Name: Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dellantigene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Scopri la calorimetria a scansione differenziale per valutare la stabilità termica e la conformazione delle proteine antigeniche nei vaccini. Questo metodo misura direttamente la temperatura di transizione termica e l'energia di denaturazione.

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Gli autori sono molto grato a Giuseppe Mancini (già con GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments limitata) per il loro ruolo nella installazione e formazione sul calorimetro a scansione differenziale, Sasmit Deshmukh e Webster Magcalas per le loro discussioni.

1. Strumento di avvio <ol><li> Accendere il calorimetro a scansione differenziale ed aumentare la pressione nelle celle per sopprimere ebollizione dei campioni e prevenire la formazione delle bolle a temperature elevate. Questo è tipicamente ottenuto alimentando azoto nel sistema. </li><li> A seconda del materiale costituente della cellula (ad esempio, tantalio, oro, platino, ecc), regolare la pressione del gas di alimentazione dell&#39;azoto secondo pressione raccomandata dal produttore per evitare di danneggiare la cella. Ad esempio, impostare la pressione di alimentazione del gas di azoto a 45 psi per lo strumento utilizzato per sviluppare questo procedimento, e la pressione superiore a 80 psi può danneggiare la cella. </li><li> Assicurarsi che tutti i serbatoi degli agenti di pulizia sono riempiti al volume desiderato. I detergenti richiesti includono acqua e detergente per lavare e pulire la cella, rispettivamente, dopo ogni esecuzione del campione. </li><li> Impostare la temperatura del vano campione tienead un valore adeguato, preferibilmente 5 ° C, per mantenere l&#39;integrità del campione prima di sperimentare. </li></ol> Preparazione 2. campione <ol><li> Dializzare campione contro il buffer che verrà utilizzato come riferimento per l&#39;esperimento. In alternativa, tampone di eluizione raccolti nella fase finale di purificazione della proteina (cioè eluizione colonna) può essere utilizzato. </li><li> Determinare la concentrazione del campione proteico utilizzando il più adatto metodo di determinazione della concentrazione di proteine, come metodo al Kjealdahl 33 o il metodo Lowry 34. Per confronto oggettivo dei risultati, utilizzare lo stesso metodo in modo coerente all&#39;interno dello stesso studio. L&#39;intervallo di concentrazione richiesto può variare a seconda del modello di strumento. Per lo strumento utilizzato in questo protocollo, il campo di lavoro preferibile è 0,5-1 mg / mL. </li><li> Degas il buffer di campione e di riferimento nel vuoto per sbarazzarsi di microbolle che possono causare il volume inaccurACY. Questo passaggio può essere saltato per i modelli più recenti calorimetro. </li><li> Usando una micropipetta e punte sterili in un armadio biocontenimento flusso laminare, caricare i campioni e il loro rispettivo tampone a coppie in piastre da 96 pozzetti compatibili con lo strumento. Riempire le prime due coppie di pozzetti con tampone e le ultime due coppie con acqua per il buffer-buffer e la scansione dell&#39;acqua, rispettivamente. Scansioni Buffer-tampone verificare l&#39;idoneità dello strumento prima di assaggiare la misura (vale a dire la valutazione dell&#39;errore strumentazione), così come stabilire una linea di base; mentre scansioni acqua vengono eseguiti per pulire le cellule. </li><li> Coprire la piastra a 96 pozzetti con un film di sigillatura, e garantire che i pozzi siano adeguatamente sigillati prima di prendere il piatto fuori dalla biosicurezza gabinetto per evitare la contaminazione del campione. </li><li> Porre la piastra in vano campione tenendo nel giusto orientamento. </li></ol> Setup 3. Sperimentale Parametro Nota: A seconda della instrumentation, i campioni possono essere caricati nella cellula sia manualmente con una siringa, o automaticamente utilizzando un autocampionatore. In questo caso (cioè un ambiente industriale), un autocampionatore viene utilizzato per risparmiare tempo. <ol><li> Utilizzando il software di acquisizione, inserire le informazioni del campione nell&#39;ordine della piastra è stato caricato di cui al punto 2.4. Inserisci concentrazioni se disponibile, altrimenti immettere valori di concentrazione in software di analisi prima analisi dei dati (paragrafo 4.2). </li><li> Selezionare l&#39;opzione che assicura la pulizia delle cellule con detersivo prima ogni scansione del campione, che dovrebbe essere seguito da più passaggi dell&#39;acqua di risciacquo per assicurare residui di detersivo residua delle cellule. </li><li> Impostare la temperatura iniziale dell&#39;esperimento a 20 ° C, ma questo può variare a seconda previa conoscenza del campione. Per proteine ​​note, predeterminata temperatura di partenza può essere usato, mentre una temperatura iniziale inferiore può essere utilizzata anche per campioni sconosciuti. </li><li> Impostare la temperatura finaledell&#39;esperimento, ad esempio 100 ° C. La temperatura finale può variare a seconda previa conoscenza del campione. </li><li> Impostare la frequenza di scansione dell&#39;esperimento, ad esempio 60 ° C / h, che è la velocità di scansione tipica. Tuttavia, velocità di scansione può variare a seconda previa conoscenza del campione, ad esempio 90 ° C / h, o 120 ° C / h. È consigliabile eseguire la scansione di campioni sconosciuti a velocità di scansione differenti per valutare la cinetica di svolgimento. </li><li> campioni Rescan per indagare la reversibilità del dispiegarsi termica. Il dispiegamento di una proteina è considerata reversibili se l&#39;entalpia ottenuto per la seconda scansione è almeno 80% del valore entalpia per la prima scansione. </li><li> Impostare il termostato post-esperimento a 10 ° C per preservare l&#39;integrità delle cellule del calorimetro. </li><li> Verificare che i parametri di configurazione dell&#39;esperimento siano corretti prima di eseguire l&#39;esperimento. Se tutto è a posto, avviare l&#39;esperimento. </li></ol> 4. DatiANALISI <ol><li> Recupero dati grezzi dall&#39;esperimento e selezionare un campione alla volta per l&#39;analisi. Scansione Sottrazione di riferimento, cioè di buffer, dalla scansione del campione. NOTA: Riferimento sottrazione viene eseguita automaticamente da più recenti modelli di strumenti DSC. </li><li> Inserire il valore di concentrazione del campione se è stato omesso di cui al punto 3.1. </li><li> Montare e sottrarre linea di base dal termogramma acquisito per tenere conto di differenze nelle capacità termiche degli stati piegati e ripiegati della proteina che è causato dalla esposizione di gruppi idrofobici all&#39;acqua su di dispiegarsi. Lineare o adattamento della curva cubica possono essere applicati a seconda della forma del profilo DSC per il campione. Per coerenza, lo stesso tipo di raccordo deve essere utilizzato durante uno studio, ad esempio studio di stabilità in tempo reale. Questo passo è necessario per elaborare la curva per l&#39;integrazione dei picchi di ottenere entalpia di transizione. </li><li> Eseguire l&#39;integrazione di picco utilizzando non-lineare dei minimi quadrati. Sulla base del prodottoconoscenza applicare due stati o modello non-due stati. il modello a due stati può essere utilizzata per le singole transizioni termiche cooperative, e per le proteine ​​sconosciute, applicare il modello non-due stati fino ad ulteriore conoscenza del prodotto è disponibile. Se del caso, regolare la curva di montaggio utilizzando la curva di funzione raccordo iterativa del software dell&#39;apparecchiatura fino a quando il valore del chi-quadro rimane costante. </li><li> I risultati ottenuti mostrano i valori per punto medio di temperature di transizione (TM), entalpia calorimetrica (d H), e Van&#39;t Hoff entalpia (d H VH) del campione. </li></ol>

