Evaporazione di riduzione Cultura Condizione Aumenta la riproducibilità dei multicellulare Spheroid Formazione in micropiastre

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di migliorare la scalabilità e la riproducibilità della formazione uniforme di sferoidi utilizzando una tecnica di sovrapposizione liquida in piastre a 384 pozzetti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che riduce l'eccessiva reoperazione del mezzo da più piastre, migliorando così la riproducibilità della formazione di sferoidi. Abbiamo sviluppato e convalidato il metodo di coltura di sferoidi 3D per test di screening degli artropodi nel nostro laboratorio e il nostro studio è stato quello di valutare quale sia l'effetto bordo nelle piastre delle colture multicellulari.

Oggi mostrerò la procedura insieme a Sona, un poster del laboratorio. Inizia questa procedura pesando il punto zero sette cinque grammi di agarosio a basso punto di fusione e aggiungilo a 100 millilitri di terreno 5a di McCoy con o senza rosso fenolo e senza siero. Scaldare la soluzione in un forno a microonde e farla roteare ogni uno o due minuti per sciogliere completamente l'agarosio.

Quindi sterilizzare in autoclave la soluzione per sterilizzarla. Dopo aver lasciato raffreddare l'agarosio autoclavato a circa 70 gradi Celsius, filtrarlo attraverso un filtro da 500 millilitri di punto zero e due micrometri in una scatola a flusso laminare. Quindi, se l'intera soluzione non verrà utilizzata in una sola volta, aliquotarla.

Conservare questa soluzione di agarosio pronta all'uso in modo asettico in una cella frigorifera o in un frigorifero a quattro gradi Celsius per un massimo di quattro settimane. Lavorando in una flow box, installare una cassetta di erogazione con punta in plastica o metallo in un dosatore di reagenti combinato. Posizionare il peso del tubo in un recipiente di etanolo al 70% e quindi adescare la cassetta.

Quindi, spostare il peso del tubo in un recipiente di PBS e adescarlo di nuovo. Quindi, scaldare un'aliquota conservata di soluzione di agarosio filtrata nel microonde per scioglierla. Adescare la cassetta di dispensazione con la soluzione di agarosio e quindi avviare il protocollo per rivestire 384 micropiastre trattate con coltura tissutale con 15 microlitri di soluzione di agarosio filtrata.

Lasciare raffreddare l'agarosio nella piastra per 15-20 minuti prima di seminare le cellule come descritto nella sezione successiva del video o di conservarle a quattro gradi Celsius e lontano dalla luce diretta. Infine, per pulire la cassetta di erogazione, posizionare il peso del tubo in acqua sterile a 70-80 gradi Celsius e premere il pulsante di adescamento sull'erogatore. Questo rimuoverà l'agarosio residuo nelle punte delle cassette e nei tubi.

Il seguente processo di semina cellulare deve essere eseguito in condizioni sterili e in una scatola a flusso laminare. Iniziare rimuovendo il numero richiesto di micropiastre trattate con colture tissutali da 384 pozzetti rivestite di agarosio dalla cella frigorifera e lasciandole equilibrare a temperatura ambiente per 15 minuti. Nel frattempo, preparare il dispenser di reagenti combinato per il controllo cellulare adescando una cassetta di erogazione per provette standard con etanolo al 70% e PBS sterile.

Quindi, utilizzando i pulsanti di impostazione manuale sull'erogatore, regolare il volume di visualizzazione al microlitro richiesto e la velocità di erogazione a media. Utilizzare l'enzima di dissociazione cellulare ricombinante per rimuovere le cellule HCT116 aderenti del carcinoma colorettale umano da un pallone di coltura tissutale. In un becher sterile, creare una sospensione cellulare con cellule a una densità di 2,5 volte 10 per le quarte cellule per millilitro per pozzetto in 50 microlitri di terreno di crescita completo.

Se verrà seminata più di una piastra da 384 pozzetti, utilizzare un agitatore magnetico per evitare che si depositino sul fondo del becher. Utilizzando un dosatore, aggiungere le 25 celle a ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti. Lasciare riposare i piatti per 30 minuti a temperatura ambiente.

Nel frattempo, prendere un coperchio per micropiastra ambientale che riduce l'evaporazione e utilizzare una pipetta da cinque millilitri, erogare quattro millilitri di dimetilsolfossido al cinque percento nella vasca sul lato sinistro, spazzando lentamente su e giù. Ripeti questo processo con il trogolo sul lato destro. Assicurarsi che il liquido aggiunto alle vasche laterali non si unisca al centro del coperchio e lasci uno spazio per lo scambio di gas.

Se viene aggiunto troppo liquido, penetrerà all'esterno del coperchio e successivamente entrerà nel pozzetto esterno della piastra di coltura tissutale 384. Trascorsi 30 minuti, esaminare le cellule al microscopio. Il riposo delle piastre per 30 minuti consente alle cellule di depositarsi completamente sul fondo del pozzetto e vicine l'una all'altra, il che è importante per la formazione di singoli sferoidi per pozzetto.

