Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le proteine leganti l'RNA in cellule vive e mappare le loro regioni di legame all'RNA mediante fotoincrocio mediato da UV seguito da spettrometria di massa. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'epigenetica, come quali regolatori epigenetici siano legati all'RNA e quali regioni proteiche siano necessarie per tali interazioni. Il principale vantaggio di questa tecnica è che non richiede la purificazione dei complessi proteina-RNA, necessitando quindi poca materia prima e identificando le proteine legate a qualsiasi tipo di RNA.

Come presentato, questo metodo si concentra sulle proteine nucleari poiché questo rappresenta il nostro interesse scientifico, ma con lievi modifiche ai passaggi di frazionamento, potrebbe essere utilizzato per studiare l'RNA e le proteine leganti in altri compartimenti sub-nucleari. Dopo aver coltivato ed espanso le cellule staminali embrionali di topo secondo il protocollo descritto, espandere le cellule al numero richiesto di piastre da 10 centimetri. Prima che le piastre raggiungano la confluenza, aggiungere direttamente nel mezzo quattro SU a una concentrazione finale di 500 micro molar.

Lasciare le piastre di controllo con 4sU non trattate. Agitare delicatamente le piastre per distribuire in modo omogeneo l'4sU in tutto il mezzo, quindi reinserire le piastre nello stesso incubatore per colture cellulari per due ore. L'efficienza di incorporazione dell'4sU varia a seconda del tipo cellulare, pertanto potrebbe essere necessario ottimizzarne la concentrazione e il tempo di incubazione per garantire un efficiente cross-linking e minimizzare la tossicità.

Successivamente, trasferire le piastre in un contenitore con ghiaccio e scartare il mezzo. Quindi, utilizzare 5 millilitri di PBS freddo di ghiaccio per risciacquare delicatamente le piastre. Aggiungere 2 millilitri di PBS freddo di ghiaccio e posizionare le piastre senza coperchio in un incrociatore dotato di lampade che emettono UV-B.

Irradiare le piastre a un'energia di 1 Joule per centimetro quadrato. Un efficace incrocio mediante UV è fondamentale. Raccomandiamo l'uso di luce UV-B, ma può essere utilizzata anche luce UV-A.

In ogni caso, la quantità di energia UV utilizzata deve essere ottimizzata e può essere monitorata mediante PAR-CLIP o ChIRP. Utilizzare levette per cellule per raccogliere le cellule e trasferirle in PBS freddo in provette coniche. Successivamente, centrifugare le cellule a 2000 ×g e 4 °C per cinque minuti.

Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di PBS freddo con 2 millimoli di EDTA e 0,2 millimoli di PMSF. Contare le cellule mediante emocitometro. Ci si aspetta da cinque a dieci milioni di cellule dalle piastre da 10 centimetri e da dieci a venti milioni di cellule dalle piastre da 15 centimetri.

Quindi, centrifugare le cellule a 2000 ×g e 4 gradi Celsius per cinque minuti. Per isolare i nuclei dalle cellule, preparare il tampone A freddo su ghiaccio come indicato nel protocollo testuale. Prima dell'uso, aggiungere 0,5 millimoli di DTT e 0,2 millimoli di PMSF alla quantità desiderata di tampone A. Aggiungere 2 millilitri del tampone freddo alle cellule per lavarle, quindi centrifugare le cellule a 2500 ×g e 4 gradi Celsius per cinque minuti.

Scartare il soprannatante e aggiungere il buffer A integrato con lo 0,2 percento di un detergente non ionico e non denaturante, quindi ruotare il campione a 4 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver centrifugato le cellule a 2500 ×g per cinque minuti, rimuovere il soprannatante. Il pellet contiene nuclei integri privi di citoplasma.

Per lisare i nuclei, aggiungere 200 microlitri di buffer di lisi al tubo. Utilizzare una sonda da 1/8 di pollice per sottoporre il campione a sonicazione al fine di frammentare la cromatina, impostando l'ampiezza al 50 percento per cinque-dieci secondi. Centrifugare il campione a 12000 ×g per cinque minuti e raccogliere soltanto 175 microlitri di soprannatante per evitare il pellet.

Successivamente, misurare la concentrazione proteica mediante saggio di Bradford o una tecnica simile. Quindi, utilizzare il buffer di lisi per diluire la proteina nei diversi campioni a 1 milligrammo per millilitro o alla concentrazione più bassa presente tra i campioni. Aggiungere la soluzione di DTT 5 millimolare al lisato nucleare e incubare il campione a temperatura ambiente per un'ora.