<ol><li>Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+techniques%3A+applications+in+biology+and+nanoscience%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience.</a> J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).</li>
<li>Perkin Elmer Corp. Differential microcalorimeter. Patent. , US3263484A 02 August (1966).</li>
<li>O'Neill, M. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/231200637_The_Analysis_of_a_Temperature-Controlled_Scanning_Calorimeter">The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter.</a> Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).</li>
<li>O'Neil, M. J. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60242a011">Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry.</a> Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).</li>
<li>Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. Mol. Biol. 6, (in Russian) 7-33 (1975).</li>
<li>Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. Adiabatic differential microcalorimeter. Адиабатический дифференциальный микрокалориметр. , Authorship certificate No 328776 (USSR), applied 1970 (1970).</li>
<li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+study+of+the+nature+of+the+intramolecular+fusion+of+collagen%2C+isolated+from+transplantable+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Dokl.+Akad.+Nauk%22%5BJournal%5D)">Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor.</a> Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), (In Russian) 212-214 (1968).</li>
<li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndronikashvili%2C+EL+%22Conformational+Changes+of+Biopolymers+in+Solution%22">Conformational Changes of Biopolymers in Solution</a>. , Nauka Publishing House. Moscow. (In Russian) 171-173 (1973).</li>
<li>Andronikashvili, E. L. <a target="_blank" href="http://europepmc.org/abstract/med/3318939">Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures.</a> Biofizika. 32 (5), (In Russian) 782-799 (1987).</li>
<li>Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+the+denaturation+of+lysozyme+in+alcohol-water+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures.</a> Biochemistry. 18 (7), 1180-1186 (1979).</li>
<li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+capacity+and+entropy+changes+in+processes+involving+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).</li>
<li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.pc.38.100187.002335">Biochemical applications of differential scanning calorimetry.</a> Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).</li>
<li>Jackson, W. M., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+protein+denaturation.+A+calorimetric+study+of+the+reversible+denaturation+of+chymotrypsinogen+and+conclusions+regarding+the+accuracy+of+the+two-state+approximation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation.</a> Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).</li>
<li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+analysis+of+thermal+transitions+in+globular+proteins.+I.+Calorimetric+study+of+chymotrypsinogen%2C+ribonuclease+and+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin.</a> Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).</li>
<li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermodynamic+approach+to+the+problem+of+stabilization+of+globular+protein+structure%3A+a+calorimetric+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study.</a> J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).</li>
<li>Privalov, P. L., Potekhin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+microcalorimetry+in+studying+temperature-induced+changes+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins.</a> Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).</li>
<li>Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins. Biofizika. 33, (In Russian) 954-961 (1988).</li>
<li>Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+functional+and+structural+transformations+of+the+photosystem+II+oxygen-evolving+complex+in+spinach+subchloroplast+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).</li>
<li>Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a, Shnyrov, V. L. Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates. J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).</li>
<li>Oreshkin, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+the+muscle+proteins+of+cured+beef+during+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Science%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating.</a> Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).</li>
<li>Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. <a target="_blank" href="http://www.future-science.com/doi/abs/10.4155/pbp.14.27">Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens.</a> Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).</li>
<li>Jiskoot, W., Daan, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiskoot%2C+W+%22Methods+for+structural+analysis+of+protein+pharmaceuticals%22">Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals</a>. 3, Springer Science & Business Media. (2005).</li>
<li>Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+ultrasensitive+scanning+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new ultrasensitive scanning calorimeter.</a> Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).</li>
<li>Plotnikov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li>
<li>Freire, E. Differential scanning calorimetry. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/book/10.1385%2F0896033015">Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology</a>. 40, 191-218 (1995).</li>
<li>Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetrically+determined+dynamics+of+complex+unfolding+transitions+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).</li>
<li>Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+analysis+of+the+structural+stability+of+the+tetrameric+oligomerization+domain+of+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor.</a> Biochemistry. 34 (16), 5309-5316 (1995).</li>
<li>Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+equilibrium+of+human+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The conformational equilibrium of human growth hormone.</a> J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).</li>
<li>Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1016/0307-4412(94)90013-2/full">Clarification of calorimetric and van't hoff enthalpies for evaluation of protein transition states.</a> Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).</li>
<li>Privalov, P. L. Microcalorimetry of proteins and their complexes. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9781588299543">Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology</a>. 490, 1-39 (2009).</li>
<li>Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. <a target="_blank" href="http://www.ijapbs.com/admin/php/uploads/156_pdf.pdf">The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (ΔHU).</a> Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).</li>
<li>Stability testing of new drug substances and products. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guideline%2C+ICH+Harmonised+Tripartite%22">Guideline, ICH Harmonised Tripartite</a>. 1 (2), current step. 4 (2003).</li>
<li>Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances). Zeitschrift für analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14907713">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>HÖhne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%96hne%2C+G+%22Differential+Scanning+Calorimetry%22">Differential Scanning Calorimetry</a>. , Springer Science & Business Media. (2003).</li>
<li>Porter, L. L., George, D. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22635268">A thermodynamic definition of protein domains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).</li>
<li>Frokjaer, S., Daniel, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+drug+stability%3A+a+formulation+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Protein drug stability: a formulation challenge.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).</li>
<li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).</li>
<li>Chiu, M. H., Elmar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry%3A+an+invaluable+tool+for+a+detailed+thermodynamic+characterization+of+macromolecules+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Bioallied+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions.</a> J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).</li>
<li>Hirst, J. D., Charles, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicity%2C+circular+dichroism+and+molecular+dynamics+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins.</a> J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).</li>
<li>Kirkitadze, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+modules+of+the+vaccinia+virus+complement+control+protein+are+not+in+extensive+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact.</a> Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).</li>
<li>Freire, E., SchÖn, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+denaturation+as+a+tool+in+the+formulation+optimization+of+biologics%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+disc+today%22%5BJournal%5D)">Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics.</a> Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+differential+scanning+calorimetry+for+thermal+stability+analysis+of+proteins%3A+qualification+of+DSC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC.</a> J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).</li>
</ol>

