Name: Unanalisi di Microarray della proteina per determinazione sierologica dellinfezione di Clostridium difficile anticorpo seguenti risposte antigene-specifiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Scopri il metodo di microarray proteico per profilare le risposte anticorpali umorali contro gli antigeni di Clostridium difficile nei sieri umani. Questa tecnica consente la quantificazione accurata di anticorpi multi-isotipo e ceppo-specifici.

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Questa ricerca è stata sostenuta da una borsa di Hermes da Ola Negm e Tanya Monaghan e attraverso finanziamento separato dal centro di malattie Digestive di Nottingham e il NIHR Nottingham digestivi malattie Biomedical Research Centre.

1. preparazione di un piatto di Microarray
<ol><li>Diluire gli antigeni di c. difficile con un buffer di stampa [PBS-Tween-trealosio (50mm)] alla concentrazione ottima (che è stata predefinita prima di eseguire i sieri dei pazienti): tossina A (200 µ g/mL) e tossina B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL) e nativo purificato SLPs tutta derivata da ribotypes 001, 002 e 027 (200 µ g/mL). Nota: La tossina B è stata ottenuta da una tossina B-esprimendo ceppo CCUG 20309 (90 µ g/mL).<ol>
<li>Diluire i controlli positivi, lisati di albicans del c.e tossoide tetanico con il buffer di stampa a 100 µ g/mL. Infine, diluire l'immunoglobulina umana purificata matching l'isotipo dell'anticorpo testati in serie, a partire da 50 µ g/mL in tutto 10 diluizioni nel buffer di stampa per creare una curva di calibrazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire 10 µ l delle diluizioni nel buffer di stampa in una piastra 384 pozzetti.</li>
	<li>Coprire la piastra con un sigillo di piastra e centrifugare a 300 x g per 5 min.</li>
</ol>2. stampa matrici con un Robot contatto
<ol><li>Calore il perno di silicio con il bruciatore a gas portatile 3 x 2 s ogni e sciacquare in acqua pulita 3x3 s ciascuno.</li>
	<li>Posizionare la piastra di microarray nella cartuccia caricamento della arrayer.</li>
	<li>Porre i vetrini inibitori sulla barra di scorrimento. Nota: Il vassoio di diapositiva può contenere 27 diapositive: tre righe di nove diapositive. Le diapositive sono disposte in verticale a partire dal lato sinistro della riga inferiore e il resto degli spazi sono coperti con diapositive vuote per garantire che tutti i fori sul vassoio scorrevole sono coperti.<ol>
<li>Premere OK e verificare che un vuoto è stato acceso e tutte le diapositive sono sicure. Lasciare le diapositive in ambiente umido per almeno 1 h prima di iniziare la stampa. Nota: Le diapositive di inibitori sono disponibili in una confezione sigillata con essiccante. Una volta aperto, tutte le diapositive non utilizzate devono essere restituite immediatamente nell'essiccatore per deposito fino alla data di scadenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare il programma di stampa adatto per stampare gli antigeni di Clostridium difficile . Lanciare la Suite di applicazioni di TAS e aprire il file di parametri di esecuzione stampa richiesti dalla directory 'My Gridding corre'. Selezionare file di Clostridium difficile per la stampa di tutti gli antigeni di Clostridium difficile in quadruplice copia.</li>
	<li>Al momento facendo doppio clic sull'icona di MicroArray nella finestra principale verrà visualizzata una finestra di tre-a schede chiamato 'MicroArraying parametri'.  Le tre schede sono "Fonte", "Target" e "Opzioni". La scheda "Origine" Mostra dettagli il numero di campioni utilizzati nella piastra di microarray. La scheda di "Target" Mostra i dettagli di come le diapositive devono essere caricati, dove la matrice deve essere stampato sulla diapositiva e modificare il layout della diapositiva (16 sottomatrice formati). La scheda "Opzioni" Mostra dettagli del protocollo di lavaggio e strumento per essere usato per esempio. lavare dopo ogni campione completato. Pulire il perno di silicio tra campioni per evitare qualsiasi contaminazione incrociata tra diversi campioni.</li>
	<li>Le opzioni di programmazione si trovano in Opzioni > Preferenze eseguire sulla barra TAS Application Suite. Ci sono 9 schede di lavorare attraverso in questa sezione e come si completa una scheda spostarsi al successivo facendo clic su di esso. Cliccando il pulsante "OK" vi porterà fuori "Esegui preferenze". Nella scheda "Generale" delle preferenze"Run", ci sono un numero di caselle di controllo disponibili in questa sezione relativa a come lo strumento si comporterà quando un programma viene avviato. Selezionare la casella di "Bagno primo prima di inizio di esecuzione", tutte le stazioni di lavaggio tre subirà una sequenza breve innesco prima dell'inizio di esecuzione. Seleziona la casella "Lavare a inizio di esecuzione", lo strumento perno sarà lavato prima di visitare la prima fonte. Spunta la casella "Wash al termine della corsa", lo strumento perno sarà lavato dopo l'origine Ultima visita. L'utente può impostare il numero di cicli di lavaggio. Nella scheda "Clima" delle preferenze"Run", avviare l'umidificazione. L'impostazione che usiamo sono come segue: avviare tasso 55%, eseguire tasso 55%, umidità minima 55%, destinazione umidità 60%. Non avviare l'esecuzione fino a quando viene raggiunta l'umidità di destinazione, altrimenti le macchie saranno la taglia sbagliata e la libreria evaporano rapidamente.</li>
