Name: Preparazione dei campioni per lidentificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Scopri come identificare proteine leganti RNA e mapparne le regioni in cellule vive mediante foto-reticolazione UV e spettrometria di massa. Questo metodo innovativo non richiede purificazione e si applica a qualsiasi tipo di RNA.

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R.B. è stato sostenuto dal programma studiosi Searle, la W.W. Smith Foundation (C1404) e il March of Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G riconosce sostegno da NIH sovvenzioni R01GM110174 e R01AI118891 NIH, così come DOD concedere BC123187P1. R.W.-T. è stato sostenuto da grant di formazione NIH T32GM008216.

1. cultura e l'espansione delle mESCs NOTE: cellule staminali embrionali di topo sono facili da cultura e può essere rapidamente ampliate ai grandi numeri richiesti da esperimenti biochimici grazie al loro tempo in bicicletta veloce. Sano mESCs raddoppiare ogni 12 h.
<ol><li>MESCs Espandi il numero desiderato sulle piastre gelatinizzati in mESC medio (Vedi sotto) in un'incubatrice di coltura del tessuto mantenuto a 37 ° C, 5% CO 2, e &#62; 95% di umidità. 
	Nota: Abbastanza piatti devono essere preparati per 3-5 replicati biologici per il + 4SU campione e controllo - 4SU. Una piastra di 10 cm (ossia 5 milioni di cellule) è più che sufficiente per ogni replica biologico.</li>
	<li>Il mezzo per mESCs è composto da Dulbecco &#39; s modificato Eagle &#39; medio s (DMEM) completati con 15% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-Glutammina, 0,5 x penicillina/streptomicina, 1 x non essenziali aminoacidi, 100 µM beta-mercaptoetanolo, 1.000 U fattore inibitorio di /ml leucemia (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.</li>
	<li>Prima passaggio mESCs, preparare il numero desiderato di piatti da 10 cm.
	<ol><li>Aggiungere 4 mL di 0,1% di gelatina in acqua facendo attenzione che l'intera superficie della piastra è coperta; Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (TA); rimuovere la soluzione di gelatina.</li>
	</ol></li> <li>Passage cellule quando raggiungono 10 milioni di cellule per piastra, tipicamente ~ 48 h dopo l'inoculazione. 
	Nota: Come mESCs crescere in grandi colonie, piastre non dovrebbero mai essere consentiti raggiungere confluency di 100% come osservato per linee cellulari che crescono negli strati monomolecolari (ad esempio HEK293 o cellule 3T3). Una piastra mESC dovrebbe essere attraversata quando ~ 50% confluenti e sicuramente prima il mezzo diventa giallo.
	<ol><li>Per staccare le cellule, lavare le piastre con denso mESC culture una volta in 1x tampone fosfato salino (PBS) completato con 2 mM EDTA, poi aggiungere tripsina 0.05% disciolta in DMEM e restituire lastra di incubatore per 5 min (37 ° C, 5% CO 2, e &#62; 95% umidità).</li>
		<li>Rimuovere la piastra dall'incubatore e risospendere le cellule con un volume uguale di DMEM pipettando su e giù vigorosamente diverse volte.</li>
		<li>Contare le celle utilizzando un emocitometro e garantire che le cellule formano una sospensione unicellulare (cioè non cluster), poi centrifugare cella miscela 500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1-2 mL DMEM.</li>
		<li>Inoculare cellule ad una densità di 10.000 cellule/cm 2 in mezzo mESC (cioè ~ 800.000 cellule per piastra di 10 cm) utilizzando le piastre rivestite con gelatina preparate al punto 1.3.1.</li>