Tutti gli autori sono dipendenti di Sanofi Pasteur. Il lavoro è stato finanziato da Sanofi Pasteur, e le spese di pubblicazione di questo video-articolo sono stati pagati da Sanofi Pasteur. Gli autori non hanno carattere rilevanti o coinvolgimento finanziario con qualsiasi organizzazione o ente che ha un conflitto finanziario con l&#39;oggetto o materiale trattato nel manoscritto. Questi includono l&#39;occupazione, società di consulenza, il possesso di azioni o opzioni o diritti d&#39;autore. Nessuna assistenza scrittura è stato utilizzato nella produzione di questo manoscritto.

Questa procedura è stata incorporata con successo in vari pacchetti di test di caratterizzazione, tra stabilità e comparabilità dei prodotti studi 21. In studi di stabilità in tempo reale, DSC viene utilizzato per monitorare la T m, nonché stimare la F a dei biologici nel tempo per determinare la shelf-life. Per quanto riguarda comparabilità del prodotto, che viene usato per valutare l&#39;impatto del processo e cambiamento impianto così come l&#39;effetto di fasi di produzione chiave sulla conformazione strutturale dei lotti prodotti. Ciò comporta in genere il confronto diretto del d H del lotto prodotto per un prodotto di riferimento che è stato designato come il prodotto ideale. Inoltre, DSC ha dimostrato di essere un utile strumento analitico per studi formulativi prodotto 37. La T m di una proteina in differenti tamponi ea differenti concentrazioni può essere utilizzato per determinare la formulazione che porge più stabilitàla proteina. Per garantire l&#39;affidabilità di questo metodo e l&#39;obiettività dei suoi risultati, è importante mantenere i parametri di test coerente da corsa per eseguire all&#39;interno dello stesso studio (per esempio, lo studio formulazione del vaccino). Tuttavia, la procedura può essere modificato per accogliere le differenze nelle proprietà fisiche delle varie proteine. Un esempio di una modifica che può essere fatto sta modificando la velocità di scansione dell&#39;esperimento 38, 39. Proteine che erano inclini a aggregati formano quando riscaldato sono stati esaminati ad una velocità di scansione più veloce (per esempio 120 ° C / h) per evitare il contributo degli aggregati al profilo transizione termica nonché intasamento dei capillari del calorimetro. Vale la pena notare che la scansione di tasso può influenzare il risultato di un esperimento DSC 38. L&#39;ampliamento del picco transizione termica è stato osservato con crescente velocità di scansione in qualche proproteine; tuttavia, T m è rimasto abbastanza costante 38. Inoltre, la procedura di dialisi e di degasaggio per la preparazione dei campioni sono anche molto importante per ottenere risultati accurati 31. Dialisi assicura che l&#39;unica differenza nella composizione del campione e il buffer è la proteina; pertanto, tutti gli eccessi di calore assorbito dal campione può essere attribuita alla capacità termica della proteina. Degasaggio assicura precisa analisi del volume, come l&#39;estrapolazione del parametro termodinamico presuppone che l&#39;evento si sta verificando svolgersi sotto costante volume e pressione 31. La porzione di pressione costante del presupposto è rappresentato da azoto pressurizzazione del sistema di cui al punto 1.1 della procedura. In confronto ad altri metodi per determinare la stabilità di conformazioni proteiche come dicroismo circolare (CD) e fluorescenza Spettroscopie, DSC offre una serie di vantaggi in un comimpostazione commerciale tra cui risparmio di costi e di tempo. In primo luogo, il disegno adiabatica di un calorimetro a scansione differenziale consente la misura della stabilità termica con una migliore precisione di temperatura rispetto a misure con strumentazione per CD e fluorescenza Spettroscopie 6. In secondo luogo, a differenza CD, la precisione dei dati DSC non dipende dalla elicità della proteina 39, 40; tuttavia, CD fornisce ulteriori informazioni sul dispiegarsi della struttura secondaria, che sarebbe gratuito per la DSC 41. Inoltre, la pressurizzazione del sistema DSC consente la verifica con un ampio intervallo di temperatura senza ebollizione il campione; pertanto, una vasta gamma di proteine ​​può essere controllata con DSC. Mentre DSC è un approccio relativamente veloce e semplice per determinare la stabilità termica dei biologici, non è senza limitazioni. In primo luogo, la basepasso linea di sottrazione introduce una qualche forma di incoerenza umana nell&#39;analisi dati grezzi; pertanto, variazioni risultati possono essere osservati tra diversi utenti. In secondo luogo, differenziali calorimetri di scansione hanno limiti minimi di concentrazione che potrebbero essere difficili da realizzare su scala produzione di massa. In terzo luogo, la d H di irreversibile denaturazione termica non è assoluta; il che implica che DeltaG derivato (un indicatore della stabilità della proteina) in scenari simili può essere fuorviante. Inoltre, il metodo funziona meglio per campioni purificati. La presenza di impurità può sia causare uno spostamento del T m se vi è una interazione con la proteina in esame, o comparsa di nuove transizioni termiche se non vi è alcuna interazione. In ogni caso queste caratteristiche extra sui termogrammi possono essere erroneamente attribuiti ai campioni, impattando così l&#39;interpretazione dei risultati. Nonostante queste limitazioni, DSC rimane un metodo affidabile in grado di fornire informazioni dettagliate su termodinamico °e proteine processo dispiegarsi se attuato correttamente 42. In conclusione, DSC offre notevole vantaggio come strumento di lettura conformazionale di prodotti vaccini e loro intermedi. I due parametri, T m e d H, raccolti per una serie di lotti dello stesso prodotto può diventare una linea di base empirica che può essere utilizzato per esaminare l&#39;effetto delle variazioni di processo, formulazione, e condizioni di conservazione sulla struttura terziaria e stabilità delle proteine e antigeni virali 21, 43.