	<li>Nella barra menu di TAS, fare clic sul pulsante verde vanno.  Avviare l'esecuzione e osservare periodicamente arrayer durante la tiratura per essere certi che tutto è OK. Nota: In questo modo l'analisi di 15 campioni in parallelo su ogni diapositiva come una sottomatrice viene utilizzato come controllo negativo. Il design delle sottomatrici è determinato dal numero delle proteine stampate (antigeni) e il numero del biologico stampato replica. Nota: Dopo la stampa di ogni campione, la testa si muove verso le vasche di lavaggio per consentire più immersione del perno in due vasche di lavaggio contenente acqua distillata e 0,002% Tween 20 per 1.5 s in ogni bagno, seguita da risciacquo il perno con acqua ultra-pura e asciugatura il pin in la stazione di lavaggio principale per 4 s.</li>
</ol>3. stoccaggio delle matrici
<ol><li>Mantenere le diapositive stampate immagazzinate durante la notte a temperatura ambiente in un essiccatore. Nota: Le diapositive stampate possono essere memorizzate fino a una settimana.</li>
</ol>4. matrice di sondaggio
<ol><li>Posizionare delicatamente diapositive stampate in un supporto per diapositive di formato di 16 camere multi-pozzetto. Nota: Le camere, con una profondità di circa 7,5 mm, forniscono una generosa superficie in rapporto al volume per facilitare la miscelazione e fasi di lavaggio.</li>
	<li>Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell'uso. Se non specificato diversamente, eseguire le seguenti operazioni a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di filtrato interpolazione di 5% di albumina di siero bovino (BSAT; uso una siringa filtro 0,2 µm) per ogni blocco, coprire le diapositive e li incubare con agitazione per 1 h.</li>
	<li>Lavare i vetrini 5 x 1 min ciascuno in 120 µ l di tampone fosfato salino con Tween 20 (PBST; 0,1% Tween) per pozzetto con agitazione. Le diapositive non lasciare asciugare.</li>
	<li>Scongelare i campioni di siero in ghiaccio per 20 minuti e diluire ogni campione con un anticorpo commercialmente disponibile diluente con sfondo riducendo la componente (Vedi Tabella materiali).<ol>
<li>Ottimizzare la diluizione dei campioni secondo la testata dell'immunoglobulina del siero come mostrato nella tabella 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire 100 µ l dei campioni siero diluito a tutti i blocchi tranne uno, che sarà utilizzato come controllo negativo; a questo blocco, aggiungere 100 µ l di anticorpo diluente solo. Incubare i vetrini con delicata agitazione per 1 h.</li>
	<li>Lavare i vetrini 5 x 3 min ciascuno in 120 µ l di PBST (0.1% Tween) per pozzetto con agitazione.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di un anticorpo anti-umano di biotinylated capra diluito con diluente dell'anticorpo.<ol>
<li>Ottimizzare la diluizione dell'anticorpo secondario secondo l'immunoglobulina testato come descritto nella tabella 2. Coprire i vetrini e li incubare con agitazione delicata per 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare i vetrini 5 x 3 min ogni 120 µ l di PBST con agitazione.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di streptavidina Cy5 a ogni blocco diluito a 1: 2000 in 5% BSA. Coprire i vetrini con un foglio per proteggerli dalla luce mentre agitando per 15 minuti con agitazione delicata.</li>
	<li>Lavare i vetrini 5 x 1 min ciascuno in 120 µ l di PBST per pozzetto con agitazione, seguita da 2 lavaggi di 1min ogni in PBS solo con agitazione.</li>
	<li>Girare le diapositive per 5 min a 300 x g per asciugarle.</li>
	<li>Tenere i vetrini in una scatola scuro per trasporto e stoccaggio a temperatura ambiente.</li>
	<li>Procedere alla scansione delle matrici immediatamente per garantire la coerenza del segnale dopo il sondaggio. Nota: Tuttavia, sondati diapositive possono essere conservati al buio e analizzati entro una settimana dal sondaggio.</li>
</ol>5. scansione delle matrici
<ol><li>Accendere il laser scanner (Vedi Tabella materiali) 30 min prima della scansione per scaldare il laser. Caricare il software dello scanner e collegare il computer allo scanner.</li>
	<li>Inserire una diapositiva con il lato stampato verso l'alto nello scanner fino a quando la riproduzione della luce diventa verde fisso.</li>
	<li>Premere il pulsante Impostazioni e modificare le seguenti impostazioni durante la scansione le diapositive come segue: modalità di scansione, mediana; Acquisizione, 635 solo; Modalità di acquisizione, manuale; Guadagno, 20; Potenza, basso; Tipo di diapositiva, diapositiva senza etichetta; Messa a fuoco, messa a fuoco automatica. Disattivare lo scorrimento automatico e impostare Barcode Reading Pixel dimensioni 10 e 35 Scan.</li>
	<li>Salvare le immagini risultanti come 16-bit scala di grigi più il formato immagine TIFF. Premere il pulsante di Importazione griglia e selezionare l'elenco di matrice appropriata. Nota: L'elenco di matrice descrive le dimensioni e la posizione delle sottomatrici e i nomi delle sostanze stampate associate a ciascun indicatore di funzione.<ol>
<li>Allineare la griglia per le macchie sulla diapositiva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare le immagini premendo il pulsante di processo di quantificazione per misurare l'intensità del segnale di fluorescenza di ogni spot e salvare i risultati in un formato di testo chiamato GenePix risultati (GPR). Nota: Il file GPR contiene le variabili di localizzazione e identificazione degli obiettivi dell'antigene sulla matrice e anche l'intensità della fluorescenza mediano e lo sfondo locale che rappresenta l'associazione di anticorpo segnalare valori di ogni spot.</li>
</ol>6. analisi dei dati
<ol><li>Calcolare la mediana per le repliche di ogni antigene dopo la sottrazione di sfondo utilizzando un software di analisi di microarray gratuito chiamato analizzatore di fase inversa proteina matrice (RPPA), un modulo all'interno del linguaggio statistico R su CRAN36.</li>
	<li>Tracciare la curva standard e interpolare i segnali di ogni antigene rispetto alla curva standard di immunoglobulina utilizzo commerciale grafica scientifica e software di statistiche (Vedi Tabella materiali) per calcolare i livelli dell'anticorpo.</li>
</ol>

