Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le proteine leganti l'RNA nelle cellule vive e mappare le loro regioni di legame dell'RNA utilizzando la foto-reticolazione mediata dai raggi UV seguita dalla spettrometria di massa. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica, come ad esempio quali regolatori epigenetici sono legati all'RNA e quali regioni proteiche sono necessarie per le interazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non comporta la purificazione dei complessi di RNA proteici, e quindi richiede poco materiale e identifica le proteine legate a qualsiasi tipo di RNA.

Come presentato, questo metodo si concentra sulle proteine nucleari perché questo è il nostro interesse scientifico, ma con piccole modifiche nelle fasi di frazionamento, potrebbe essere utilizzato per studiare l'RNA e le proteine leganti in altri compartimenti scientifici. Dopo aver coltivato ed espanso le ESC di topo secondo il protocollo di testo, espandere le cellule fino al numero richiesto di piastre da 10 centimetri. Prima che le piastre raggiungano la confluenza, aggiungere quattro SU direttamente nel mezzo fino a una concentrazione finale di 500 micro molari.

Lasciare le piastre di controllo 4sU non trattate. Agitare delicatamente le piastre per distribuire in modo omogeneo il 4sU in tutto il terreno, quindi rimettere le piastre nello stesso incubatore di coltura tissutale per due ore. L'efficienza dell'incorporazione di 4sU varia a seconda del tipo di cellula, e quindi potrebbe essere necessario ottimizzarne la concentrazione e il tempo di incubazione per garantire un'efficiente reticolazione e ridurre al minimo la tossicità.

Quindi, trasferisci le piastre in un secchiello per il ghiaccio e scarta il mezzo. Quindi, utilizzare 5 millilitri di PBS ghiacciato per sciacquare delicatamente i piatti. Aggiungere 2 millilitri di PBS ghiacciato e posizionare le piastre senza coperchio in un reticolante dotato di lampadine a emissione UV-B.

Irradiare le piastre a un'impostazione di energia di 1 Joule per centimetro quadrato. Un'efficiente reticolazione UV è fondamentale. Si consiglia di utilizzare la luce UV-B, ma è possibile utilizzare anche i raggi UV-A.

In ogni caso, la quantità di energia UV utilizzata deve essere ottimizzata e può essere monitorata da PAR-CLIP o ChIRP. Usa i sollevatori di cellule per raccogliere le cellule e trasferirle in PBS ghiacciato in provette coniche. Quindi, centrifugare le cellule a 2000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di PBS ghiacciato con EDTA da 2 millimolari e PMSF da 0,2 millimolari. Con un emocitometro, contare le cellule. Aspettatevi da cinque a dieci e da dieci a venti milioni di celle da piastre da 10 centimetri e 15 centimetri, rispettivamente.

Quindi, centrifugare le celle a 2000 volte g e 4 gradi Celsius per cinque minuti. Per isolare i nuclei dalle cellule, preparare il tampone ghiacciato A come indicato nel protocollo di testo. Prima dell'uso, aggiungere 0,5 millimolari di DTT e 0,2 millimolari di PMSF alla quantità desiderata di tampone A.Aggiungere 2 millilitri di tampone freddo alle cellule per lavarle, quindi centrifugare le cellule a 2500 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Scartare il surnatante e aggiungere il tampone A integrato con lo 0,2% di un detergente non ionico e non denaturante, quindi ruotare il campione a 4 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver centrifugato le cellule a 2500 volte g per cinque minuti, rimuovere il surnatante. Il pellet comprende nuclei intatti privi di citoplasma.

Per lisare i nuclei, aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi alla provetta. Utilizzare una sonda da 1/8 di pollice per sonicare il campione per tagliare la cromatina a un'impostazione di ampiezza del 50% per cinque-dieci secondi. Centrifugare il campione a 12000 volte g per cinque minuti e raccogliere solo 175 microlitri di surnatante per evitare il pellet.

Successivamente, misurare la concentrazione proteica tramite il test Bradford o una tecnica simile. Quindi, utilizzare il tampone di lisi per diluire la proteina nei diversi campioni a 1 milligrammo per millilitro o alla concentrazione minima del campione. Aggiungere una soluzione di DTT da 5 millimolari al lisato nucleare e incubare il campione a temperatura ambiente per un'ora.

