come i RNA interagiscono con se stessi e con gli altri è fondamentale per capire la regolazione del gene basato su RNA nella cellula. Mentre esempi di interazioni RNA-RNA come le interazioni di microRNA-mRNA sono state dimostrate per regolare l&#39;espressione genica, l&#39;intero grado in cui si verificano interazioni RNA nella cella è ancora sconosciuto. I metodi precedenti per studiare le interazioni di RNA si sono concentrati principalmente su subsets di RNA che interagiscono con una particolare proteina o specie di RNA. Qui, abbiamo dettagliato un metodo denominato S equencing di P soralen crosslinked, L igated, e S eletti H ybrids (SPLASH) che consente la cattura genoma di interazioni RNA in vivo in modo imparziale. SPLASH utilizza la reticolazione in vivo , la legatura di prossimità e il sequenziamento ad alta velocità per identificare partner globalmente associati alla base di RNA intramolecolare e intermolecolare. SPLASH può essere applicato a diversi organismi, compresi batteri, lieviti e cellule umane, nonché aS diverse condizioni cellulari per facilitare la comprensione della dinamica dell&#39;organizzazione di RNA in diversi contesti cellulari. L&#39;intero protocollo sperimentale SPLASH richiede circa 5 giorni per completare e il flusso di lavoro computazionale richiede circa 7 giorni per completare.

La figura 1 rappresenta lo schema del flusso di lavoro SPLASH. Dopo l&#39;aggiunta di psoralene biotinilato in presenza di 0,01% di digitonina e di reticolazione UV, viene estratto un totale di RNA dalle cellule e viene eseguita una macchia di punti per assicurare che il collegamento a biotinilato con l&#39;RNA sia accaduto in modo efficace ( Figura 2 ). Utilizziamo oligosini biotinilati 20 come controlli positivi per titolare l...

Qui, abbiamo dettagliato il metodo di equilibrio di P soralen crosslinked, L igated e S elected H ybrids (SPLASH), che consente mapping a livello genomico delle interazioni RNA-RNA intramolecolari e intermolecolari in vivo . SPLASH può essere applicato per studiare interagenti RNA di organismi compresi lieviti, batteri e umani.

Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

L'obiettivo generale di questo video è descrivere il metodo di sequenziamento degli ibridi legati e selezionati con crosslinking mediato da psoralene, o SPLASH, mediante il quale vengono mappate in modo genome-wide le interazioni a coppie tra RNA in vivo. Questa tecnica rappresenta un metodo semplice e ad alto rendimento per il mappaggio delle interazioni tra RNA in vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della genomica dell'RNA, come ad esempio in che modo diverse regioni lungo un singolo filamento di RNA o tra diversi filamenti di RNA interagiscono tra loro.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle cellule di lievito e umane, può essere applicato anche a studi su altri organismi moderni, inclusi batteri e membrane cellulari. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando volevamo elaborare un modo per mappare le interazioni molecolari. Si noti che la seguente procedura contiene diversi punti di interruzione.In questi momenti, l'esperimento può essere interrotto brevemente o indefinitamente. Ulteriori dettagli sono disponibili nel testo allegato. Iniziare questa procedura lavando le cellule HeLa due volte con

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Trascrizioni di RNA sono soggetti ad ampie regolamentazione posttranscriptional che è mediato da una moltitudine di trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Qui vi presentiamo un metodo generalizzabile per identificare con precisione e trascrittoma su scala i siti di legame di RNA RBPs.

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

Le interazioni RNA-proteina sono al centro di molti processi cellulari. Qui, descriviamo un metodo in vivo per isolare RNA specifico e identificare nuove proteine ad esso associate. Questo potrebbe gettare nuova luce su come gli RNA sono regolati nella cellula.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

I laser sono spesso utilizzati in studi di risposta cellulare al danno del DNA. Tuttavia, essi generano lesioni la cui spaziatura, frequenza, e collisioni con forcine di replicazione sono raramente caratterizzati. Qui, descriviamo un approccio che consente la determinazione di questi parametri con laser localizzato legami crociati interstrand.

Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

Descriviamo un protocollo per identificare le proteine RNA-leganti e mappare loro regioni di RNA-binding in cellule vive utilizzando photocrosslinking UV-mediati e spettrometria di massa.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l'isolamento e l'identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

Un protocollo dettagliato per l'applicazione di cattura (CARIC) del RNA-Interactoma di chimica-assistita clicca strategia per identificare proteine leganti alla codificazione di entrambi e non codificanti RNA è presentato.

Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione

Complessi RNA/proteici purificati mediante botin-streptavidina strategia sono eluiti per soluzione in condizioni denaturanti in forma inadatta per ulteriore purificazione e analisi funzionale. Qui, descriviamo una modifica di questa strategia che utilizza un linker foto-spaccabili in RNA e un delicato passaggio di UV-eluizione, producendo complessi RNA/proteine native e completamente funzionale.

Single-step purificazione di complessi macromolecolari usando RNA attaccato alla biotina e un Linker foto-spaccabili

Qui, descriviamo l'assemblaggio di complessi di allungamento della polimerasi RNA II (Pol II) che richiedono solo brevi oligonucleotidi di DNA sintetico e RNA e Pol II purificati. Questi complessi sono utili per studiare i meccanismi alla base dell'elaborazione co-trascrizione delle trascrizioni associate al complesso di allungamento di Pol II.

Complessi di allungamento dell'RNA artificiale Polymerase II per eventi di elaborazione dell'RNA co-trascrizione

Qui sono presentati protocolli per saggi biochimici in vitro utilizzando etichette di biotina che possono essere ampiamente applicabili per studiare le interazioni proteina-nucleiche dell'acido.

Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido

Qui, presentiamo un metodo in vitro ottimizzato per scoprire, quantificare e convalidare gli interattori proteici di specifiche sequenze di RNA, utilizzando estratto proteico totale da cellule umane, perle di streptavidina rivestite con RNA biotinilato e analisi di spettrometria di massa.

Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Scopri il metodo SPLASH per mappare le interazioni RNA-RNA in vivo su scala genomica. Questa tecnica ad alto rendimento utilizza psoralene biotinilato e sequenziamento per studiare lievito, batteri e cellule umane.

Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

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