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In questo protocollo, abbiamo dimostrato che microarray è una piattaforma adatta per definire le risposte immunitarie umorali agli antigeni della proteina c. difficile in sieri dei pazienti (figure 3 e 6) e preparazioni commerciali di IVIg (Figura 5). Abbiamo anche dimostrato che la tecnica di microarray esegue anche quando rispetto ai convenzionale ELISA (Figura 2) e Mostra eccellente riproducibilità, con variabilità i...

Questo protocollo descrive lo sviluppo e la convalida di un'analisi di microarray della proteina di romanzo e su misura per il rilevamento e semi-quantificazione del ceppo batterico e le risposte specifiche dell'isotipo dell'anticorpo agli antigeni di c. difficile . Utilizziamo con successo la nostra difficile del c.-analisi di microarray specifici come un promettente nuovo strumento per la bioanalysis compositiva del contenuto di anticorpi specifici nei sieri dei pazienti1,2, preparazioni di IVIg3, e identificazione delle specificità dell'anticorpo che correlano con i risultati difficili in CDI4. Dimostriamo come campioni di siero biobanked e preparazioni commerciali di IVIg possono essere analizzate su diapositive di microarray, che permette alta qualità riproducibile profilatura delle risposte di agente patogeno specifico anticorpo di c. difficile in questo test.
Molti bambini sani e adulti hanno anticorpi IgG e IgA siero rilevabile c. difficile tossine A e B5,6. Questi sono pensati per risultare a seguito di esposizione transitoria durante l'infanzia e dopo esposizione a c. difficile in età adulta. Per questo motivo, policlonali IVIg è stato utilizzato off-label per il trattamento sia ricorrente e fulminante CDI7,8,9. Tuttavia, il suo ruolo definitivo e modalità di azione rimane poco chiaro. Parecchi studi hanno indicato che la risposta immunitaria umorale alle tossine di c. difficile svolge un ruolo nella presentazione della malattia e nel risultato. In particolare, i pazienti asintomatici mostrano una concentrazione aumentata del siero anti-tossina A IgG rispetto ai pazienti che sviluppano la malattia sintomatica10. Un'associazione dimostrabile è stata segnalata per i titoli di IgG A di mediano anti-tossina e mortalità per qualsiasi causa 30 giorni11. Parecchi rapporti hanno rivelato anche un'associazione con una protezione contro le risposte di ricorrenza e l'anticorpo per la tossina A, B e diversi antigeni non-tossina (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD e proteine di strato di superficie (SLP))12,13 , 14 , 15. queste osservazioni hanno stimolato lo sviluppo del primo immunoterapia passiva drug targeting c. difficile tossina B (bezlotuxumab), che è stato recentemente approvato dalla US Food and Drug Administration e l'Agenzia europea dei Agenzia per la prevenzione di ricorrenti CDI16. Strategie vaccinali utilizzando le tossine inattivate o frammenti di tossina ricombinante sono inoltre attualmente in sviluppo17,18,19. Questi nuovi approcci terapeutici senza dubbio stimolerà il requisito per valutare le risposte immunitarie umorali agli antigeni multipli in campioni di grandi dimensioni.
Oggi, c'è una notevole mancanza di saggi ad alta velocità disponibile in commercio in grado di valutare contemporaneamente il ceppo batterico e le risposte specifiche dell'isotipo dell'anticorpo agli antigeni di c. difficile . C'è un bisogno insoddisfatto per sviluppare tali dosaggi per facilitare gli sforzi di ricerca futura e applicazioni cliniche. Microarrays della proteina sono un metodo per immobilizzare un numero elevato di proteine purificate individualmente come matrice spazialmente organizzata dei punti su una superficie basata su vetrino al microscopio utilizzando un sistema robotico, che può essere un contatto20 o un non-contatto stampa strumento21. Le macchie possono rappresentare miscele complesse come lisati cellulari, anticorpi, omogenati, proteine endogene o ricombinante o peptidi, fluidi corporei o farmaci22,23.
Tecnologia di microarray della proteina offre chiari vantaggi rispetto a standard in-House ELISA tecniche, che sono stati tradizionalmente usati per valutare le risposte di anticorpi di anti -c. difficile . Questi includono una maggiore capacità per la rilevazione di una gamma di multi-specifici anticorpi contro un pannello più ampio di bersagli proteici, requisiti di volume ridotto per gli antigeni, campioni e reagenti e una maggiore capacità di incorporare una più grande numero di repliche tecniche, oltre a controllo di qualità interno multiple (QC) misura1. I microarrays sono quindi più sensibile, accurato e riproducibile e hanno una maggiore gamma dinamica. Questi fattori rendono i microarrays un'alternativa più conveniente e potenzialmente favorevole a Elisa per la rilevazione su larga scala di proteine note. Tuttavia, gli svantaggi della tecnologia microarray dovuti principalmente i grandi costi iniziali associati che istituisce un pannello di antigeni altamente purificati e la creazione della piattaforma tecnologica.
Microarrays della proteina sono stati ampiamente utilizzati negli ultimi due decenni come strumento di ricerca diagnostica di base in applicazioni cliniche. Applicazioni specifiche includono l'espressione della proteina di profilatura, lo studio delle relazioni di enzima-substrato, lo screening biomarcatore, analisi delle interazioni ospite-microbo e profilatura anticorpo specificità23,24, 25,26,27,28. Molti nuovo agente patogeno/antigene della proteina microarrays sono stati stabiliti, tra cui la malaria (Plasmodium)29, HIV-130, riossidazione31, sindrome respiratoria acuta grave (SARS)32, febbre emorragica virale33 , herpesvirus34e35di tubercolosi.
Il presente protocollo si riferisce all'istituzione di un facile funzionamento C. difficile reattiva dosaggio dell'antigene microarray, che consente la quantificazione precisa e specifica di multi-isotipo e le risposte dell'anticorpo specifico ceppo di C. difficile antigeni nel siero e policlonale IVIg. Nel presente documento, includiamo risultati rappresentativi relativi ad una prestazione di analisi di microarray di accettabile rispetto a ELISA così come dosaggio precisione e riproducibilità profili. Questo test potrebbe essere ulteriormente sviluppato per profilare altri campioni clinici e stabilisce un nuovo standard per la ricerca della base molecolare della CDI.