	</ol></li></ol> 2. Reticolazione della proteina &#8211; interazioni RNA nelle cellule Live Nota: reticolazione della RNA-proteina è mediato da foto-activatable ribonucleoside analogico 4-thiouridine (4SU). 4SU ha un massimo di assorbanza maggiore rispetto endogeno nucleotidi e possono solo essere inglobati in RNA; pertanto intermedio-lunghezza d'onda UVB può essere utilizzato per selettivamente crosslink RNA a proteine 25 , 26. Trattamento di UVB delle cellule trattate 4SU porta a legami crociati covalenti tra 4SU-contenente RNA e aminoacidi, con una preferenza segnalata per Tyr, Trp, Met, Lys e Cys 27.
<ol><li>MESCs di espandere il numero di piastre di 10 cm come descritto nel passo 1. 
	Nota: Abbastanza piatti devono essere preparati per 3-5 replicati biologici per il + 4SU campione e controllo - 4SU. Una piastra di 10 cm (ossia 5 milioni di cellule) è sufficiente per ogni replica biologico.</li>
	<li>Prima le piastre hanno raggiunto confluency, aggiungere 4SU direttamente in mezzo ad una concentrazione finale di 500 µM. lasciare - 4SU piatti di controllo non trattati.</li>
	<li>Piastre agitare delicatamente per distribuire il 4SU in modo omogeneo in tutto il mezzo. Restituirli nell'incubatore di coltura del tessuto stesso per 2 h (37 ° C, 5% CO 2, e &#62; 95% di umidità).</li>
	<li>Piastre di trasferimento di un secchio di ghiaccio ed eliminare terreno.</li>
	<li>Risciacquare la piastra delicatamente con 5 mL di PBS ghiacciata. 
	Nota: Sciacquare delicatamente o cellule potrebbero staccare.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di piastre ghiacciate di PBS e posto senza coperchi in un reticolante dotati di bulbi emettitori di UVB (312 nm). Irradiare piastre a un'impostazione di energia di 1 J/cm 2. 
	Nota: È fondamentale che coperchi di plastica sono rimossi o potrebbero proteggere le cellule da luce UV e prevenire reticolazione.</li>
	<li>Raccogliere le cellule utilizzando sollevatori di cella e trasferimento a PBS ghiacciata in provette coniche. Centrifugare a 2.000 x g per 5 min, 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di PBS ghiacciata con 2 mM EDTA e 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF).</li>
	<li>Conteggio celle utilizzando un emocitometro. Aspettare 5-10 e 10 milioni di cellule da piastre di 10 cm e 15 cm rispettivamente.</li>
	<li>Centrifuga a 2.000 x g per 5 min, 4 ° C. 
	Nota: Pellettate cellule possono essere immediatamente utilizzate per il passaggio 3 o possono essere flash-congelati in azoto liquido e conservati a-80 ° C a tempo indeterminato. Si tratta di un potenziale punto di sosta.</li>
</ol> 3. Isolamento dei Nuclei Nota: i Nuclei sono isolati per rimuovere proteine citoplasmatiche e aumentare la copertura di proteine nucleari. Questo passaggio può essere sostituito con altre forme di frazionamento cellulare per studiare RBPs in diversi compartimenti cellulari.
<ol><li>Preparare ghiaccio freddo Buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.9, 4 ° C, 1.5 mM MgCl 2, 10mm KCl). Utilizzare almeno 2,5 mL per 10 milioni di cellule (come contato al punto 2.9) per l'estrazione. 
	Nota: Le scorte di tampone A (ad es. una bottiglia di 500 mL) possono essere preparati in anticipo e conservati a 4 ° C per 6 mesi.
	<ol><li>Prima dell'uso, aggiungere 0,5 mM dithiothreitol (DTT) e 0,2 mM PMSF fino alla quantità desiderata (2,5 mL per 10 milioni di cellule) del buffer ghiacciata r.</li>
	</ol></li> <li>Lavare le cellule con 2 mL di tampone A per 10 milioni di cellule. Spin a 2.500 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Discard surnatante, aggiungere Buffer completato con 0,2% di un detergente non ionico, non-denaturante, ad esempio octyl-fenossi-polietossi-etanolo A (Vedi la Tabella materiali), 500 µ l per 10 milioni di cellule. Ruotare per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugare a 2.500 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante; il pellet comprende intatti nuclei privi di citoplasma. 
