Un'analisi di Microarray della proteina per determinazione sierologica dell'infezione di Clostridium difficile anticorpo seguenti risposte antigene-specifiche

Questo metodo può aiutare a ottimizzare e selezionare immunoterapie clinicamente utili per l'infezione da Clostridium difficile in modo specifico per il paziente e a chiarire le risposte immunitarie umane al Clostridium difficile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una quantificazione accurata e simultanea delle risposte anticorpali multi-isotipiche e specifiche del ceppo agli antigeni di C.difficile. In generale, le persone che sono nuove a questo metodo avranno difficoltà perché è richiesta esperienza nella creazione e nell'ottimizzazione di un pannello di antigeni altamente purificati e nella configurazione della piattaforma tecnologica.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i tipi di elenchi metodologici coinvolti nella preparazione della piastra a microonde, la stampa degli array, una procedura sicura e l'analisi dei dati richiedono attenzione ai dettagli. La dimostrazione di alcune delle procedure sarà affidata a Sam Greenwood, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, diluire gli antigeni del Clostridium difficile e il tampone di stampa alla concentrazione ottimale.

Quindi, trasferire 10 microlitri di soluzione antigenica in una piastra da 384 pozzetti. Coprire la piastra con un sigillo per piastre e centrifugare a 300 volte la gravità per cinque minuti a temperatura ambiente. Per la stampa di microarray, utilizzare un bruciatore a gas portatile per riscaldare il PIN di silicio tre volte per due secondi ciascuna.

Quindi, sciacquare il PIN in silicone in acqua pulita tre volte per tre secondi ciascuna. Posizionare la piastra del microarray nella cartuccia di caricamento di un arrayer. Espellere il vassoio, quindi posizionare i vetrini di amminosilano nel vassoio dei vetrini e premere il pulsante OK per accendere l'aspirapolvere.

Assicurarsi che tutte le diapositive siano fissate, quindi fare clic su OK. Rimetti il vassoio all'origine e chiudi il coperchio. Successivamente, avvia il programma appropriato e vai su File, quindi su Parametri di microarraying, quindi su Apri. Selezionare il file Clostridium difficile per stampare tutti gli antigeni in quadruplice.

In questa finestra, aprire la scheda Origine per indicare l'archiviazione del campione e la scheda Destinazione per inserire i dettagli del microarray. Quindi, apri la scheda Opzioni per selezionare lo strumento di lavaggio. Nella scheda Generale di Preferenze di esecuzione, sulla barra degli strumenti della suite di applicazioni TAS, selezionare Lava all'inizio dell'esecuzione e Lava alla fine dell'esecuzione.

Apri la scheda Clima e imposta il livello di umidità tra il 55 e il 60%Ora avvia la corsa e controlla periodicamente l'array per assicurarne il corretto funzionamento. Dopo la stampa, posizionare con cura i vetrini stampati in un supporto per vetrini con 16 camere a più pozzetti. Quindi aggiungere 100 microlitri di BSAT al 5% a ciascun blocco.

Coprire i vetrini e incubare per un'ora a temperatura ambiente agitando. Utilizzare 120 microlitri di PBST per lavare ogni blocco cinque volte per un minuto ciascuna con agitazione. Successivamente, scongelare i campioni di siero ottenuti da pazienti infetti da C difficile e controlli sani su ghiaccio per 20 minuti.

Aggiungere il diluente anticorpale disponibile in commercio al blocco master, quindi aggiungere campioni al blocco master e mescolare. Scartare il tampone di lavaggio e aggiungere 100 microlitri di ciascun campione diluito ai blocchi sperimentali. Per il blocco di controllo negativo, aggiungere 100 microlitri di solo diluente anticorpale.

Quindi, incubare i vetrini per un'ora a temperatura ambiente agitando delicatamente. Quindi, utilizzare 120 microlitri di PBST per lavare ogni blocco cinque volte per tre minuti ciascuna con agitazione. Quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo anti-umano di capra biotinilato diluito in diluente anticorpale a ciascun blocco.