<table><tbody><tr><td>BioRobotics MicroGrid II arrayer</td><td>Digilab, Malborough, MA, USA</td><td>N/A</td><td>Array di contatti utilizzato per l'individuazione automatizzata degli antigeni sui vetrini.</td></tr><tr><td>Scanner InnoScan 710.</td><td>Innopsys</td><td>N/A</td><td>Uno scanner fluorescente per vetrini microarray con un laser rosso (Cy5) per leggere la reazione.</td></tr><tr><td>Software MAPIX versione 7.2.0</td><td>Innopsys</td><td>N/A</td><td>Misura l'intensità del segnale degli spot.</td></tr><tr><td>Perno di contatto in silicio</td><td>Tecnologie di sintesi parallela</td><td>SMT-P75</td><td>Stampa i campioni sui vetrini.</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Essiccatore</td><td>Thermo Scientific</td><td>41102426</td><td>Per conservare i vetrini nuovi e stampati.</td></tr><tr><td>Piastra a 384 pozzetti</td><td>Genetix</td><td>X7022UN</td><td>Per preparare gli antigeni.</td></tr><tr><td>Coperchio della piastra</td><td>Sigma Aldrich, Regno Unito</td><td>CLS6570-100EA</td><td>Per ridurre l'evaporazione dei campioni.</td></tr><tr><td>Aminosilane scivola</td><td>Schott,&nbsp; Germania</td><td>1064875</td><td>La diapositiva preferita per la stampa degli antigeni.</td></tr><tr><td>Supporti per vetrini</td><td>GraceBio Labs, USA</td><td>204862</td><td>Dividi i vetrini in 16 sottoarray identici. Questi supporti sono pozzetti riutilizzabili, rimovibili e a prova di perdite.</td></tr><tr><td>Candida albicans lisato</td><td>NIBSC</td><td>PR-BA117-S</td><td>Controllo positivo</td></tr><tr><td>Tossoide del tetano</td><td>Atene Ricerca e Tecnologia</td><td>04/150</td><td>Controllo positivo</td></tr><tr><td>Immunoglobulina G (IgG), Plasma Umano Normale</td><td>&nbsp; Atene ricerca e&nbsp; tecnologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707</td><td>Immunoglobuline G G native purificate, plasma umano.</td></tr><tr><td>Immunoglobulina G1 (IgG1), plasma umano normale</td><td>&nbsp; Atene ricerca e&nbsp; tecnologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-1</td><td>Immunoglobulina umana nativa purificata G1 IgG1, plasma umano.</td></tr><tr><td>Immunoglobulina G2 (IgG2), plasma umano normale</td><td>&nbsp; Atene ricerca e&nbsp; tecnologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-2</td><td>Immunoglobulina umana nativa purificata G2 IgG2, plasma umano.</td></tr><tr><td>Immunoglobulina G3 (IgG3), plasma umano normale</td><td>&nbsp; Atene ricerca e&nbsp; tecnologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-3</td><td>Immunoglobulina umana nativa purificata G3 IgG3, plasma umano.</td></tr><tr><td>Immunoglobulina G4 (IgG4), plasma umano normale</td><td>&nbsp; Atene ricerca e&nbsp; tecnologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-4</td><td>Immunoglobulina umana nativa purificata G4 IgG4, plasma umano.</td></tr><tr><td>Immunoglobulina A (IgA), plasma umano</td><td>&nbsp; Atene ricerca e&nbsp; tecnologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090701</td><td>Immunoglobulina umana nativa purificata A (IgA), plasma umano.</td></tr><tr><td>Immunoglobulina A1 (IgA1), plasma di mieloma umano</td><td>&nbsp; Atene ricerca e&nbsp; tecnologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090701-1M</td><td>Immunoglobulina umana nativa purificata A1 (IgA1), plasma umano.</td></tr><tr><td>Immunoglobulina A2 (IgA2), plasma di mieloma umano</td><td>&nbsp; Atene ricerca e&nbsp; tecnologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090701-2M</td><td>Immunoglobulina umana nativa purificata A2 (IgA2), plasma umano.</td></tr><tr><td>Immunoglobuline M (IgM), plasma umano</td><td>&nbsp; Atene ricerca e&nbsp; tecnologia&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090713</td><td>Immunoglobulina umana nativa purificata M (IgM), plasma umano.