Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

L'obiettivo generale di questo video è descrivere il metodo per il sequenziamento di ibridi legati e selezionati con psoralene o SPLASH in cui le interazioni RNA-RNA in vivo a coppie sono mappate in modo genome-wide. Questa tecnica è un metodo semplice e ad alto rendimento per mappare l'interazione dell'RNA in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genomica dell'RNA, ad esempio come interagiscono tra loro diverse regioni lungo un singolo filamento di RNA o tra diversi filamenti di RNA.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul lievito e sulle cellule umane, può essere applicato anche a studi su altri organismi moderni, inclusi i batteri e la membrana nelle cellule. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando volevamo trovare un modo per mappare l'interazione molecolare. Si noti che la procedura seguente contiene diversi punti di arresto.

In questi momenti, l'esperimento può essere messo in pausa brevemente o a tempo indeterminato. I dettagli sono disponibili nel testo di accompagnamento. Inizia questa procedura lavando due volte le cellule HeLa con cinque millilitri di PBS.

Posizionare il piatto in verticale per un minuto per drenare completamente l'eccesso di PBS. Successivamente, aggiungere un millilitro di PBS contenente 200 micromolari di psoralene biotinilato e lo 0,01% di digitonina, che aumenta la permeabilità cellulare. Fare attenzione ad aggiungere la soluzione in modo uniforme sulla superficie delle cellule.

Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il coperchio del piatto e posizionarlo sul ghiaccio all'interno di un reticolante UV a tre centimetri dal bulbo UV. Irradiare con UV a 365 nanometri per 20 minuti.

Dopo 20 minuti, rimuovere la capsula dal reticolante, quindi isolare il frammento e precipitare l'RNA dalle cellule HeLa secondo le istruzioni nel documento di accompagnamento. Caricare campioni di scala denaturati e RNA su un gel quadrato di 8,6 centimetri al 6%TBE-urea. Dimensioni frazionate mediante elettroforesi a 180 volt per 40 minuti.

Colorare il gel con 10 millilitri di tampone TBE contenente una diluizione 1:10.000 di colorante di gel di acido nucleico per cinque minuti al buio. Mentre il gel si sta macchiando, usa un ago calibro 24 per forare un tubo di microfuga pulito da 0,6 millilitri sul fondo. Metterlo in un tubo per microfuge da due millilitri.

Utilizzando un transilluminatore, visualizzare le bande sul gel post-colorato e tagliare una fetta di gel corrispondente a 90-110 nucleotidi. Trasferire la fetta di gel nel tubo microfuge da 0,6 millilitri forato nel tubo microfuge da due millilitri. La selezione delle dimensioni ci permette di impostare la lunghezza minima per i frammenti chimerici e di distinguere successivamente tra prodotti legati e prodotti non legati.

Centrifugare le fette di gel a 12.000 volte g a temperatura ambiente per due minuti per sminuzzare la fetta di gel e raccoglierla nel tubo di microfuga da due millilitri. Dopo la centrifuga, gettare il tubo per microfuge vuoto da 0,6 millilitri. Alla fetta di gel sminuzzata, aggiungere 700 microlitri di tampone di eluizione.

Incubare a quattro gradi Celsius durante la notte con rotazione costante per consentire la diffusione dei campioni nel tampone. Trasferire le fette di gel e il tampone di eluizione in un filtro per provette da centrifuga e centrifugare a 20.000 volte g per 20 minuti. Dopo la centrifuga, le fette di gel rimarranno intrappolate nello scomparto superiore del filtro che potrebbe essere scartato.

Precipitare e quantificare l'RNA come descritto nel documento di accompagnamento. Congelare e conservare l'RNA a meno 80 gradi Celsius in azoto liquido fino a quando non viene utilizzato. Per arricchire le regioni di reticolazione dell'RNA, iniziare aggiungendo 100 microlitri di tampone di lisi contenente l'inibitore dell'RNasi per lavare le perle magnetiche rivestite di streptavidina in un tubo microfuge.