Coprire i vetrini e incubare per un'ora a temperatura ambiente agitando delicatamente. Utilizzare 120 microlitri di PBST per lavare ogni blocco cinque volte per tre minuti ciascuna con agitazione. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di streptavidina SY5 coniugato diluito al 5% di BSAT, in un rapporto da uno a duemila per ogni blocco.

Coprire i vetrini con un foglio di alluminio e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente. Lavare prima i vetrini con 120 microlitri di PBST cinque volte per un minuto ciascuno, quindi lavarli altre due volte per un minuto ciascuno con PBS. Per asciugare i vetrini, farli girare per cinque minuti a 300 volte la gravità.

Accendere lo scanner laser 30 minuti prima della scansione, per consentirne il riscaldamento. Quindi posizionare il vetrino nello scanner con la superficie stampata rivolta verso l'alto fino a quando la luce della lastra diventa verde fissa. Quindi, premi il pulsante Impostazioni.

Nella prima scheda, assicurarsi che lo scorrimento automatico e il codice a barre siano deselezionati. Quindi, impostare la dimensione dei pixel su 10, la modalità di scansione su Media, l'acquisizione solo su 635, la modalità di acquisizione su Manuale, il guadagno su 20 e la potenza su bassa. Nella seconda scheda, assicurarsi che il tipo di diapositiva non sia etichettato.

Nella terza scheda, impostare la messa a fuoco su Messa a fuoco automatica. Premere il pulsante di importazione della griglia per selezionare l'elenco di array appropriato associato all'immagine acquisita. Quindi, premere il pulsante di ricerca automatica per allineare la griglia ai punti sulla diapositiva.

Infine, premere il pulsante Processo di quantificazione per misurare l'intensità della fluorescenza di ogni punto. Quindi, salva i risultati in un formato appropriato per ulteriori analisi. In questo protocollo, un microarray di proteine viene confrontato con ELISA per valutare la riproducibilità tra queste due tecniche.

L'analisi del coefficiente di correlazione di Spearman mostra un accordo significativo tra il microarray e l'ELISA per rilevare i livelli di IgG, anti-tossina A e anti-tossina B nei campioni di siero. La riproducibilità del saggio introduttivo e interdosario del micro array proteico viene calcolata utilizzando i campioni di siero di sette pazienti. I campioni analizzati su due diversi vetrini di array contro la tossina A, la tossina B, SLP001, SLP002, SLP027, la tossina B della tossina B che produce solo il ceppo CCUG e gli antigeni pCDTb rivelano una buona riproducibilità.

Viene eseguito un microarray proteico per rilevare una risposta anticorpale isotipo-specifica contro le tossine del Clostridium difficile. I campioni di siero di pazienti e individui sani vengono utilizzati per rilevare i livelli di IgG e IgA contro la tossina A, la tossina B, la tossina B da un ceppo che esprime solo la tossina B di Clostridium difficile e la forma precursore di un frammento B della tossina binaria. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette ore.

Prima di eseguire i campioni, è necessario valutare l'esperimento di controllo della qualità, diversi parametri come la selezione di una chimica di superficie appropriata, i tamponi di stampa, i tamponi di blocco e le diluizioni dei campioni di siero e degli anticorpi secondari. La stampa di un array di alta qualità richiede una buona conoscenza dell'array o del software per regolare la stampa dei parametri in base al protocollo sperimentale. È fondamentale mantenere le prestazioni ottimali dell'arrayer e un ambiente privo di polvere durante l'esperimento.

Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia e della biologia molecolare, in termini di caratterizzazione delle risposte immunitarie umorali all'infezione e di scoperta di antigeni sierodiagnostici. Non dimenticare che lavorare con campioni di sangue infetti e tossine batteriche può essere pericoloso. In generale, in laboratorio, durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese in considerazione le precauzioni standard e di sicurezza.