Calorimetria differenziale a scansione (DSC) è un metodo sperimentale che misura direttamente la differenza di calore assorbimento di energia che avviene in un campione rispetto ad un riferimento durante un cambiamento regolamentato temperature 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12. Effettuato in un calorimetro a scansione differenziale, il metodo implica l&#39;introduzione di energia termica in una cella campione e una cella di riferimento contemporaneamente mentre identicamente aumentando la temperatura di entrambe le celle nel tempo 2, 13,14. Grazie alla differenza nella composizione del campione e il riferimento, sarà richiesto diversa quantità di energia per aumentare la temperatura delle celle 2, 12, 13. Così, la quantità in eccesso di energia necessaria per compensare la differenza di temperatura tra le cellule viene misurata e direttamente correlata a specifiche proprietà termodinamiche del campione 1, 3. Nel 1960, MJ O&#39;Neil e E. Watson di Perkin Elmer sviluppato il primo calorimetro a scansione differenziale per misurare il flusso di calore di materiali solidi 2, 3, 4. In parallelo, PL Privalov e DR Monaseldze EL dell&#39;Istituto di Fisica, Repubblica di Georgia (ex URSS) hanno creato un calorimetro adiabatico differenziale unico che può essere utilizzato foR ricerca biochimica 5, 6. Successivamente, la squadra di Andronikashvili presso l&#39;Istituto di Fisica, Repubblica di Georgia, ha riferito la capacità termica di biomolecole quali proteine fibrose e globulari, DNA e RNA utilizzando DSC 7, 8, 9. Diverse squadre guidate da Sturtevant 10, 11, 12, 13 Brandts e Privalov 14, 15, 16 focalizzati sullo sviluppo della teoria e applicazioni pratiche di DSC per indagare i dettagli termodinamici di proteine svolgimento. Il valore della DSC a studiare grandi strutture supramolecolari quali fagi, cloroplasto, cristalli liquidi fosfolipidi e proteine della carne sono stati riportati anche 17 </<html> sup&gt;, 18, 19, 20. DSC è diventato comune in ricerca e sviluppo farmaceutico per la valutazione della stabilità termica di biomolecole, specialmente proteine 1, 21, 22. Ciò è dovuto principalmente ai progressi in termini di sensibilità e automazione della strumentazione utilizzata per condurre l&#39;esperimento 23, 24. Qui, il risultato finale dell&#39;esperimento DSC, cioè capacità termica molare in funzione della temperatura, è usata per stimare i seguenti parametri termodinamici (variazione capacità termica (ΔCp), entalpia (d H), entropia (ΔS) e energia libera di Gibbs (DeltaG)) utilizzando la seguente equazione: eq1.jpg &quot;/&gt; (1) <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq2.jpg" /> (2) <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq3.jpg" /> (3) <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq4.jpg" /> (4) <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq5.jpg" /> (5) Dove Cp si misura la capacità termica; q è il flusso di calore nel materiale da testare; T 0 e T sono le temperature iniziale e finale della transizione, rispettivamente 22, 25. E &#39;anche interessante notare che le equazioni di cui sopra si applicano alle proteine singolo dominio che possono subire transizione di due stati e reversibile termico dispiegarsi 22. L&#39;analisi delle proteine più complesse (ad esempio proteine, non-due stati, e oligomeri) have stata riportata da Friere et al. 26; Johnson et al. 27; e Kasimova et al. 28. Per determinare se una proteina subisce transizione di due stati o forme intermedie durante denaturazione termica, l&#39;entalpia sperimentale derivato (d H, indicato anche come calorimetrica entalpia d H Cal) viene confrontato con il entalpia derivato utilizzando l&#39;equazione di van&#39;t Hoff indicato di seguito (anche denominato van&#39;t Hoff entalpia; d H VH): <img alt="equazione 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq6.jpg" /> (6) Dove T m è la temperatura punto medio della transizione, R è la costante dei gas ideali (1.987 cal mol -1 K -1) e Y è la frazione della popolazione proteine a foglio spiegato 16, 29. SeD H VH è pari a d H Cal; o d H VH / d H Cal è uguale a 1, quindi la proteina subisce una transizione &quot;tutto o niente&quot; (cioè transizione due stati) 16, 25, 29. Tuttavia, se d H VH è inferiore a d H Cal; o d H VH / d H Cal è inferiore a 1, la proteina subisce una transizione non due stati 16, 25, 29. Il rapporto d H VH / d H Cal corrisponde anche alla proporzione della struttura delle proteine che si scioglie come unità cooperativa termodinamico o dominio 26. I parametri termodinamici di cui sopra, come DeltaG e d H forniscono informazioni utili sulla stabilità termica delle proteine, tra cui farmaci biologici<html> 30. Tuttavia, l&#39;accento sarà posto sulla T m e d H in questa pubblicazione, in quanto sono i valori riportati per questo protocollo. T m è la temperatura punto medio della transizione, dove la piegati e gli stati unfolded della proteina sono all&#39;equilibrio (cioè, DeltaG = 0) 25, 31. Maggiore è la T m di una proteina, maggiore è la sua stabilità termica 31. D H corrisponde l&#39;area sotto il picco (s) della capacità termica contro grafico di temperatura (noto anche come termogramma) generato alla fine dell&#39;esperimento DSC 16, 25. È l&#39;energia necessaria per denaturare le proteine e può essere utilizzato per stimare la frazione attiva (F a) in una formulazione proteine (cioè, la proporzione di proteine con conformazione attiva in un campione) utilizzando la seguente equazione: jove_content &quot;&gt; <img alt="equazione 7" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq7.jpg" /> (7) Dove d H è l&#39;entalpia sperimentalmente derivati del campione di proteine e Q è l&#39;entalpia determinato per un riferimento ben caratterizzato o proteine standardizzato 22. La stima di F a è importante per monitorare la stabilità in tempo reale dei prodotti, nonché la realizzazione di studi di stabilità in condizioni di stress, come richiesto dalle linee guida ICH 32. Confronto di d H fornisce anche informazioni circa la compattezza della struttura conformazione terziaria di una proteina 31. Dettagli Questo protocollo una procedura per valutare la stabilità termica delle proteine ​​in un ambiente industriale ed è stato ampiamente utilizzato per la formulazione di vaccini. È stato sviluppato utilizzando un calorimetro a scansione differenziale automatizzato che genera risultati riproducibili fo concentrazioni di proteine ​​a partire da 300 mg / mL.