	Nota: Nuclei possono essere utilizzati immediatamente per passaggio 4 o flash-congelati in azoto liquido e conservati a-80 ° C a tempo indeterminato. Si tratta di un potenziale punto di sosta.</li>
</ol> 4. Lisi dei Nuclei Nota: i nuclei reticolati vengono lisati in un buffer di compatibile con spettrometria di massa per rilasciare proteine e complessi proteina-RNA.
<ol><li>Aggiungi buffer di lisi (9 M urea, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 24 ° C), 200 µ l per 10 milioni di cellule. Trattare con ultrasuoni per inclinare la cromatina usando un 1/8 &#34; sonda alle impostazione di ampiezza del 50% per 5-10 s.</li>
	<li>Spin a 12.000 x g per 5 min e raccogliere 175 µ l del surnatante per evitare il pellet. 
	Nota: 100 µ l verrà utilizzato per i prossimi passi di RBR-ID e il restante 75 µ l di lisato possono essere conservati a-80 ° C per un uso successivo e/o analisi western blot.</li>
	<li>Concentrazione nella proteina di misura tramite analisi di Bradford o simile tecnica 28. Diluire la concentrazione nella proteina in diversi campioni a 1 mg/mL o la più bassa concentrazione del campione utilizzando adeguate quantità di tampone di lisi. 
	Nota: Da nuclei delle mESCs 10 milioni si aspettano 100-200 µ g di proteina.</li>
</ol> 5. Digestione della tripsina Nota: proteine vengono digerite per generare peptidi sdatto per ascendente spettrometria di massa (MS).
<ol><li>Soluzione aggiungere DTT a nucleare lisato (5mm finale); Incubare per 1h a RT.</li>
	<li>Aggiungere iodoacetamide da azione fresche (14mm finale); Incubare 30 min a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Diluire lisato con 5 volte il volume di 50mm NH 4 HCO 3</li>
	<li>Aggiungere la tripsina (proteina µ g: tripsina µ g = 200:1); Incubare a 37 ° C durante la notte.</li>
</ol> 6. Desalificazione di peptidi <ol><li>preparare un suggerimento di fase su misura per esempio.
	<ol><li>6.1.1. Inserire un disco di materiale di estrazione C18 fase solida nella parte inferiore della punta di una pipetta 200 µ l.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di oligo R3 invertito resina fase sopra il disco di C18. Posto tappa punta all'interno di centrifugazione adattatore e la punta di posto con adattatore all'interno di un tubo da 1,5 mL microfuge.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l 100% acetonitrile to consigli per lavare. Centrifugare a 1000 x g per 1 min rimuovere il solvente.</li>
		<li>Equilibrato con 50 µ l 0,1% l'acido trifluoroacetico (TFA). Centrifugare a 1000 x g per 1 min.</li>
	</ol></li> <li>Aggiungere acido formico 100% proteine digerite campione per diminuire il pH di 2-3. 
	Nota: Questo dovrebbe richiedere ~ 5 µ l per 1 mL del campione diluito del peptide, ma pH dovrebbe essere misurato e più formico acido aggiunto se necessario.</li>
	<li>Campione di carico sul suggerimento di fase su misura, centrifugare a 1000 x g per 1 min fino a tutto il campione passa attraverso la punta.</li>
	<li>Lavaggio associato peptidi con 50 µ l 0,1% TFA. Centrifugare a 1000 x g per 1 min.</li>
	<li>Eluire peptidi aggiungendo 50 µ l di tampone di eluizione (75% acetonitrile, 0.025% TFA) fase punta e centrifugare a 1000 x g per 1 min forzare il tampone di eluizione dalla punta.</li>
	<li>a secco l'esempio utilizzando una centrifuga vuoto impostato a 150 x g e 1-3 kPa per 1 h. 
	Nota: Peptidi secchi possono essere memorizzati a-80 ° C a tempo indeterminato. Si tratta di un potenziale punto di sosta.</li>
</ol> 7. Rimozione di reticolato RNA Nota: trattare peptidi con nucleasi per rimuovere reticolato RNA.
<ol><li>Risospendere il pellet in 50 µ l 2 x nucleasi tampone (100mm NH 4 HCO 3, 4mm MgCl 2).</li>
