Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre modelli molecolari ad alta precisione di virus o complessi macromolecolari applicando l'analisi di singole particelle a immagini a super-risoluzione di strutture con componenti marcati in fluorescenza. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della virologia, tra cui l'architettura proteica di virus complessi e il modo in cui questa cambia durante il corso dell'infezione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che raccogliendo più immagini della stessa struttura diventa possibile generare una mappa ad alta precisione dei suoi componenti.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla struttura dei virus, può essere applicato anche ad altri sistemi come altri agenti patogeni e complessi macromolecolari all'interno delle cellule dei mammiferi. Innanzitutto, visualizza il campione con la microscopia a fluorescenza a super risoluzione. Acquisisci immagini di diversi campi visivi contenenti centinaia o migliaia di particelle ben separate senza strutture fluorescenti indesiderate.

Una volta ottenute ed elaborate le immagini, importatele e concatenatele in una pila con canali intercalati. Se necessario, convertire l'immagine concatenata da un hyper-stack a uno stack. Successivamente, seleziona Estrai strutture virali"nel sottomenu VirusMapper e imposta il percorso del file per le particelle estratte.

Inserisci il numero di canali di fluorescenza visualizzati. Impostare il canale di riferimento sul canale di fluorescenza in cui le particelle hanno l'aspetto più coerente. Se queste particelle mancano di un massimo centrale, applicare la sfocatura gaussiana pre-rilevamento per indurre la comparsa di uno.

Quindi, stima il diametro in pixel delle particelle più grandi. Imposta il raggio del ROI su poco più della metà di quel valore. Stima il numero di ROI necessari per fotogramma.

Inizialmente non utilizzare più di cento ROI. Imposta la sovrapposizione ROI massima in base alla separazione delle particelle. Visualizza in anteprima il ROI per quel fotogramma.

Regola il raggio, il numero di ROI e la sovrapposizione massima in modo che ogni particella nel fotogramma sia racchiusa in una singola ROI. Assicurati che le ROI siano almeno di qualche pixel più larghe delle particelle più grandi. Quindi, fare clic su OK" per eseguire la segmentazione.

Chiudi l'immagine di esempio in ROI manager dopo l'estrazione. Non rinominare i set di particelle estratti. Seleziona Genera semi"e apri la cartella contenente i dati delle particelle estratte.

Impostare il canale di riferimento e selezionare tutti i canali per i quali deve essere generato un seme. Se necessario per abbinare i modelli precedenti, ruotare i semi di novanta gradi. Per i canali in cui le particelle mancano di un massimo centrale, aumentare il valore di sfocatura gaussiana di pre-allineamento come prima.

Se i canali non sono strettamente allineati, abilitare la correzione dello spostamento per i canali non di riferimento. Cerca nella sequenza di particelle una struttura che appaia in modo coerente. Identificare una particella rappresentativa e inserire il numero di fotogramma corrispondente nel campo Fotogrammi da utilizzare".

Esamina i semi risultanti. La selezione dei semi è una fase critica di questa procedura. Visualizzare attentamente i dati non elaborati per identificare una o più strutture da modellare.

La qualità del modello dipende fortemente dalla scelta di semi che riflettano accuratamente queste strutture. Regolate il canale di riferimento, il raggio di sfocatura gaussiana e la correzione dello spostamento in base alle esigenze per ottimizzare l'identificazione di fotogrammi aggiuntivi con semi simili. Continuate ad aggiungere frame e a regolare i parametri di generazione fino a quando la struttura media non rappresenta al meglio una struttura osservata nei dati.

Immettere il nome della cartella e il prefisso del file per i seed. Fare clic su OK" per salvare le immagini del seme per una modellazione successiva. Seleziona Genera modelli basati su semi"e apri la cartella delle particelle estratte.

Caricare le medie di inizializzazione per ogni canale. Se si esegue l'individuazione della struttura basata su riferimenti, selezionare un canale di riferimento per l'allineamento. La struttura delle particelle nota in un canale può essere utilizzata come riferimento per allineare un secondo canale sconosciuto.

Ciò consente una mappatura imparziale della struttura sconosciuta. Tenete presente che lo spostamento cromatico tra i canali deve essere corretto in anticipo. Se l'analisi è alla ricerca di piccole differenze o caratteristiche sottili nel modello, selezionare Intensità immagine quadrata durante la corrispondenza del modello.

Impostare la somiglianza minima tra il sessanta e l'ottanta percento e il numero di iterazioni su uno. Seleziona i modelli e le particelle da visualizzare durante il calcolo e genera i modelli di anteprima. Ispeziona i modelli di anteprima.

Aumentare la somiglianza minima per includere solo le particelle con la morfologia desiderata. Ottimizza gli altri parametri di calcolo del modello secondo necessità e seleziona elementi aggiuntivi durante il processo di generazione del modello da mostrare, se lo desideri. Una volta che i modelli di anteprima sono soddisfacenti, aumentare il numero di iterazioni a dieci.

Impostare il nome della cartella e il prefisso del file. Fare clic su OK" per salvare le pile di evoluzione del modello contenenti tutte le iterazioni del modello finale. Un virus Vaccinia ricombinante con due proteine marcate con proteine fluorescenti verdi e rosse è stato analizzato mediante microscopia a illuminazione strutturata e modellato con il plug-in VirusMapper.

I semi sono stati generati separatamente per l'orientamento frontale e sagittale, ciascuno con la media di cinque particelle rappresentative. A seconda dell'orientamento del virus, si possono distinguere uno o due corpi laterali. Pertanto, è possibile generare modelli separati per i due orientamenti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la qualità dei modelli dipende in gran parte dalla qualità dei dati grezzi acquisiti. Sebbene l'analisi di singole particelle possa aumentare la precisione, non può compensare le immagini di bassa qualità. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire un'ulteriore quantificazione o adattamento del modello su questi modelli.

Questo può aiutare a rispondere a ulteriori domande, in particolare riguardanti, ad esempio, i cambiamenti su scala nanometrica sull'architettura virale durante l'infezione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il software di analisi di singole particelle VirusMapper per generare modelli di architettura molecolare da immagini a super risoluzione.