Centrifugare le piastre seminate per 15 minuti a quattro volte G.Dopo la centrifuga, riempire il serbatoio del liquido della piastra di coltura tissutale 384 con acqua sterile e sostituire i normali coperchi delle piastre con i coperchi ambientali riempiti di liquido. Posizionare le piastre in un incubatore rotante a 37 gradi Celsius con il 95% di umidità, il cinque percento di CO2 e il 20% di ossigeno e lasciare che le cellule si aggreghino in sferoidi tumorali multicellulari o MCTS per quattro giorni. Evitare di aprire la porta dell'incubatrice troppo a lungo nei giorni successivi, in modo che l'umidità dell'aria non diminuisca bruscamente.

Il quarto giorno successivo alla formazione dell'NCTS, utilizzare un dispenser automatico di lavatrice per micropiastre per aggiungere 30 microlitri di terreno preriscaldato a ciascun pozzetto. Rimetti gli MCTS nell'incubatore e lascia che gli MCTS crescano fino a raggiungere le dimensioni desiderate per la sperimentazione. Ogni tre giorni, per sostituire il fluido, regolare empiricamente l'altezza Z del collettore di lavaggio e impostare la velocità di erogazione e la velocità con cui il collettore di lavaggio scende nei pozzetti alla velocità più bassa per ridurre al minimo la turbolenza nei pozzetti.

Aspirare 30 microlitri di terreno per pozzetto e sostituirlo con 30 microlitri di terreno fresco e preriscaldato. Quindi rimettere le cellule nell'incubatore. Immagine degli MCTS in un sistema di imaging automatizzato ad alto contenuto utilizzando un oggetto ad aria quattro X con un'apertura numerica di 16.

Utilizzando il software di imaging, impostare il tempo di esposizione su 11 millisecondi e il binning su quattro per quattro. Regola il numero e la spaziatura degli z-stack e del pixel binning come desiderato per l'esperimento per acquisire un intero MCTS in ogni pozzetto. Elabora le immagini 2D in modo graduale per misurare l'area MCTS, l'asse maggiore e minore, il perimetro e la solidità.

Si prega di consultare il codice m allegato e i file readme text per istruzioni specifiche. Per determinare la potenziale applicabilità della routine, gli MCTS di sette giorni sono stati trattati con diverse concentrazioni di farmaci antitumorali, paclitaxel, PTX, vincristina, VCR, oxalyplatino, OXA, doxirubicina, DOX e cinque flurouracil, 5-FU, a tre diverse concentrazioni per quattro giorni. Le immagini degli MCTS sono mostrate qui.

Queste immagini sono state analizzate per determinare l'area, gli assi maggiore e minore, il perimetro e la solidità degli MCTS trattati con farmaci rispetto ai controlli, CTL. Gli assi maggiore e minore sono stati utilizzati per calcolare il volume geometrico. C'è stata una diminuzione dipendente dalla concentrazione dell'area e del volume di MCTS dopo il trattamento farmacologico.

Sebbene il punto zero di un microgrammi per millilitro di Vincrystina e zero virgola quattro microgrammi per millilitro di doxirubicina e cinque fluorouracile abbiano comportato un aumento dell'area MCTS, il volume è stato significativamente aumentato solo dopo il punto zero zero di un microgrammo per millilitro di Vincrystine. Il perimetro dell'MCTS era significativamente diverso solo alle concentrazioni più elevate di packlitaxel, doxirubicina e cinque fleurouracile che influenzavano completamente le dimensioni dell'MCTS. Il trattamento con packlitaxel e vincristina al punto zero due cinque microgrammi per millilitro e zero zero sei microgrammi per millilitro e doxirubicina e cinque fleurouracile a 100 microgrammi per millilitro, ha provocato una significativa diminuzione della solidità, indicando una disintegrazione completa o parziale degli MCTS.

Nel loro insieme, questi dati dimostrano l'utilità di questo metodo nello studio di potenziali farmaci antitumorali. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente. Quando si tenta questa procedura, è importante notare che non tutte le linee cellulari sono adatte a un particolare metodo di coltura 3D e diverse linee cellulari formano sferoidi che mostrano differenze nelle forme degli sferoidi, nelle dimensioni, nell'istologia e nella cinetica di crescita.

La routine stimolatoria che abbiamo sviluppato consente una valutazione efficace delle dimensioni degli sferoidi, in particolare negli sferoidi parzialmente disintegrati trattati con farmaci che non hanno un confine chiaramente definito per la misurazione dell'area della sezione trasversale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione del fatto che la modifica qui presente non richiede alcuna attrezzatura o materiale di consumo aggiuntivo e può essere implementata di routine nel tuo laboratorio di screening degli artropodi.