Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dell'antigene

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di valutare la stabilità termica e la conformazione strutturale delle proteine in un ambiente industriale utilizzando la calorimetria differenziale a scansione. La calorimetria differenziale a scansione misura la capacità termica molare dei campioni in funzione della temperatura ed è stata utilizzata con successo per valutare la stabilità termica e la conformazione strutturale delle proteine. Questa procedura relativamente semplice non dipende dall'elicità strutturale o dai fluorofori intrinseci come nel caso di altri metodi biofisici.

Un altro vantaggio di questa tecnica è che misura direttamente la temperatura di transizione termica e l'energia necessaria per interrompere l'interazione stabilizzando la struttura terziaria delle proteine. Se utilizzata in combinazione con l'entusiasmo dello spiegamento, la temperatura di transizione termica può fungere da parametro utile per monitorare la coerenza tra i lotti dei processi di produzione dei farmaci biologici. La dimostrazione visiva di questo metodo può fungere da mezzo interattivo per assistere efficacemente i nuovi utenti nei passaggi critici.

Per iniziare, accendi il calorimetro differenziale a scansione. Quindi fornire azoto al sistema. Ciò aumenterà la pressione nelle celle per sopprimere l'ebollizione dei campioni e prevenire la formazione di bolle a temperature elevate.

A seconda del materiale costitutivo della cella, regolare la pressione dell'alimentazione dell'azoto gassoso in base alla pressione consigliata dal produttore per evitare di danneggiare la cella. Assicurarsi che tutti i serbatoi del detergente siano riempiti al volume richiesto. I detergenti necessari includono un detergente per lavare la cella e acqua per pulire la cella dopo ogni campionamento.

Impostare la temperatura del vano di contenimento del campione su un valore adeguato, preferibilmente cinque gradi Celsius, per mantenere l'integrità del campione prima dell'esperimento. È importante bilanciare il campione con il tampone per garantire che l'unica differenza tra le soluzioni sia la proteina. Pertanto, la differenza osservata nella capacità termica può essere correttamente attribuita alla proteina.

Determinare la concentrazione del campione proteico utilizzando un metodo di determinazione della concentrazione proteica adatto come il metodo Lowry. Per lo strumento utilizzato in questo protocollo, l'intervallo di lavoro preferibile è compreso tra 0,5 e un milligrammo di proteine per millilitro. Dializzare il campione rispetto al buffer che verrà utilizzato come riferimento per l'esperimento.

Degassare il campione e il tampone di riferimento sotto vuoto per eliminare le microbolle che possono causare imprecisioni di volume. Lavorando in una cappa di biocontenimento a flusso laminare, utilizzare una micropipetta e puntali sterili per caricare i campioni nel rispettivo tampone a coppie in piastre da 96 pozzetti. Riempire le prime due coppie di pozzetti con il tampone per eseguire scansioni tampone-tampone per verificare l'idoneità dello strumento prima della misurazione del campione.

Riempi le ultime due coppie di pozzetti con acqua per la scansione dell'acqua per pulire le celle. Quindi coprire la piastra a 96 pozzetti con pellicola sigillante. Assicurarsi che i pozzetti siano adeguatamente sigillati prima di estrarre la piastra dalla cabina di biosicurezza per evitare la contaminazione del campione.

Infine, posizionare la piastra nello scomparto di contenimento del campione con l'orientamento corretto. Utilizzando il software di acquisizione, inserire le informazioni del campione nell'ordine in cui è stata caricata la lastra. Inserisci le concentrazioni proteiche, se disponibili.

In caso contrario, inserire la concentrazione nel software di analisi prima dell'analisi dei dati. Selezionare l'opzione che garantisce la pulizia della cella con detergente prima di ogni scansione del campione. La pulizia deve essere seguita da più fasi di risciacquo con acqua per garantire che non rimangano residui di detersivo nelle celle.

Impostare la temperatura iniziale dell'esperimento a 20 gradi Celsius, che può variare a seconda del campione. Per le proteine note, è possibile utilizzare una temperatura iniziale predeterminata, mentre una temperatura iniziale più bassa può essere applicata per campioni sconosciuti. Quindi impostare la temperatura finale dell'esperimento.

La temperatura finale può variare anche a seconda della conoscenza preliminare del campione. Quindi, imposta la velocità di scansione dell'esperimento. Si consiglia di scansionare campioni sconosciuti a diverse velocità di scansione per valutare la cinetica di dispiegamento.

Impostare il software di acquisizione per eseguire nuovamente la scansione dei campioni per esaminare la reversibilità della transizione termica. Il dispiegamento di una proteina è considerato reversibile se l'entalpia ottenuta per la seconda scansione è almeno l'80% del valore di entalpia della prima scansione. Impostare il termostato post-esperimento a 10 gradi Celsius per preservare l'integrità della cella calorimetrica.

Verificare che i parametri di configurazione dell'esperimento siano corretti prima di eseguire l'esperimento. Se tutto è a posto, inizia l'esperimento. Dopo l'esperimento, eseguire l'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo.

Per l'analisi, la sottrazione della linea di base viene eseguita manualmente. La coerenza in questa fase è fondamentale per ottenere risultati comparabili. Qui sono mostrati i dati grezzi rappresentativi di un ciclo sperimentale, comprese le scansioni del tampone e dell'acqua.

I campioni analizzati sono tossine allo stato nativo e detossificato. Le scansioni dei campioni vengono elaborate separatamente per ricavare la temperatura di fusione e i valori di entalpia per ciascun campione. Per lo stato nativo, la temperatura di fusione è di 55,55 gradi Celsius e l'entalpia della tossina è di 3,157 volte 10 al quinto delle calorie per mole.

Al contrario, la temperatura di fusione della tossina nel suo stato disintossicato è di 81,21 gradi Celsius e l'entalpia è di 3,656 volte 10 per quinta caloria per mole. La sovrapposizione dei dati elaborati della tossina nei suoi stati nativi e detossificati dimostra che il campione detossificato è termicamente più stabile del suo stato nativo secondo i valori della temperatura di fusione. Indica anche che il processo di disintossicazione introduce cambiamenti strutturali nella struttura terziaria della tossina.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fornire un'adeguata scorta di detergente e acqua per prevenire la contaminazione incrociata della cella e della siringa, poiché la loro trasparenza è fondamentale per ottenere risultati accurati. Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione della calorimetria differenziale a scansione come metodo per valutare la stabilità termica e la conformazione delle proteine. Sarai anche in grado di effettuare detrazioni significative dai cicli termici risultanti.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il dicroismo circolare per rispondere a ulteriori domande riguardanti le modifiche alle strutture secondarie durante lo sviluppo. I dati raccolti per una serie di lotti dello stesso prodotto sono stati utilizzati per creare linee di base empiriche per esaminare l'impatto dei cambiamenti di processo, della formulazione e delle condizioni di conservazione sulla conformazione della struttura degli antigeni proteici per la produzione di vaccini.