<table><tbody><tr><td>Calorimetro a scansione differenziale</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>28428948 (tramite GE Healthcare)</td><td>Dispone di un autocampionatore per l'erogazione automatica dei campioni nella cella per ridurre lo sforzo umano e gli errori.</td></tr><tr><td>Contrad 100</td><td>Decon Laboratories Inc</td><td>1504</td><td>Diluire con acqua al 20% prima dell'uso</td></tr><tr><td>500 &; micro; L Piastra a 96 pozzetti in polipropilene a fondo tondo</td><td>Canadian Life Science</td><td>ML072100</td><td>Possono essere utilizzate anche piastre equivalenti di altri fornitori (ad es, VW)</td></tr><tr><td>MicroCal ThermoVac&nbsp;</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>N/Ap</td><td>fornito con l'armadio di biosicurezza Cap VP DSC</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Labconco</td><td>Logic+ - Cabina</td> a <td>flusso laminare di biocontenimento A2 per la preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>Cassetta per dialisi Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo Scientific</td><td>66810 o 66380</td><td>per equilibrare il campione e il tampone</td></tr></tbody></table>

calorimetria a scansione differenziale - un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dell&#39;antigene

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Calorimetria differenziale a scansione (DSC) è una tecnica analitica che misura la capacità termica molare di campioni in funzione della temperatura. Nel caso di campioni di proteine, profili DSC forniscono informazioni sulla stabilità termica, e in qualche misura serve come &quot;impronta digitale&quot; strutturale che può essere utilizzato per valutare la conformazione strutturale. Viene eseguita utilizzando un calorimetro a scansione differenziale che misura la temperatura di transizione termica (temperatura di fusione; T m) e l&#39;energia necessaria per interrompere le interazioni stabilizzazione della struttura terziaria (entalpia; d H) delle proteine. I confronti sono fatti tra formulazioni e lotti di produzione, e le differenze di valori derivati ​​indicano differenze di stabilità termica e la conformazione strutturale. I dati che illustrano l&#39;uso della DSC in un ambiente industriale per gli studi di stabilità così come il monitoraggio fasi di produzione principali sono forniti come prova dell&#39;efficacia di questo proprotocollo. In confronto ad altri metodi di valutazione della stabilità termica di conformazioni proteiche, DSC è conveniente, richiede poche fasi di preparazione del campione, e fornisce anche un profilo termodinamico completo del processo dispiegarsi proteine.