	<li>Peptide misura concentrazione utilizzando assorbanza a 280 nm assumendo 1 mg/mL di peptidi per un'A 280 di 1. 
	Nota: La concentrazione attesa è 1 mg/mL.</li>
	<li>Regolare tutti i campioni a 1 mg/mL o per la concentrazione più bassa utilizzando 2x buffer di nucleasi.</li>
	<li>Preparare un mix master di 50 µ l di H 2 O + nucleasi di elevata purezza di 1 µ l (&#8805; 250 U) (fare riferimento alla Tabella materiali) per esempio.</li>
	<li>Prendere 50 µ l di campione del peptide e aggiungere 50 µ l di H 2 O + nucleasi master mix.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C per 1 h. procedere per eseguire spettrometria. 
	Nota: I peptidi sono ora pronti per spettrometria di massa. Possono essere analizzati immediatamente o conservati a-80 ° C a tempo indeterminato. Si tratta di un potenziale punto di sosta.</li>
</ol> 8. Nano cromatografia liquida, spettrometria di massa ed elaborazione dati Raw Nota: perché 4SU-reticolazione cambia la massa del peptide, loro ioni non contano per l'intensità del peptide non reticolati durante LC-MS/MS, che pertanto sembra essere diminuita di reticolazione. Il grado e la coerenza di questa diminuzione riflette il grado di reticolazione della proteina-RNA per ogni peptide 24.
<ol><li>HPLC preparare buffer come segue: acido formico 0,1% in acqua di grado HPLC (tampone A); acido formico 0.1% in acetonitrile di grado HPLC (tampone B).</li>
	<li>Se un nano-HPLC è disponibile, collegare una nano-colonna con le seguenti specifiche: diametro interno 75 µm; pranzo con particelle C18-AQ; lunghezza 20-25 cm. 
	Nota: Se l'HPLC disponibili viene eseguito alle portate più elevate è possibile utilizzare una dimensione di colonna corretto per il tasso di flusso indicata. Cromatografia di flusso superiore diminuisce la sensibilità.</li>
	<li>Programma il metodo HPLC come segue: portata 250-300 nL/min; gradiente da 2 a 28% buffer B in 120 min, da 28 a 80% B per il prossimo 5 min e isocratica 80% B per 10 min. 
	Nota: Se il HPLC non dispone di un caricamento del campione precedente equilibrazione colonna automatizzato, avviare il programma con 10 min a 0% B prima di caricare il campione.</li>
	<li>Programma il metodo di acquisizione di MS per effettuare l'acquisizione di dati-dipendente (DDA) come gli esperimenti di proteomica fucile standard. Il ciclo di dovere di strumento deve essere alternativamente scansioni complete di MS con tandem MS scansioni (o MS/MS) dei segnali più intensi. Utilizzare le impostazioni ottimali per le esecuzioni di proteomica MS. 
	Nota: Per ottenere risultati sicuri, impiegare gli strumenti che possono eseguire almeno il MS completa scansione in modalità ad alta risoluzione (ad esempio orbitrap, time-of-flight). Per la quantificazione accurata, assicurarsi che gli intervalli tra le analisi complete di MS non sono più di 3 cicli di lavoro più lungo s. potrebbero impedire la definizione esatta di cromatogrammi di ioni estratti.</li>
	<li>1-2 µ g di campione sulla colonna HPLC di caricare ed eseguire il metodo HPLC-MS/MS come programmato. Per ogni replica biologico eseguire almeno due sequenze indipendenti e trattarli come tecnici replicati.</li>
	<li>Dopo MS, importare i file raw in un pacchetto di software di proteomica di MS/MS spettri identificazione e quantificazione di peptide tramite cromatografia ionica estratti. Si consiglia di pacchetti software che possono eseguire allineamento cromatografico di multiplo MS viene eseguito (Vedi la Tabella materiali) 29 , 30.</li>
	<li>Se l'opzione è disponibile nella suite software, attivare &#34; Match tra piste &#34; prima di iniziare il trattamento dei dati.</li>
	<li>Una volta terminata l'analisi, esportare l'elenco di peptide insieme ai valori di quantificazione.</li>
</ol>