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-IgG umano di capra biotinilato, specifico per la catena gamma</td><td>Vector Labs</td><td>BA-3080</td><td>L'anticorpo IgG umano (&gamma;-specifico per la catena)-biotina di capra reagisce specificamente con le IgG umane ma non con altre immunoglobuline.</td></tr><tr><td>Cerniera IgG1 anti-uomo per topo-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9052-08&nbsp;</td><td>L'anticorpo della biotina IgG1 umana di capra reagisce specificamente con le IgG1 umane ma non con altre immunoglobuline.</td></tr><tr><td>Topo Anti-Umano IgG2 Fc-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9060-08&nbsp; &nbsp;</td><td>L'anticorpo IgG2-biotina umana di capra reagisce specificamente con le IgG 2 umane, ma non con altre immunoglobuline.</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human IgG3 cerniera-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9210-08&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>L'anticorpo IgG3-biotina umana di capra reagisce specificamente con le IgG3 umane ma non con altre immunoglobuline.</td></tr><tr><td>Topo Anti-Umano IgG4 pFc'-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9190-08&nbsp; &nbsp;</td><td>L'anticorpo IgG-biotina umana di capra reagisce specificamente con le IgG umane ma non con altre immunoglobuline.</td></tr><tr><td>Anti-IgA umane, specifiche per la catena alfa, prodotte in capra - Biotinylated</td><td>Vector Labs</td><td>BA-3030</td><td>L'anticorpo IgG -biotina umana di capra reagisce specificamente con le IgG umane ma non con altre immunoglobuline.</td></tr><tr><td>L'anticorpo IgG-biotina umana di topo</td><td>Southern Biotec</td><td>9130-08</td><td>reagisce specificamente con le IgG umane ma non con altre immunoglobuline.</td></tr><tr><td>Topo anti-umano IgA2-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9140-08&nbsp; &nbsp;</td><td>L'anticorpo IgG -biotina umana di capra reagisce specificamente con le IgG umane ma non con altre immunoglobuline.</td></tr><tr><td>Topo Anti-Umano IgM-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9020-08&nbsp;</td><td>L'anticorpo IgG-biotina umana di capra reagisce specificamente con le IgG umane ma non con altre immunoglobuline.</td></tr><tr><td>Filtro per siringa da 0,2 mm</td><td>Thermo scientific</td><td>723-2520</td><td>Filtro al 5% BSA.</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A7284</td><td>Utilizzare il 5% di BSA per bloccare i vetrini.</td></tr><tr><td>Diluente anticorpale</td><td>Dako, UK</td><td>S3022</td><td>Per diluire il siero e l'anticorpo secondario.</td></tr><tr><td>Streptavidina Cy5</td><td>eBioscience</td><td>SA1011</td><td>Rilevamento della reazione immunitaria.</td></tr><tr><td>Tossine intere purificate di C. difficile A e B (toxinotipo 0, ceppo VPI 10463, ribotipo 087)</td><td>Toxins Group, Public Health England</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tossina B intera purificata (CCUG 20309 tossina B che esprime solo il ceppo)</td><td>Toxins Group, Public Health England</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Forma precursore del frammento B della tossina binaria, pCDTb</td><td>University of Bath&nbsp;</td><td>NA</td><td>Prodotto in E. Coli da un costrutto genico ricombinante completamente sintetico. Sequenza di aminoacidi basata sulla sequenza pubblicata dal ribotipo 027 (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)</td></tr><tr><td>Proteine dello strato superficiale native complete specifiche per il ribotipo (001, 002, 027) purificate</td> Dublin <td>City University&nbsp;</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Vigam (Preparazione IVIg 1)</td><td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Privigen (Preparazione IVIg 2)</td><td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Intratect (Preparazione IVIg 3)</td><td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