I dati grezzi maggior parte degli esperimenti DSC sono presentati come un flusso di calore rispetto grafico delle temperature, come calorimetro misura effettivamente la differenza nel tasso di flusso di calore nella soluzione campione e tampone 35. Pertanto, se entrambe le celle (cioè le cellule del campione e di riferimento) contengono soluzioni identiche durante un esperimento, i dati grezzi dalla scansione dovrebbe essere una linea piatta, senza picchi osservabili. Ogni picco osservato può essere attribuito a un errore della strumentazione (ad esempio, danneggiati o contaminati celle), che è il motivo per cui in esecuzione delle scansioni del buffer prima campione di analisi è un test di sistema di idoneità adeguata. La Figura 1 illustra il risultato di una tipica scansione di buffer che indica che calorimetro era in buone condizioni prima campione di analisi. La Figura 2 mostra i dati grezzi per un esperimento DSC effettuata su difflotti diversi di due campioni di proteine. Come accennato più sopra, i picchi osservati sono le differenze nel flusso di calore dei campioni e dei rispettivi buffer. Le differenze di concentrazione del campione possono causare variazioni nella capacità termica registrata dal calorimetro; Tuttavia, queste variazioni sono normalizzati durante l&#39;analisi del campione di cui al punto 4.2 della procedura. Concentrazioni più elevate possono anche rivelare i domini termodinamici aggiuntivi non contribuendo alla transizione a concentrazioni più basse. Inoltre, ogni transizione rappresenta un dominio termodinamico che può includere uno o più domini strutturali della proteina 36. In questo caso, la proteina 1 ha tre domini strutturali che si sciolgono in cooperazione. La Figura 3 mostra i risultati generati dall&#39;analisi dei dati grezzi per proteina 1 e 2 presentati nella figura 2, cioè, dopo basale sottrazione e iterativo curva fitting. I termogrammi risultanti sono stati normalizzati per la scansione di frequenza (effettuata automaticamente da un algoritmo di pre-impostato nel software di analisi) e la concentrazione; in tal modo, presentando i risultati dell&#39;esperimento di capacità termica paragonabile rispetto grafici della temperatura. Il software di analisi utilizza i dati dalla capacità termica rispetto grafici di temperatura, come T m e ΔCp, per derivare altri parametri termodinamici utilizzano varianti delle equazioni sopra riportate seconda della cooperatività di proteine svolgimento. Durante il test di campioni sconosciuti, impostare l&#39;intervallo di temperatura appropriata è fondamentale. Altrimenti, termogrammi incompleti comportano, come illustrato nella figura 4. Anche se T m da tali profili può essere derivata, d H non può essere determinato con precisione. Pertanto, il campione deve essere riprovato con un intervallo di temperatura maggiore per catturare completamente i transizione termica. Alcune proteine ​​anche rimodulo adily aggregati dopo la completa denaturazione, determinando una capacità termica post-transizione aumentando: questo spesso appare come un termogramma incompleta come illustrato in Figura 2B. Tuttavia, rianalisi con temperatura finale superiore può aiutare a confermare se vi sia un evento di una transizione conformazionale a quella regione del termogramma o è solo l&#39;effetto di calore di assorbimento di aggregati proteici. La stabilità termica è uno dei più importanti proprietà fisiche delle proteine e dei prodotti a base di proteine del settore 37. In farmaceutico, è utilizzato per determinare la stabilità dei biologici in diverse condizioni, tra tamponi formulazione e fattori ambientali quali umidità e temperatura. E &#39;anche usato per monitorare chiave fase di produzione (ad esempio, purificazione e disintossicazione) per garantire la coerenza tra le conformazionale lotti di produzione. <strong<html> &gt; Figure 5 e 6 illustrano l&#39;uso di DSC per esaminare gli effetti delle condizioni di disintossicazione e di stoccaggio chimici rispettivamente sulla stabilità e la conformazione strutturale delle due proteine differenti. Le differenze significative nel Tm e d H indicano cambiamenti conformazionali e degradazione delle proteine, rispettivamente. Inoltre, la perdita del terzo transizione nella figura 6 illustra ulteriormente la degradazione di un dominio che è stato confermato da una diminuzione del peso molecolare quando i campioni sono stati analizzati utilizzando cromatografia di esclusione molecolare con multi-angolo dispersione della luce (SEC-MALS) ( dati non mostrati). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig1.jpg" /> Figura 1: Buffer Scansioni. La somiglianza in gradiente di ogni scansione senza picchi osservabili indica che lo strumento è in buone condizioni e generato risultati riproducibili.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig2.jpg" /> Figura 2: dati grezzi raccolti da esperimenti DSC. Questi grafici sono buone rappresentazioni dei dati non analizzati (RAW) acquisite dopo prove sperimentali (ad esempio prima di sottrazione della linea di base e curve fitting). Ogni linea rappresenta un lotto di produzione. Protein 2 tende ad aggregare più facilmente in seguito a riscaldamento, con un conseguente aumento della capacità termica superiore a 100 ° C nella regione post-transizione del termogramma. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig3.jpg" /><br/&gt; Figura 3: Analyzed DSC dati. Questi grafici sono buone rappresentazioni di dati DSC analizzati (cioè dopo la sottrazione della linea di base e curve fitting). La linea blu rappresenta il termogramma dopo il basale sottrazione, mentre la linea rossa rappresenta la curva con il migliore adattamento al termogramma. (A) La T m e d H per Protein 1 Campione n ° 12 sono 80.16 ° C e 1,69 x 10 6 cal / mol, rispettivamente. (B) La T m e d H per Protein 1 Esempio # 13 sono 80.15 ° C e 1,71 x 10 6 cal / mol rispettivamente. (C) La T m e d H per la Proteina 2 Esempio # 21 sono 75.01 ° C e 4,08 x 10 6 cal / mol, rispettivamente. (D) La T m e d H per la Proteina 2 Esempio # 22 sono 75.67 ° C e 4,22 x 10 6 cal / mol, rispettivamente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per</a>visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig4.jpg" /> Figura 4: Un Termogramma incompleto. I dati grezzi raccolgono per Protein 1 analizzato in un intervallo di temperatura inadeguata. La temperatura finale di esperimento è stato impostato a 90 ° C che non accogliere l&#39;intero profilo di transizione della proteina rispetto al esperimento figura 2A che è stata impostata a 120 ° C. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig5.jpg" /> Figura 5: hanno analizzato i dati che mostra l&#39;effetto di disintossicazione chimica sulla struttura terziaria della Proteina 1. (A) Protein 1 è una tossina nella sua conformazione nativa e has la sua T m a 56.84 ° C e d H a 2,57 x 10 5 cal / mol. (B) La forma disintossicata di Protein 1 (cioè tossoide) ha T valori d H di 81.01 ° C m ed e 1,89 x 10 6 cal / mol, rispettivamente. Pertanto, si può concludere che la fase di disintossicazione introdotto qualche forma di variazione della conformazione strutturale della proteina 1, che conferisce maggiore stabilità (superiore T m) alla sua forma disintossicata. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig6.jpg" /> Figura 6: ha analizzato i dati che mostra l&#39;effetto delle condizioni di magazzinaggio sulla conformazione delle proteine 3. Questi grafici illustrano l&#39;effetto della temperatura di conservazione (2-8 ° C) sulla stabilità e la struttura terziaria della ProTEIN 3 più di 30 settimane. La T valori d H per Protein 3 a 8 ° (A) e 38 ° settimana (B) di stoccaggio m e sono riportati nella tabella 1 che segue. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Campione </td><td> Tm 1 (° C) </td><td> D H 1 (cal / mol) </td><td> Tm 2 (° C) </td><td> D H 2 (cal / mol) </td><td> Tm 3 (° C) </td><td> D H 3 (cal / mol) </td></tr><tr><td> Protein 3 conservato a 2-8 ° C per 8 settimane </td><td> 61.91 </td><td> 1.71 x 10 5 </td><td> 75.54 </td><td> 2.17 x 10 5 </td><td> 90.29 </td><td> 4.17 x 10 5 </td></tr><tr><td&gt; Protein 3 conservato a 2-8 ° C per 38 settimane </td><td> 61,87 </td><td> 1,66 x 10 5 </td><td> 75.18 </td><td> 1.46 x 10 5 </td><td> 90.22 </td><td> 5,76 x 10 5 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Tm e d H Valori per Protein 3 al 8 ° e 38 ° settimana di conservazione a 2 - 8 ° C. Sebbene i valori m T in entrambi i punti temporali sono simili, la differenza nei valori d H indica che la struttura terziaria della proteina 3 è degradato oltre 30 settimane sotto la condizione di memoria specificato.