A una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri, aggiungere due millilitri di tampone di ibridazione appena preparato, un millilitro di tampone di lisi integrato, 1,5 microgrammi di RNA frazionato di dimensioni e 100 microlitri di perle risospese. Agitare delicatamente il tubo. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti con rotazione end-to-end.

Dopo l'incubazione, lavare le perle cinque volte con un tampone di lavaggio preriscaldato. Al termine del quinto lavaggio, posizionare per un minuto il tubo di microfuga contenente le perline sul supporto magnetico e quindi rimuovere il tampone di lavaggio. Aggiungere un millilitro di tampone polinucleotide chinasi T4 freddo alle perle lavate.

Incubare le perle per cinque minuti a quattro gradi Celsius con rotazione end-to-end. Posizionare il tubo di microfuga contenente le perline sulla banda magnetica. Dopo un minuto, rimuovere delicatamente il tampone.

Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi e rimuovere il tampone dopo l'ultimo lavaggio. Successivamente, seguire le istruzioni nel documento di accompagnamento per convertire le cinque estremità prime e le tre estremità prime in modo che siano compatibili con la legatura ed eseguire la legatura di prossimità. Dopo un lavaggio, aggiungere 100 microlitri di tampone RNA PK alle perle e risospenderle pipettandole su e giù.

Riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti su un blocco termico. Quindi, raffreddare il campione con ghiaccio per un minuto. Aggiungere 500 microlitri di tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinio al campione.

Mescolare agitando energicamente per 10 secondi. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo l'incubazione, utilizzare un kit per precipitare, ripulire e recuperare l'RNA, assicurandosi che anche gli RNA più piccoli vengano mantenuti.

Eluire l'RNA in 100 microlitri di acqua priva di nucleasi. Trasferire 100 microlitri dei campioni eluiti in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti su nice. Mantenendo il campione in ghiaccio, irradiarlo con raggi UV a 254 nanometri per cinque minuti.

Trasferire il campione reticolato inverso in una provetta a microflusso pulita. Aggiungere 10 microlitri di acetato di sodio, un microlitro di glicogeno e 300 microlitri di etanolo al 100%. Far precipitare l'RNA a meno 20 gradi Celsius per almeno un'ora.

Per recuperare l'RNA, centrifugare l'RNA precipitato a 20.000 volte g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro di etanolo freddo al 70% per lavare il pellet di RNA. Centrifugare il pellet lavato a 20.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 4,25 microlitri di acqua priva di nucleasi per risospendere l'RNA. Trasferire l'RNA in una provetta PCR da 0,2 millilitri. Infine, trascrivere, far circolare e amplificare il cDNA secondo le istruzioni contenute nel documento di accompagnamento.

Questo schema illustra il flusso di lavoro SPLASH. Dopo l'aggiunta di psoralene biotinilato in presenza di digitonina allo 0,01% e reticolazione UV, l'RNA totale viene estratto dalle cellule e viene eseguito un dot blot per garantire che la reticolazione fosse efficiente. 20 oligo di basi biotinilate vengono quindi utilizzati come controlli positivi per titolare la quantità di psoralene biotinilato da aggiungere alle cellule in modo tale che circa una base su 150 sia reticolata.

L'amplificazione PCR su piccola scala viene quindi eseguita utilizzando un numero crescente di cicli PCR per determinare il numero minimo di cicli necessari per il sequenziamento profondo. In un efficiente processo di preparazione di librerie, una libreria di sequenziamento del cDNA può essere amplificata da un input di RNA selezionato di 1,5 microgrammi in meno di 15 cicli di amplificazione PCR. La libreria viene quindi sequenziata utilizzando due letture di 150 coppie di basi su una macchina di sequenziamento ad alta velocità.

Le letture di sequenziamento vengono quindi elaborate in base alla pipeline computazionale. Il risultato finale è un elenco di interazioni chimeriche filtrate che include interazioni RNA-RNA sia intramolecolari che intermolecolari nel trascrittoma. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di verificare l'incorporazione di psoralene biotinilato quando si utilizza SPLASH su nuovi organismi.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'RNA per esplorare le interazioni dell'RNA in diversi organismi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una libreria di sequenziamento che catturi le interazioni dell'RNA a coppie a livello globale nella cellula.