un'analisi di microarray della proteina per determinazione sierologica dell'infezione di clostridium difficile anticorpo seguenti risposte antigene-specifiche

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

Forniamo una panoramica dettagliata di un'analisi di microarray di romanzo della proteina ad alta produttività per la determinazione di anti -Clostridium difficile livelli di anticorpi nel siero umano e in preparazioni separate di policlonale dell'immunoglobulina endovenosa (IVIg). Il protocollo descrive i passaggi metodologici coinvolti nella preparazione del campione, stampa delle matrici, procedura di dosaggio e analisi dei dati. Inoltre, questo protocollo potrebbe essere ulteriormente sviluppato per incorporare diversi campioni clinici tra cui plasma e surnatanti di cella. Vi mostriamo come microarray della proteina può essere utilizzato per determinare una combinazione di isotipo (IgG, IgA, IgM), sottoclasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) e ceppo-specifici anticorpi altamente purificato tutta c. difficile tossine A e B (toxinotype 0, ceppo VPI 10463, ribotipo 087), la tossina B da un c. difficile tossina B-sola espressione ceppo (CCUG 20309), una forma di precursore di un frammento di B della tossina binaria, pCDTb, proteine di tutta la superficie strato ribotipo-specifico (SLPs; 001, 002, 027) e proteine (tetano di controllo tossoide tetanico e Candida albicans). Durante l'esperimento, microarrays sono sondati con i sieri da individui con l'infezione di c. difficile (CDI), gli individui con fibrosi cistica (CF) senza diarrea, controlli sani (HC) e da individui pre- e post-IVIg terapia per la trattamento di CDI, immunodeficienza combinata disordine e Poliradicolite demielinizzante infiammatoria cronica. Incontriamo differenze significative nei livelli di anticorpo specifico multi-isotipo di efficacies di neutralizzazione della tossina e tra gruppi di pazienti, preparazioni commerciali di IVIg e la sera prima e dopo somministrazione di IVIg. Inoltre, c'è una correlazione significativa tra microarray e analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) per i livelli di IgG antitossina in campioni di siero. Questi risultati indicano che microarray potrebbe diventare uno strumento promettente per profilatura risposte anticorpali agli antigeni di C.difficile in esseri umani infettati o vaccinati. Con ulteriore affinamento dei pannelli di antigene e una riduzione dei costi di produzione, possiamo anticipare che la tecnologia microarray può aiutare ottimizzare e selezionare i più clinicamente utile immunoterapie per infezione da c. difficile in modo specifico per ogni paziente.

La figura 1 illustra un diagramma di flusso che descrive i passaggi principali del protocollo descritto. La figura 2 Mostra il test di correlazione di Spearman dimostrando significativo accordo tra microarray ed ELISA per IgG e IgA anti-tossina A e B livelli in sieri paziente. La figura 3 Mostra differenziale IgG e IgA anticorpi-classe risposte anticorpali specifici per la tossina A, B, binario tossi...

Questo articolo viene descritto un metodo di microarray della proteina semplice per profilatura risposte immunitarie umorali a un panel 7-plex di altamente purificata antigeni di Clostridium difficile in sieri umani. Il protocollo può essere esteso per la determinazione della risposta di anticorpo specifico nelle preparazioni a base di immunoglobuline policlonali.