Calorimetria differenziale a scansione misura la temperatura di transizione termica (s) ed energia termica totale richiesta per denaturare una proteina. I risultati ottenuti sono utilizzati per valutare la stabilità termica di antigeni proteici in formulazioni di vaccino.

Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dell&#39;antigene

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di valutare la stabilità termica e la conformazione strutturale delle proteine in un ambiente industriale utilizzando la calorimetria differenziale a scansione. La calorimetria differenziale a scansione misura la capacità termica molare dei campioni in funzione della temperatura ed è stata utilizzata con successo per valutare la stabilità termica e la conformazione strutturale delle proteine. Questa procedura relativamente semplice non dipende dall'elicità strutturale o dai fluorofori intrinseci come nel caso di altri metodi biofisici.Un altro vantaggio di questa tecnica è che misura direttamente la temperatura di transizione termica e l'energia necessaria per interrompere l'interazione stabilizzando la struttura terziaria delle proteine. Se utilizzata in combinazione con l'entusiasmo dello spiegamento, la temperatura di transizione termica può fungere da parametro utile per monitorare la coerenza tra i lotti dei processi di produzione dei farmaci biologici. La dimostrazione visiva di questo metodo può fungere da mezzo interattivo per assistere efficacemente i nuovi utenti nei passaggi critici.Per iniziare, accendi il calorimetro differenziale a scansione. Quindi fornire azoto al sistema. Ciò aumenterà la pressione nelle celle per sopprimere l'ebollizione dei campioni e prevenire la formazione di bolle a temperature elevate.A seconda del materiale costitutivo della cella, regolare la pressione dell'alimentazione dell'azoto gassoso in base alla pressione consigliata dal produttore per evitare di danneggiare la cella. Assicurarsi che tutti i serbatoi del detergente siano riempiti al volume richiesto. I detergenti necessari includono un detergente per lavare la cella e acqua per pulire la cella dopo ogni campionamento.Impostare la temperatura del vano di contenimento del campione su un valore adeguato, preferibilmente cinque gradi Celsius, per mantenere l'integrità del campione prima dell'esperimento. È importante bilanciare il campione con il tampone per garantire che l'unica differenza tra le soluzioni sia la proteina. Pertanto, la differenza osservata nella capacità termica può essere correttamente attribuita alla proteina.Determinare la concentrazione del campione proteico utilizzando un metodo di determinazione della concentrazione proteica adatto come il metodo Lowry. Per lo strumento utilizzato in questo protocollo, l'intervallo di lavoro preferibile è compreso tra 0,5 e un milligrammo di proteine per millilitro. Dializzare il campione rispetto al buffer che verrà utilizzato come riferimento per l'esperimento.Degassare il campione e il tampone di riferimento sotto vuoto per eliminare le microbolle che possono causare imprecisioni di volume. Lavorando in una cappa di biocontenimento a flusso laminare, utilizzare una micropipetta e puntali sterili per caricare i campioni nel rispettivo tampone a coppie in piastre da 96 pozzetti. Riempire le prime due coppie di pozzetti con il tampone per eseguire scansioni tampone-tampone per verificare l'idoneità dello strumento prima della misurazione del campione.Riempi le ultime due coppie di pozzetti con acqua per la scansione dell'acqua per pulire le celle. Quindi coprire la piastra a 96 pozzetti con pellicola sigillante. Assicurarsi che i pozzetti siano adeguatamente sigillati prima di estrarre la piastra dalla cabina di biosicurezza per evitare la contaminazione del campione.Infine, posizionare la piastra nello scomparto di contenimento del campione con l'orientamento corretto. Utilizzando il software di acquisizione, inserire le informazioni del campione nell'ordine in cui è stata caricata la lastra. Inserisci le concentrazioni proteiche, se disponibili.In caso contrario, inserire la concentrazione nel software di analisi prima dell'analisi dei dati. Selezionare l'opzione che garantisce la pulizia della cella con detergente prima di ogni scansione del campione. La pulizia deve essere seguita da più fasi di risciacquo con acqua per garantire che non rimangano residui di detersivo nelle celle.Impostare la temperatura iniziale dell'esperimento a 20 gradi Celsius, che può variare a seconda del campione. Per le proteine note, è possibile utilizzare una temperatura iniziale predeterminata, mentre una temperatura iniziale più bassa può essere applicata per campioni sconosciuti. Quindi impostare la temperatura finale dell'esperimento.La temperatura finale può variare anche a seconda della conoscenza preliminare del campione. Quindi, imposta la velocità di scansione dell'esperimento. Si consiglia di scansionare campioni sconosciuti a diverse velocità di scansione per valutare la cinetica di dispiegamento.Impostare il software di acquisizione per eseguire nuovamente la scansione dei campioni per esaminare la reversibilità della transizione termica. Il dispiegamento di una proteina è considerato reversibile se l'entalpia ottenuta per la seconda scansione è almeno l'80% del valore di entalpia della prima scansione. Impostare il termostato post-esperimento a 10 gradi Celsius per preservare l'integrità della cella calorimetrica.Verificare che i parametri di configurazione dell'esperimento siano corretti prima di eseguire l'esperimento. Se tutto è a posto, inizia l'esperimento. Dopo l'esperimento, eseguire l'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo.Per l'analisi, la sottrazione della linea di base viene eseguita manualmente. La coerenza in questa fase è fondamentale per ottenere risultati comparabili. Qui sono mostrati i dati grezzi rappresentativi di un ciclo sperimentale, comprese le scansioni del tampone e dell'acqua.I campioni analizzati sono tossine allo stato nativo e detossificato. Le scansioni dei campioni vengono elaborate separatamente per ricavare la temperatura di fusione e i valori di entalpia per ciascun campione. Per lo stato nativo, la temperatura di fusione è di 55,55 gradi Celsius e l'entalpia della tossina è di 3,157 volte 10 al quinto delle calorie per mole.Al contrario, la temperatura di fusione della tossina nel suo stato disintossicato è di 81,21 gradi Celsius e l'entalpia è di 3,656 volte 10 per quinta caloria per mole. La sovrapposizione dei dati elaborati della tossina nei suoi stati nativi e detossificati dimostra che il campione detossificato è termicamente più stabile del suo stato nativo secondo i valori della temperatura di fusione. Indica anche che il processo di disintossicazione introduce cambiamenti strutturali nella struttura terziaria della tossina.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fornire un'adeguata scorta di detergente e acqua per prevenire la contaminazione incrociata della cella e della siringa, poiché la loro trasparenza è fondamentale per ottenere risultati accurati. Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione della calorimetria differenziale a scansione come metodo per valutare la stabilità termica e la conformazione delle proteine. Sarai anche in grado di effettuare detrazioni significative dai cicli termici risultanti.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il dicroismo circolare per rispondere a ulteriori domande riguardanti le modifiche alle strutture secondarie durante lo sviluppo. I dati raccolti per una serie di lotti dello stesso prodotto sono stati utilizzati per creare linee di base empiriche per esaminare l'impatto dei cambiamenti di processo, della formulazione e delle condizioni di conservazione sulla conformazione della struttura degli antigeni proteici per la produzione di vaccini.

