Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di ottenere un'immunocolorazione affidabile pre-inclusione di tessuto cerebrale non primato per la microscopia elettronica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuroanatomia, come l'incidenza sinaptica di una data innervazione in una precisa struttura cerebrale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo facile ed economico per marcare innervazioni specifiche adatte alla microscopia elettronica.

Iniziare trasferendo sezioni spesse 50 micron di cervello di primati non umani fissati con acroleina contenenti la regione di interesse in una piastra a 12 pozzetti contenente PBS. Lavare le sezioni flottanti tre volte in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi incubare le sezioni in una soluzione di boroidruro di sodio appena preparata per 30 minuti a temperatura ambiente. Oscilla dolcemente senza copertura.

Trascorsi i 30 minuti, aspirare il boroidruro di sodio e aggiungere PBS a ciascun pozzetto. Posizionare la piastra su un bilanciere e agitare energicamente per 10 minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte o fino a quando non rimane più gas di reazione.

Bloccare le sezioni incubando in una soluzione di siero normale al 2% e gelatina di pesce fredda allo 0,5% diluita in PBS per un'ora a temperatura ambiente con un leggero dondolo. Una volta trascorso il tempo di incubazione, incubare le sezioni in soluzione di anticorpi primari con un leggero dondolo per una notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, dopo aver lavato le sezioni come prima, incubare le sezioni in soluzione di anticorpi secondari per un'ora e mezza a temperatura ambiente con un leggero oscillamento.

Dopo aver lavato le sezioni come prima, incubare in soluzione avidina-biotina-perossidasi o ABC per un'ora con dondolo. Successivamente, preparare una soluzione fresca di 0,05%3,3'Diaminobenzidina con perossido di idrogeno allo 0,005% diluito in TBS. Dopo il lavaggio, incubare le sezioni nella soluzione DAB per tre-sette minuti con un leggero dondolio.

Una volta che il precipitato marrone si è sviluppato nel colore desiderato, interrompere la reazione lavando rapidamente due volte in TBS freddo, quindi attraverso una serie di lavaggi TBS e PB temporizzati. Trasferire la piastra contenente le sezioni macchiate DAB nella cappa di ventilazione. Trasferire le sezioni in una piastra a sei pozzetti riempita con PB e appiattire completamente le sezioni pipettando accuratamente il PB dalla piastra, quindi aggiungere la soluzione di tetrossido di osmio goccia a goccia per evitare di disturbare le sezioni appiattite.

Coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggere le sezioni dalla luce e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente senza agitare. Durante l'ossificazione, preparare la resina epossidica idrorepellente aggiungendo quantità adeguate di ciascun componente della miscela di resina epossidica in un grande bicchiere di plastica. Mescolare con un bastoncino di legno o una pipetta di plastica fino ad ottenere un colore marrone omogeneo, quindi trasferire quantità uguali di resina in coppette di alluminio di dimensioni adeguate al numero di sezioni da lavorare e lasciarla riposare.

Trascorso il periodo di ossificazione, lavare le sezioni tre volte in PB per 10 minuti con oscillazione a bassa velocità. Dopo il lavaggio, disidratare le sezioni della serie successiva di etanolo graduato per due minuti ciascuna. Successivamente, trasferire le sezioni in fiale di vetro riempite con ossido di propilene e incubare in ossido di propilene tre volte per due minuti ciascuna per completare il processo di disidratazione.

Trasferite quindi le sezioni con cura, una ad una, nelle coppette di alluminio, evitando il più possibile il contatto con l'aria. Flat ancorare le sezioni in resina epossidica idrorepellente precedentemente miscelata e incubarle per una notte sotto la cappa di sfiato a temperatura ambiente. Il giorno successivo, rivestire i vetrini di vetro e i vetrini di plastica con olio minerale, quindi ammorbidire la resina incubando le coppette di alluminio a 60 gradi Celsius per 12-15 minuti al massimo.

Appiattire con cura le sezioni sul lato unto del vetrino. Posizionare il vetrino coprioggetti ingrassato ed espellere con cautela l'aria residua. Incubare i vetrini a 60 gradi Celsius per 48 ore.