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<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thionucleobases+as+intrinsic+photoaffinity+probes+of+nucleic+acid+structure+and+nucleic+acid-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Photochem+Photobiol+B%22%5BJournal%5D)">Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.</a> J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+U1+snRNP%2C+a+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle%2C+reveals+the+mechanism+of+5%27+splice+site+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Descriviamo un protocollo sperimentale dettagliato per eseguire RBR-ID in mESCs e, con opportune modifiche, in qualsiasi cella che può incorporare 4SU in RNA. Altri tipi di cellule possono richiedere ottimizzazione dell'approccio per garantire un sufficiente rapporto segnale-rumore. Inoltre, mentre il protocollo descritto nel presente documento si concentra sull'esame di RBPs nucleare, la tecnologia di RBR-ID dovrebbe essere facilmente adattata a diversi compartimenti cellulari, ad esempio il citosol o organelli specific...

Lo scopo del metodo RBR-ID è di identificare nuove proteine RNA-leganti (RBPs) e mappare le loro regioni di RNA-binding (RBRs) con risoluzione di peptide-livello per facilitare la progettazione di mutanti di RNA-binding e l'indagine del biologico e biochimico funzioni delle interazioni della proteina-RNA.
il RNA è unica tra le biomolecole come può agire come un messaggero che trasportano informazioni genetiche sia anche piegare in complesse strutture tridimensionali con funzioni biochimiche più simili a quelle di proteine1,2. Un corpo crescente di prova suggerisce che il RNA non codificante (ncRNAs) svolgono un ruolo importante in vari gene vie regolamentazione ed epigenetici3,4,5 e, in genere, queste funzioni di regolamentazione sono mediate in concerto con proteine che interagiscono specificamente con un determinato RNA. Di particolare rilevanza, recentemente è stato identificato un insieme di proteine che interagiscono per il ncRNA lungo intensamente studiato (lncRNA) Xist, fornendo informazioni preziose in come questo lncRNA media inattivazione del cromosoma x in cellule femminili6,7 ,8. In particolare, molte di queste proteine interagenti Xist non contengono alcun canonico RNA-binding domini9, e quindi loro attività RNA-binding non poteva essere previsto in silico basata alla loro sequenza primaria da solo. Considerando che migliaia di lncRNAs è espressi in qualsiasi data cellula10, è ragionevole presumere che molti di loro potrebbe agire tramite interazioni con ancora di essere scoperto le proteine RNA-leganti (RBPs). Una strategia sperimentale per identificare queste RBPs romanzo sarebbe pertanto facilitare notevolmente il compito di sezionare la funzione biologica di ncRNAs.
Precedenti tentativi di identificare RBPs empiricamente si affidano di polyA + RNA selezione accoppiata a spettrometria di massa (MS)11,12,13,14,15. Anche se questi esperimenti aggiunto molte proteine alla lista dei presunti RBPs, da design che potrebbe rilevare solo proteine legate alle trascrizioni di poliadenilazione. Tuttavia, la maggior parte dei piccoli RNA e molti lncRNAs non sono poliadenilazione. 16 , 17 e le loro proteine interagenti sarebbero probabilmente stati mancati in questi esperimenti. Un recente studio applicato apprendimento automatico ai database Interactoma proteina-proteina per identificare le proteine che co-purificato con più noto RBPs e ha mostrato che questi partner RBP ricorrenti erano più probabili di possedere attività di legame al RNA18. Tuttavia, questo approccio si basa sul database di grande interazione esistenti di data mining e può identificare solo proteine che possono essere co-purificate in condizioni di non-denaturante con RBPs noti, così escludendo dall'analisi insolubile, membrana incorporato e scarse proteine.