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Questo video dimostra la calorimetria differenziale a scansione, una tecnica per studiare l'interazione tra una biomolecola e un ligando. Il legame di un aptamero di DNA e di un ligando termolabile viene studiato applicando ripetuti cicli di riscaldamento e raffreddamento al campione e ottenendo scansioni per l'analisi termodinamica.

Calorimetria differenziale a scansione per studiare l'interazione tra aptamero e ligando termolabile del DNA

La miscelazione è un approccio efficace per generare biomateriali con una vasta gamma di proprietà e caratteristiche combinate. Per predire le interazioni molecolari tra diverse proteine ​​della seta naturale, nuove piattaforme lega proteine ​​della seta-seta con sintonizzabile resilienza meccanica, risposta elettrica, trasparenza ottica, lavorabilità chimica, biodegradabilità, stabilità termica o possono essere progettati.

Progettazione di materiali in lega di proteine ​​della seta-seta per le applicazioni biomediche

La fluorimetria differenziale a scansione è un metodo ampiamente utilizzato per lo screening di librerie di piccole molecole per interazioni con le proteine. Qui, presentiamo un metodo semplice per estendere queste analisi per fornire una stima della costante di dissociazione tra una piccola molecola e il suo partner proteico.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

Vi presentiamo un protocollo per la rapida caratterizzazione biomolecolare pieghevole e associazione interazioni con ligandi termolabile mediante calorimetria differenziale a scansione.

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

Un protocollo è presentato per testare rapidamente la stabilità termica delle proteine in una varietà di condizioni attraverso analisi termica spostamento e nano differenziale a scansione fluorimetria. Sistemi di polmonatura, sali e additivi, insieme che comprende tre schermate di stabilità unica, sono analizzati con le proteine per identificare buffer adatto per studi strutturali e funzionali.

Come stabilizzare proteina: stabilità schermi per Thermal Shift saggi e Nano differenziale a scansione fluorimetria nel progetto Virus-X

Misurazioni di aggancio di obiettivo di droga sono centrale per lo sviluppo di farmaci efficaci e convalida di sonda chimica. Qui, dettagliamo un protocollo per la misurazione l'impegno di droga-destinazione usando la formazione immagine contenuta elevata in micropiastra compatibile con l'adattamento del dosaggio cellulare spostamento termico (CETSA).

Con alto contenuto di Imaging per quantificare l'impegno di destinazione in cellule aderenti

Il monitoraggio delle variazioni della temperatura di fusione di una proteinabersaglio (ad es.saggio di spostamento termico, TSA) è un metodo efficiente per lo screening di librerie di frammenti di poche centinaia di composti. Presentiamo un protocollo TSA che implementa la fluorimetria a scansione nano-differenziale assistita da robotica (nano-DSF) per il monitoraggio della fluorescenza intrinseca del triptofano e la retrodepersione della luce per lo screening dei frammenti.

Fluorimetria a scansione nano-differenziale per lo screening nella scoperta di piombo basata su frammenti

Questa pubblicazione mostra l'applicazione della diffrazione a raggi X e della calorimetria differenziale a scansione come gold standard per lo studio dello stato solido degli eccipienti a base lipidica (LBE). Comprendere l'alterazione allo stato solido negli LBE e il suo effetto sulle prestazioni dei prodotti farmaceutici è il fattore chiave per la produzione di forme di dosaggio robuste a base lipidica.

Un pacchetto di strumenti analitici consolidati per studiare l'alterazione allo stato solido degli eccipienti a base lipidica

Questo protocollo descrive un metodo unico per rilevare il legame tra composti e molecole proteiche, offrendo i vantaggi di una perdita minima di campioni proteici e di un'elevata precisione dei dati.

Rilevamento dell'interazione proteina-umbelliferone CD40 tramite fluorescenza a scansione differenziale

L'interazione tra i canali HCN e la loro subunità accessoria è stato identificato come un obiettivo terapeutico nel Disturbo Depressivo Maggiore. Qui, un metodo di polarizzazione basato fluorescenza per identificare piccole molecole inibitrici di questa interazione proteina-proteina, è presentato.

Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

Scopri la calorimetria a scansione differenziale per valutare la stabilità termica e la conformazione delle proteine antigeniche nei vaccini. Questo metodo misura direttamente la temperatura di transizione termica e l'energia di denaturazione.

Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dellantigene (Video) | JoVE Journal

Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dell'antigene

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