Un'analisi di Microarray della proteina per determinazione sierologica dell'infezione di Clostridium difficile anticorpo seguenti risposte antigene-specifiche

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Questo metodo può aiutare a ottimizzare e selezionare immunoterapie clinicamente utili per l'infezione da Clostridium difficile in modo specifico per il paziente e a chiarire le risposte immunitarie umane al Clostridium difficile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una quantificazione accurata e simultanea delle risposte anticorpali multi-isotipiche e specifiche del ceppo agli antigeni di C.difficile. In generale, le persone che sono nuove a questo metodo avranno difficoltà perché è richiesta esperienza nella creazione e nell'ottimizzazione di un pannello di antigeni altamente purificati e nella configurazione della piattaforma tecnologica.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i tipi di elenchi metodologici coinvolti nella preparazione della piastra a microonde, la stampa degli array, una procedura sicura e l'analisi dei dati richiedono attenzione ai dettagli. La dimostrazione di alcune delle procedure sarà affidata a Sam Greenwood, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, diluire gli antigeni del Clostridium difficile e il tampone di stampa alla concentrazione ottimale.Quindi, trasferire 10 microlitri di soluzione antigenica in una piastra da 384 pozzetti. Coprire la piastra con un sigillo per piastre e centrifugare a 300 volte la gravità per cinque minuti a temperatura ambiente. Per la stampa di microarray, utilizzare un bruciatore a gas portatile per riscaldare il PIN di silicio tre volte per due secondi ciascuna.Quindi, sciacquare il PIN in silicone in acqua pulita tre volte per tre secondi ciascuna. Posizionare la piastra del microarray nella cartuccia di caricamento di un arrayer. Espellere il vassoio, quindi posizionare i vetrini di amminosilano nel vassoio dei vetrini e premere il pulsante OK per accendere l'aspirapolvere.Assicurarsi che tutte le diapositive siano fissate, quindi fare clic su OK. Rimetti il vassoio all'origine e chiudi il coperchio. Successivamente, avvia il programma appropriato e vai su File, quindi su Parametri di microarraying, quindi su Apri. Selezionare il file Clostridium difficile per stampare tutti gli antigeni in quadruplice.In questa finestra, aprire la scheda Origine per indicare l'archiviazione del campione e la scheda Destinazione per inserire i dettagli del microarray. Quindi, apri la scheda Opzioni per selezionare lo strumento di lavaggio. Nella scheda Generale di Preferenze di esecuzione, sulla barra degli strumenti della suite di applicazioni TAS, selezionare Lava all'inizio dell'esecuzione e Lava alla fine dell'esecuzione.Apri la scheda Clima e imposta il livello di umidità tra il 55 e il 60%Ora avvia la corsa e controlla periodicamente l'array per assicurarne il corretto funzionamento. Dopo la stampa, posizionare con cura i vetrini stampati in un supporto per vetrini con 16 camere a più pozzetti. Quindi aggiungere 100 microlitri di BSAT al 5% a ciascun blocco.Coprire i vetrini e incubare per un'ora a temperatura ambiente agitando. Utilizzare 120 microlitri di PBST per lavare ogni blocco cinque volte per un minuto ciascuna con agitazione. Successivamente, scongelare i campioni di siero ottenuti da pazienti infetti da C difficile e controlli sani su ghiaccio per 20 minuti.Aggiungere il diluente anticorpale disponibile in commercio al blocco master, quindi aggiungere campioni al blocco master e mescolare. Scartare il tampone di lavaggio e aggiungere 100 microlitri di ciascun campione diluito ai blocchi sperimentali. Per il blocco di controllo negativo, aggiungere 100 microlitri di solo diluente anticorpale.Quindi, incubare i vetrini per un'ora a temperatura ambiente agitando delicatamente. Quindi, utilizzare 120 microlitri di PBST per lavare ogni blocco cinque volte per tre minuti ciascuna con agitazione. Quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo anti-umano di capra biotinilato diluito in diluente anticorpale a ciascun blocco.Coprire i vetrini e incubare per un'ora a temperatura ambiente agitando delicatamente. Utilizzare 120 microlitri di PBST per lavare ogni blocco cinque volte per tre minuti ciascuna con agitazione. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di streptavidina SY5 coniugato diluito al 5% di BSAT, in un rapporto da uno a duemila per ogni blocco.Coprire i vetrini con un foglio di alluminio e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente. Lavare prima i vetrini con 120 microlitri di PBST cinque volte per un minuto ciascuno, quindi lavarli altre due volte per un minuto ciascuno con PBS. Per asciugare i vetrini, farli girare per cinque minuti a 300 volte la gravità.Accendere lo scanner laser 30 minuti prima della scansione, per consentirne il riscaldamento. Quindi posizionare il vetrino nello scanner con la superficie stampata rivolta verso l'alto fino a quando la luce della lastra diventa verde fissa. Quindi, premi il pulsante Impostazioni.Nella prima scheda, assicurarsi che lo scorrimento automatico e il codice a barre siano deselezionati. Quindi, impostare la dimensione dei pixel su 10, la modalità di scansione su Media, l'acquisizione solo su 635, la modalità di acquisizione su Manuale, il guadagno su 20 e la potenza su bassa. Nella seconda scheda, assicurarsi che il tipo di diapositiva non sia etichettato.Nella terza scheda, impostare la messa a fuoco su Messa a fuoco automatica. Premere il pulsante di importazione della griglia per selezionare l'elenco di array appropriato associato all'immagine acquisita. Quindi, premere il pulsante di ricerca automatica per allineare la griglia ai punti sulla diapositiva.Infine, premere il pulsante Processo di quantificazione per misurare l'intensità della fluorescenza di ogni punto. Quindi, salva i risultati in un formato appropriato per ulteriori analisi. In questo protocollo, un microarray di proteine viene confrontato con ELISA per valutare la riproducibilità tra queste due tecniche.L'analisi del coefficiente di correlazione di Spearman mostra un accordo significativo tra il microarray e l'ELISA per rilevare i livelli di IgG, anti-tossina A e anti-tossina B nei campioni di siero. La riproducibilità del saggio introduttivo e interdosario del micro array proteico viene calcolata utilizzando i campioni di siero di sette pazienti. I campioni analizzati su due diversi vetrini di array contro la tossina A, la tossina B, SLP001, SLP002, SLP027, la tossina B della tossina B che produce solo il ceppo CCUG e gli antigeni pCDTb rivelano una buona riproducibilità.Viene eseguito un microarray proteico per rilevare una risposta anticorpale isotipo-specifica contro le tossine del Clostridium difficile. I campioni di siero di pazienti e individui sani vengono utilizzati per rilevare i livelli di IgG e IgA contro la tossina A, la tossina B, la tossina B da un ceppo che esprime solo la tossina B di Clostridium difficile e la forma precursore di un frammento B della tossina binaria. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette ore.Prima di eseguire i campioni, è necessario valutare l'esperimento di controllo della qualità, diversi parametri come la selezione di una chimica di superficie appropriata, i tamponi di stampa, i tamponi di blocco e le diluizioni dei campioni di siero e degli anticorpi secondari. La stampa di un array di alta qualità richiede una buona conoscenza dell'array o del software per regolare la stampa dei parametri in base al protocollo sperimentale. È fondamentale mantenere le prestazioni ottimali dell'arrayer e un ambiente privo di polvere durante l'esperimento.Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia e della biologia molecolare, in termini di caratterizzazione delle risposte immunitarie umorali all'infezione e di scoperta di antigeni sierodiagnostici. Non dimenticare che lavorare con campioni di sangue infetti e tossine batteriche può essere pericoloso. In generale, in laboratorio, durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese in considerazione le precauzioni standard e di sicurezza.