L'identificazione di una proteina come una bona fide RBP spesso non produce automaticamente informazioni sulla funzione biologica e/o biochimica dell'interazione proteina-RNA. Per risolvere questo punto, è in genere appropriato per identificare i residui proteici dell'aminoacido e dominio coinvolti nell'interazione, in modo che mutanti specifici possono essere progettati per testare la funzione di legame al RNA nel contesto di ogni romanzo RBP19, 20. gli sforzi precedenti dal nostro gruppo e altri hanno utilizzato frammenti della proteina ricombinante e mutanti di delezione per identificare RNA binding regioni (RBRs)19,20,21,22; Tuttavia, tali approcci sono laboriosi e incompatibile con le analisi di alto-rendimento. Più recentemente, uno studio descritto una strategia sperimentale per mappare attività RNA-binding a una moda di alto-rendimento mediante spettrometria di massa23; Tuttavia, questo approccio invocata una selezione doppia polyA + RNA e così ha trasportato le stesse limitazioni di RBP identificazione approcci descritti sopra.
Abbiamo sviluppato una tecnica, denominata identificazione di regione di associazione di RNA (RBR-ID), che sfrutta la proteina-RNA photocrosslinking e quantitativa spettrometria di massa per identificare proteine e regioni della proteina che interagiscono con il RNA in cellule vive senza fare assunta lo stato di poliadenilazione di RNA, includendo così RBPs associato a polyA-RNAs24. Inoltre, questo metodo si basa esclusivamente sulla reticolazione e non prevede alcun requisito sulla solubilità della proteina o accessibilità ed è quindi adatto per mappare attività RNA-binding all'interno di membrane (ad es. l'involucro nucleare) o compartimenti scarsamente solubili ( ad esempio la matrice nucleare). Descriviamo la procedura sperimentale per eseguire RBR-ID per i nuclei delle cellule staminali embrionali di topo (mESCs) ma con modifiche minori questo protocollo dovrebbe essere adatto per una varietà di tipi cellulari, purché essi possono incorporare efficientemente 4SU dalla cultura medio.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, origine statunitense</td><td>Fisher Scientific 26140079</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di L-Glutammina 200 mM</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100&times;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO Fattore inibitorio della leucemia (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma</td><td>PZ0162</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di gelatina, 2% in acqua</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>4-tiouridina</td><td>Sigma</td><td>T4509</td><td>50 mM stock in acqua</td></tr><tr><td>Spectrolinker XL-1500</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-90</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetanosulfonilfluoruro</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CO-630</td><td>Sigma</td><td>542334</td><td>Forma commerciale di ottil-fenossi-polietossi-etanolo detergente</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, grado di sequenziamento</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Disco di estrazione in fase solida Empore</td><td>3M</td><td>66883</td><td></td></tr><tr><td>OLIGO R3 Resina di fase invertita</td><td>Fisher Scientific</td><td>1133903</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E8263</td> Dismembratore sonico <td>nucleasi ad alta purezza</td></tr><tr><td>Modello 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>fuori produzione</td><td>aggiornato con FB505110</td></tr><tr><td>Acetonitrile di grado HPLC</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 18-AQ</td><td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td><td>r13.aq.0003</td><td>Materiale di imballaggio per colonna HPLC</td></tr><tr><td>Capillare per nano colonne (75 &micro; m)</td><td>Molex</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>software MaxQuant</td> Istituto <td>Max Planck per la biochimica</td><td></td><td>Può eseguire l'allineamento cromatografico di più esecuzioni MS</td></tr></tbody></table>

preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di rna-binding regions

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

RNA non codificanti svolgono i ruoli importanti in diversi processi nucleari, tra cui che regolano l'espressione genica, struttura della cromatina e riparazione del DNA. Nella maggior parte dei casi, l'azione di RNA non codificante è mediato dalle proteine le cui funzioni sono a loro volta regolate da queste interazioni con RNA non codificanti. Coerentemente con questo, un numero crescente di proteine coinvolte in funzioni nucleari è stato segnalato per legare RNA e in alcuni casi le regioni di RNA-binding di queste proteine sono state mappate, spesso attraverso metodi laboriosi, basati su candidati.
Qui, segnaliamo un protocollo dettagliato per eseguire un'alto-rendimento, tutto il proteoma imparziale identificazione di proteine RNA-leganti e le loro regioni di RNA-binding. La metodologia si basa sull'incorporazione di un uridina fotoreattivo analogico in RNA cellulare, seguito da reticolazione UV-mediata della proteina-RNA e analisi di spettrometria di massa per rivelare RNA-reticolato peptidi all'interno del proteoma. Anche se Descriviamo la procedura per cellule staminali embrionali di topo, il protocollo deve essere facilmente adattato ad una varietà di cellule coltivate.

Figura 1 illustra il flusso di lavoro di RBR-ID. A causa della reticolazione relativamente bassa efficienza di questa tecnica, è molto importante considerare il livello di esaurimento e la coerenza degli effetti osservati (P -valore) attraverso replicati biologici. La figura 2 Mostra un diagramma a Vulcano risultato RBR-ID. Peptidi che sovrapposti dominio motivo (RRM) riconoscimento di RNA mostrano lo svuotamento altamen...

Descriviamo un protocollo per identificare le proteine RNA-leganti e mappare loro regioni di RNA-binding in cellule vive utilizzando photocrosslinking UV-mediati e spettrometria di massa.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le proteine leganti l'RNA in cellule vive e mappare le loro regioni di legame all'RNA mediante fotoincrocio mediato da UV seguito da spettrometria di massa. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'epigenetica, come quali regolatori epigenetici siano legati all'RNA e quali regioni proteiche siano necessarie per tali interazioni. Il principale vantaggio di questa tecnica è che non richiede la purificazione dei complessi proteina-RNA, necessitando quindi poca materia prima e identificando le proteine legate a qualsiasi tipo di RNA.Come presentato, questo metodo si concentra sulle proteine nucleari poiché questo rappresenta il nostro interesse scientifico, ma con lievi modifiche ai passaggi di frazionamento, potrebbe essere utilizzato per studiare l'RNA e le proteine leganti in altri compartimenti sub-nucleari. Dopo aver coltivato ed espanso le cellule staminali embrionali di topo secondo il protocollo descritto, espandere le cellule al numero richiesto di piastre da 10 centimetri. Prima che le piastre raggiungano la confluenza, aggiungere direttamente nel mezzo quattro SU a una concentrazi

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Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Trascrizioni di RNA sono soggetti ad ampie regolamentazione posttranscriptional che è mediato da una moltitudine di trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Qui vi presentiamo un metodo generalizzabile per identificare con precisione e trascrittoma su scala i siti di legame di RNA RBPs.

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

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Analisi dell'espressione genica di un sottogruppo di cellule in un tessuto specifico rappresenta una grande sfida. In questo articolo si descrive come isolare RNA totale di alta qualità da una popolazione di cellule specifiche, combinando un metodo immunomarcatura rapida con microdissezione laser.

RNA isolamento da cellulari sottopopolazioni specifiche utilizzando laser-capture Microdissection combinazione con Rapid immunomarcatura

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Vi presentiamo un piccolo protocollo di riparazione della libreria di RNA dettagliato con meno distorsione rispetto ai metodi standard e una maggiore sensibilità per 2'-O-metilRNA. Questo protocollo può essere seguito utilizzando reagenti fatti in casa per risparmiare sui costi o utilizzando kit per comodità.

Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per un metodo di sequenziamento basato su LC-MS che può essere utilizzato come metodo diretto per sequenziare RNA corto (&lt;35 nt per corsa) senza un intermedio di cDNA e come metodo generale per sequenziare diverse modifiche nucleotidiche in un singolo studio con precisione a base singola.

2D-HELS MS Seq: Un metodo generale basato su LC-MS per il sequenziamento diretto e de novo di miscele di RNA con diverse modifiche nucleotidiche

La tecnologia MAPS è stata sviluppata per esaminare il targetome di uno specifico RNA normativo in vivo. L'sRNA di interesse è contrassegnato con un aptamer MS2 che consente la co-purificazione dei suoi partner di RNA e la loro identificazione tramite sequenziamento dell'RNA. Questo protocollo modificato è particolarmente adatto per i batteri Gram-positivi.

Purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con sequenziamento dell'RNA nei batteri gram-positivi

Il protocollo fornisce istruzioni per modificare l'RNA con dimetilsolfato per esperimenti di profilazione mutazionale. Include il sondaggio in vitro e in vivo con due metodi alternativi di preparazione della libreria.

Sondare la struttura dell'RNA con profilo mutazionale del dimetilsolfato con sequenziamento in vitro e nelle cellule

Scopri come identificare proteine leganti RNA e mapparne le regioni in cellule vive mediante foto-reticolazione UV e spettrometria di massa. Questo metodo innovativo non richiede purificazione e si applica a qualsiasi tipo di RNA.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

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