Dopo 48 ore, rimuovere il vetrino coprioggetto in plastica, lasciando la sezione avvolta nella resina. Inizia usando il binocolo per localizzare la regione di interesse e poi usa un bisturi per tagliare un piccolo pezzo di tessuto quadrangolare di circa un millilitro quadrato. Quindi, lima la punta di un blocco di resina e poi incolla il pezzo di tessuto quadrangolare su di esso.

Dopo l'asciugatura, posizionare il blocco di resina nel piatto dell'ultramicrotomo in posizione verticale e utilizzare una lama di rasoio affilata per tagliare gradualmente ogni lato del blocco di resina per formare un trapezio con i lati lisci. Quindi, metti il ponte in posizione orizzontale e ruota il blocco fino a quando il lato più lungo del trapezio è rivolto verso il basso. Posiziona uno strumento per rifilare il diamante o un coltello da vetro in uno spazio dedicato.

Imposta l'ultramicrotomo per tagliare sezioni da 300 micron a un millimetro al secondo. Regolare il coltello in modo che sia parallelo verticalmente al pezzo quadrangolare e in modo che mostri un angolo orizzontale molto piccolo di circa un grado e tagliare la superficie del pezzo quadrangolare fino a quando il tessuto inizia a comparire. Ora, passa a un coltello diamantato a 45 gradi dotato di una barca riempita con acqua distillata per tagliare sezioni spesse 80 micron.

Leviga le sezioni passandoci sopra con un pezzo di carta assorbente con punta in xilene senza toccare la superficie dell'acqua, e raccogli le sezioni seriali su griglie di rame nude da 150 maglie. Posizionare le griglie in una scatola di immagazzinaggio a griglia, quindi preparare una soluzione uno a uno di soluzione madre di citrato di piombo e acqua distillata e filtrare attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron. Coprire la fiala con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce.

Posizionare ogni griglia su una goccia della soluzione di citrato di piombo diluito, con la sezione a contatto con la soluzione, quindi utilizzare piccole pinzette per tenere la griglia e sciacquarla accuratamente in due bicchieri contenenti acqua distillata. Rimuovere delicatamente l'acqua in eccesso con carta assorbente e posizionare le griglie in una scatola a griglia. Dopo 30 minuti, le sezioni possono essere esaminate mediante microscopia elettronica a trasmissione.

Questa micrografia elettronica del globus pallidus interno della scimmia scoiattolo mostra materiale ben conservato dopo perfusione transcardiaca acroleina-PFA nella tecnica dell'immunoperossidasi diaminobenzidina. Come si vede lì, la procedura consente di vedere la guaina mielinica di un grande assone, indicata dalla punta della freccia. Questa micrografia elettronica del globo pallido esterno mostra i profili dendritici, indicati con la lettera d, i piccoli assoni non mielinizzati, indicati con a, e le varicosità assoniche, marcate av, possono essere facilmente identificate.

Le frecce mostrano un esempio di varicosità assonale che stabilisce un contatto sinaptico simmetrico con il profilo dendritico. Gli elementi immunomarcati possono essere facilmente identificati dal loro citoplasma o assoplasma riempito con precipitato DAB denso di elettroni. Qui, un dendrite immunocolorato per la colina acetiltransferasi nel GPi riceve un contatto sinaptico da una varicosità assonale non marcata.

Questa micrografia elettronica mostra un assone mielinizzato nel GPe con una guaina mielinica relativamente intatta il cui assoplasma è immunomarcato per la tirosina idrossilasi. Questo esempio mostra una varicosità assonale nel GPi immunomarcato per il trasportatore della serotonina che stabilisce un contatto sinaptico simmetrico con un dendrite. In questo esempio, il precipitato DAB riveste la membrana plasmatica e la superficie esterna degli organelli.

La varicosità assonale mostrata qui è stata osservata nel GPe e immunomarcata per la tirosina idrossilasi. Questo rappresenta un esempio di precipitato di DAB che riempie interamente l'assoplasma, con vescicole sinaptiche visibili ma più difficili da delineare. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la doppia immunoistochimica pre-incorporata, per rispondere a ulteriori domande come la colocalizzazione di proteine o recettori a livello sinaptico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare l'immunoistochimica pre-inclusione del tessuto cerebrale non primatico, procedere all'inclusione in resina epossidica e tagliare la regione di interesse in sezioni spesse 80 micrometri adatte alla microscopia elettronica.