Quindi, aggiungere 14 millimolari di iodacetamide da una soluzione madre fresca e incubare il lisato a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. Diluire il lisato con un volume cinque volte maggiore di bicarbonato di ammonio 50 millimolare, quindi aggiungere tripsina. Incubare il campione a 37 gradi Celsius per tutta la notte.

Per preparare un puntale personalizzato per ogni campione, posizionare un disco di materiale C18 per estrazione in fase solida sul fondo di un puntale da pipetta da 200 microlitri. Aggiungere 50 microlitri di resina in fase inversa Oligo R3 sopra il disco C18, quindi inserire il puntale in un adattatore per centrifuga e posizionare l'adattatore in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 100 microlitri di acetonitrile al 100 percento ai puntali per lavarli.

Quindi centrifugare le punte a 1000 ×g per un minuto per rimuovere il solvente. Equilibrare le punte con 50 microlitri di acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1 percento. Poi, centrifugare nuovamente.

Aggiungere acido formico al 100% al campione proteico digerito per ridurre il pH a 2-3. Successivamente, caricare il campione su una punta personalizzata (stage tip) e centrifugare a 1000 ×g per un minuto, fino a quando tutto il campione è passato attraverso la punta. Lavare i peptidi legati con 50 µL di TFA allo 0,1%.

Successivamente, dopo aver centrifugato il campione a 1000 ×g per un minuto, eluire i peptidi aggiungendo 50 microlitri di tampone di eluizione alla stage tip e centrifugare a 1000 ×g per un minuto per spingere il tampone di eluizione fuori dalla punta. Utilizzare un centrifugo sotto vuoto impostato a 150 ×g e da 1 a 3 chilopascal per un'ora per essiccare il campione. Per rimuovere l'RNA cross-linkato dal campione, risospendere il pellet in 50 microlitri di tampone per nucleasi 2x.

Misurare la concentrazione del peptide a 280 nanometri, assumendo 1 milligrammo per millilitro di peptidi per un A280 di 1. Utilizzare il buffer nucleasico 2x per aggiustare tutti i campioni a 1 milligrammo per millilitro o alla concentrazione più bassa, quindi preparare una miscela master da 50 microlitri di acqua più 1 microlitro di nucleasi ad alta purezza per ogni campione. Combinare 50 microlitri di campione peptidico con 50 microlitri di acqua più la miscela master contenente la nucleasi.

Quindi, incubare il campione a 37 gradi Celsius per un'ora. Infine, eseguire la cromatografia liquida in nano-scala, la spettrometria di massa e l'elaborazione dei dati seguendo il protocollo descritto nel testo. Questa figura mostra un grafico a vulcano di un risultato RBR id ottenuto da ESC di topo.

I peptidi che si sovrappongono a un dominio del motivo di riconoscimento dell'RNA sono in blu e mostrano livelli di deplezione altamente consistenti. Un peptide legante l'RNA proveniente da HNRNPC è evidenziato in rosso. Qui è mostrata una mappa termica dei punteggi RBR id, calcolati come stima della probabilità di legame con l'RNA di una regione proteica.

Il punteggio viene proiettato sulla superficie della sottounità spliceosomica U1-70k. Il colore rosso brillante nelle vicinanze del contatto con l'RNA, come determinato dalla struttura cristallina, indica l'identificazione corretta dell'interazione proteina-RNA. In questa figura, TET2 è presentato come una nuova proteina legante l'RNA (RBP) e l'attività di legame all'RNA viene mappata in una regione C-terminale tracciando il punteggio RBR id lungo la sequenza primaria della proteina.

Infine, il requisito per questo nuovo RBR potrebbe essere verificato eseguendo il PAR-CLIP utilizzando la sequenza di tipo selvatico e confrontando il segnale con quello di un mutante privo del RBR previsto. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette-otto ore distribuite in due giorni, se effettuata correttamente. Prima dell'incrocio, le cellule possono essere stimolate con diversi trattamenti al fine di rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio come inizia la differenziazione o come il ciclo cellulare regola le interazioni tra RNA e proteine.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare estratti contenenti complessi di proteine legate all'RNA per identificare i siti di interazione proteina-RNA mediante spettrometria di massa.