Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

L'obiettivo generale di questo esperimento è ottenere una immunomarcatura affidabile su tessuto cerebrale non primate, da eseguire prima dell'inclusione, per microscopia elettronica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroanatomia, come l'incidenza sinaptica di una determinata innervazione all'interno di una precisa struttura cerebrale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di un metodo semplice ed economico per etichettare innervazioni specifiche, adatto alla microscopia elettronica.

Iniziare trasferendo sezioni di 50 micron di spessore di cervello di primate non umano fissato con acroleina, contenenti la regione di interesse, in una piastra da 12 pozzetti contenente PBS. Lavare le sezioni libere in sospensione tre volte in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi incubare le sezioni in una soluzione di boroidrato di sodio appena preparata per 30 minuti a temperatura ambiente. Agitare delicatamente senza coperchio.

Trascorsi i 30 minuti, aspirare il boroidruro di sodio e aggiungere PBS in ogni pozzetto. Posizionare la piastra su un agitatore e agitare vigorosamente per 10 minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte o fino a quando non rimane alcun gas della reazione.

Bloccare le sezioni incubandole in una soluzione contenente siero normale al 2% e gelatina di pesce fredda allo 0,5% diluita in PBS per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata. Trascorso il tempo di incubazione, incubare le sezioni nella soluzione di anticorpo primario con agitazione delicata per tutta la notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, dopo aver lavato le sezioni come in precedenza, incubare le sezioni nella soluzione di anticorpo secondario per un'ora e mezza a temperatura ambiente con agitazione delicata.

Dopo aver lavato le sezioni come in precedenza, incubare nella soluzione di avidina-biotina-perossidasi o ABC per un'ora con agitazione. Successivamente, preparare una soluzione fresca di 3,3'-diaminobenzidina 0,05% con perossido di idrogeno 0,005% diluita in TBS. Dopo il lavaggio, incubare le sezioni nella soluzione di DAB per tre-sette minuti con agitazione delicata.

Una volta che il precipitato marrone ha raggiunto il colore desiderato, arrestare la reazione lavando rapidamente due volte in TBS freddo, seguito da una serie di lavaggi con TBS e PB di durata controllata. Trasferire la piastra contenente le sezioni colorate con DAB nell'appaio di ventilazione. Trasferire le sezioni in una piastra a sei pozzetti riempita con PB e appiattirle completamente rimuovendo con attenzione il PB dalla piastra mediante pipetta, quindi aggiungere la soluzione di tetrossido di osmio goccia a goccia per evitare di disturbare le sezioni appiattite.

Coprire la piastra con della carta d'alluminio per proteggere le sezioni dalla luce e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Durante l'osmificazione, preparare una resina epossidica idrorepellente aggiungendo quantità appropriate di ciascun componente della miscela di resina epossidica a un bicchiere di plastica grande. Mescolare con un bastoncino di legno o una pipetta di plastica fino a ottenere un colore marrone omogeneo, quindi trasferire quantità uguali di resina in bicchierini di alluminio di dimensioni appropriate al numero di sezioni da processare e lasciare riposare.

Trascorso il periodo di osmificazione, lavare i campioni tre volte in tampone fosfato per 10 minuti con movimento oscillatorio a bassa velocità. Dopo il lavaggio, disidratare i campioni nella seguente serie di etanolo a concentrazione crescente per due minuti ciascuno. Successivamente, trasferire i campioni in vial di vetro riempiti con ossido di propilene e incubare nell'ossido di propilene tre volte per due minuti ciascuna per completare il processo di disidratazione.

Quindi trasferire con attenzione i sezioni, una alla volta, nelle coppette di alluminio, evitando il contatto con l'aria il più possibile. Inserire le sezioni in resina epossidica idrorepellente precedentemente miscelata e incubarle tutta la notte sotto cappa a temperatura ambiente. Il giorno successivo, ricoprire i vetrini e i coverslip di plastica con olio minerale, quindi ammorbidire la resina incubando le coppette di alluminio a 60 gradi Celsius per 12-15 minuti al massimo.

Appiattire con attenzione le sezioni sul lato unto del vetrino. Posizionare il coprioggetto unto e rimuovere con cura tutta l'aria residua. Incubare i vetrini a 60 gradi Celsius per 48 ore.