Quindi, aggiungere 14 millimolari di iodoacetamide da brodo fresco e incubare il lisato a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. Diluire il lisato con cinque volte il volume di 50 millimolari di bicarbonato di ammonio, quindi aggiungere la tripsina. Incubare il campione a 37 gradi Celsius durante la notte.

Per preparare un puntale da tavolino personalizzato per campione, posizionare un disco di materiale C18 per l'estrazione in fase solida sul fondo di un puntale per pipetta da 200 microlitri. Aggiungere 50 microlitri di resina Oligo R3 a fase inversa sopra il disco C18, quindi posizionare la punta dello stadio all'interno di un adattatore di centrifugazione e posizionare l'adattatore all'interno di un tubo di microfuga da 1,5 millilitri. Aggiungi 100 microlitri di acetonitrile al 100% alle punte per lavarle.

Quindi centrifugare i puntali a 1000 volte g per un minuto per rimuovere il solvente. Equilibrare le punte con 50 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,1% o TFA. Quindi, girali di nuovo.

Aggiungere il 100% di acido formico al campione di proteine digerito per ridurre il PH a 2 o 3. Quindi, caricare il campione su un puntale di tavolino su misura e centrifugare il campione a 1000 volte g per un minuto fino a quando tutto il campione passa attraverso il puntale. Lavare i peptidi legati con 50 microlitri di TFA allo 0,1%.

Quindi, dopo aver centrifugato il campione a 1000 volte g per un minuto, eluire i peptidi aggiungendo 50 microlitri di tampone di eluizione alla punta dello stadio e centrifugare a 1000 volte g per un minuto per forzare il tampone di eluizione fuori dalla punta. Utilizzare una centrifuga sottovuoto impostata a 150 volte g e da 1 a 3 kilopascal per un'ora per asciugare il campione. Per rimuovere l'RNA reticolato dal campione, risospendere il pellet in 50 microlitri di tampone nucleasi 2x.

Misurare la concentrazione di peptidi a 280 nanometri assumendo 1 milligrammo per millilitro di peptidi per e A280 di 1. Utilizzare 2x tampone nucleasi per regolare tutti i campioni a un milligrammo per millilitro o alla concentrazione più bassa, quindi preparare una miscela master di 50 microlitri di acqua più 1 microlitro di nucleasi ad alta purezza per campione. Combinare 50 microlitri di campione di peptidi con 50 microlitri di acqua più la miscela master di nucleasi.

Quindi, incubare il campione a 37 gradi Celsius per un'ora. Infine, eseguire la cromatografia nanoliquida, la spettrometria di massa e l'elaborazione dei dati secondo il protocollo di testo. Questa figura mostra un grafico del vulcano di un risultato id RBR da ESC di topo.

I peptidi che si sovrappongono a un dominio del motivo di riconoscimento dell'RNA sono in blu e mostrano livelli di deplezione altamente coerenti. Un peptide legante l'RNA di HNRNPC è evidenziato in rosso. Di seguito è mostrata una mappa termica dei punteggi id RBR calcolati come stima della probabilità di legame dell'RNA di una regione proteica.

Il punteggio viene proiettato sulla superficie della subunità spliceosomiale U1-70k. Il colore rosso vivo in prossimità del contatto dell'RNA, come determinato dalla struttura cristallina, indica la corretta identificazione dell'interazione proteina RNA. In questa figura, TET2 è presentato come un nuovo RBP e l'attività di legame dell'RNA è mappata su una regione C terminale tracciando il punteggio id RBR lungo la sequenza primaria della proteina.

Infine, il requisito di questo nuovo RBR potrebbe essere verificato eseguendo PAR-CLIP utilizzando la sequenza wild type e confrontando il segnale con quello di un mutante privo dell'RBR previsto. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette-otto ore in due giorni se eseguita correttamente. Prima della reticolazione, le cellule possono essere stimolate con vari trattamenti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come inizia la differenziazione o come il ciclo cellulare regola le interazioni tra le proteine dell'RNA.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare extra contenenti complessi di RNA proteico reticolati per identificare i siti di interazioni dell'RNA proteico con la spettrometria di massa.