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La presenza di tossine cianobatteriche nei serbatoi di acqua dolce per il consumo umano è una delle principali preoccupazioni per le autorità di gestione delle acque. Per valutare il rischio di contaminazione dell'acqua, questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione sul campo di ceppi cianobatterici in campioni liquidi e solidi utilizzando un chip di microarray di anticorpi.

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Dimostriamo una tecnologia di chip di snap per l'esecuzione di test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex panino semplicemente schioccando due diapositive. Un'apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento in modo affidabile i reagenti da microarray a DNA-microarray. Il chip di snap può essere utilizzato per eventuali reazioni biochimiche che richiedono colocalizzazione di reagenti diversi senza la contaminazione incrociata.

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Qui presentiamo un protocollo per descrivere lo sviluppo e la convalida di una singola molecola matrice digitale analisi di ELISA, che consente la rilevazione ultra-sensibile di tutti i sottotipi di IFN-α in campioni umani.

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Qui, presentiamo un protocollo di microarrays della proteina extracellulare dello schermo per l'identificazione delle interazioni recettore-ligando romanzo in elevato throughput. Inoltre descriviamo un metodo per migliorare la rilevazione delle interazioni proteina-proteina transitoria utilizzando complessi proteina-Microperlina.

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un microarray proteico costruito stampando antigeni influenzali su vetrini rivestiti di nitrocellulosa per sondare simultaneamente il siero per più isotipi anticorpi contro oltre 250 antigeni provenienti da diversi ceppi di virus, quindi consentendo la misurazione dell'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus.

Uso di un microarray antigeno influenzale per misurare l'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus

In linea con l'urgente necessità di screening per il diabete di tipo 1, la celiachia e la malattia da coronavirus 2019, abbiamo sviluppato un test di elettrochemiluminescenza 6-Plex ad alta produttività per rilevare simultaneamente tutti e quattro gli autoanticorpi delle isole, gli autoanticorpi della transglutaminasi tissutale e gli anticorpi contro il dominio di legame del recettore della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2.

Uno screening multiplexed ad alto rendimento per diabete di tipo 1, celiachia e COVID-19

Scopri il metodo di microarray proteico per profilare le risposte anticorpali umorali contro gli antigeni di Clostridium difficile nei sieri umani. Questa tecnica consente la quantificazione accurata di anticorpi multi-isotipo e ceppo-specifici.

Unanalisi di Microarray della proteina per determinazione sierologica dellinfezione di Clostridium difficile anticorpo seguenti risposte antigene-specifiche (Video) | JoVE Journal

Un'analisi di Microarray della proteina per determinazione sierologica dell'infezione di Clostridium difficile anticorpo seguenti risposte antigene-specifiche

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