Dopo 48 ore, rimuovere il coprislittino di plastica, lasciando la sezione incapsulata nella resina. Iniziare utilizzando un binocolo per individuare la regione di interesse e quindi usare un bisturi per tagliare un piccolo pezzo di tessuto quadrangolare di circa un millilitro quadrato. Successivamente, limare la punta di un blocco di resina e incollare su di essa il frammento di tessuto quadrangolare.

Dopo l'essiccazione, posizionare il blocco di resina sul piatto del microtomo ultramicrotomo in posizione verticale e utilizzare una lama affilata per tagliare gradualmente ciascun lato del blocco di resina, formando un trapezio con lati lisci. Successivamente, posizionare il piatto in posizione orizzontale e ruotare il blocco finché il lato più lungo del trapezio non sia rivolto verso il basso. Posizionare uno strumento di taglio al diamante o un coltello di vetro nello spazio dedicato.

Impostare l'ultramicrotomo per tagliare sezioni di 300 micron a una velocità di un millimetro al secondo. Regolare il coltello in modo che sia verticalmente parallelo al pezzo quadrangolare e presenti un angolo orizzontale molto piccolo, di circa un grado, quindi rifinire la superficie del pezzo quadrangolare finché non inizia a comparire il tessuto. A questo punto, passare a un coltello diamantato ultra da 45 gradi dotato di una barchetta riempita con acqua distillata per tagliare sezioni spesse 80 micron.

Lisciare le sezioni passando su di esse un pezzo di carta assorbente imbevuta di xilene senza toccare la superficie dell'acqua, e raccogliere sezioni seriali su griglie di rame nude da 150 mesh. Posizionare le griglie in una scatola porta-griglie, quindi preparare una soluzione al rapporto uno a uno tra la soluzione madre di citrato di piombo e acqua distillata, filtrando attraverso un filtro per siringa da 0,2 micron. Coprire il flacone con carta d'alluminio per proteggerlo dalla luce.

Posizionare ciascuna griglia su una goccia della soluzione diluita di citrato di piombo, con la sezione a contatto con la soluzione. Quindi utilizzare pinzette piccole per tenere la griglia e risciacquarla accuratamente in due becher contenenti acqua distillata. Rimuovere delicatamente l'acqua in eccesso con carta assorbente e posizionare le griglie in un contenitore per griglie. Dopo 30 minuti, le sezioni possono essere esaminate mediante microscopia elettronica a trasmissione.

Questo micrografico elettronico del globus pallidus interno della scimmia scoiattolo mostra materiale ben conservato dopo la perfusione transcardiaca con acroleina-PFA nella tecnica immunoperoxidasi con diaminobenzidina. Come si può osservare, la procedura permette di visualizzare la guaina mielinica di un grosso assone, indicata dalla freccia. Questo micrografico elettronico del globus pallidus esterno dimostra che i profili dendritici, indicati dalla lettera d, i piccoli assoni non mielinizzati, indicati con a, e le varicosità assonali, etichettate av, possono essere facilmente identificati.

Le frecce mostrano un esempio di una varicosità assonica che stabilisce un contatto sinaptico simmetrico con il profilo dendritico. Gli elementi immunomarcanti possono essere facilmente identificati grazie al citoplasma o all'assoplasma riempiti di precipitato di DAB denso all'elettrone. In questo caso, un dendrite immunomarcato per la colina acetiltransferasi nel GPi riceve un contatto sinaptico da una varicosità assonica non marcata.

Questo micrografico elettronico mostra un assone mielinizzato nel GPe con una guaina mielinica relativamente integra il cui assonoplasma è immunomarcato per la tirosina idrossilasi. Questo esempio mostra una varicosità assonica nel GPi immunomarcata per il trasportatore della serotonina che stabilisce un contatto sinaptico simmetrico con una dendrite. In questo caso, il precipitato di DAB delinea la membrana plasmatica e la superficie esterna degli organelli.

La varicosità assonica mostrata qui è stata osservata nel GPe ed immunomarcata per la tirosina idrossilasi. Questo rappresenta un esempio di precipitato di DAB che riempie completamente l'assoplasma, con vescicole sinaptiche visibili ma più difficili da delineare. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'immunocitochimica doppia con marcatura pre-inclusione, per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sulla codistribuzione di proteine o recettori a livello sinaptico.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare l'immunohistochimica con inclusione preliminare di tessuto cerebrale non primate, procedere all'inclusione in resina epossidica e ultrasezionare la regione di interesse in sezioni spesse 80 micrometri, adatte alla microscopia elettronica.