Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre modelli molecolari ad alta precisione di virus o complessi macro-molecolari applicando l'analisi di singole particelle a immagini a super-risoluzione di strutture con componenti marcati fluorescentemente. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della virologia, tra cui l'architettura proteica di virus complessi e come questa cambia nel corso dell'infezione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, raccogliendo più immagini della stessa struttura, diventa possibile generare una mappa ad alta precisione dei suoi componenti.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla struttura dei virus, può essere applicato anche ad altri sistemi, come altri patogeni e complessi macromolecolari all'interno delle cellule dei mammiferi. In primo luogo, acquisire un'immagine del campione mediante microscopia a fluorescenza con super-risoluzione. Registrare immagini di diversi campi visivi contenenti da centinaia a migliaia di particelle ben separate, senza strutture fluorescenti indesiderate.

Una volta ottenute ed elaborate le immagini, importarle e concatenarle in uno stack con canali intercalati. Se necessario, convertire l'immagine concatenata da un hyper-stack a uno stack. Successivamente, selezionare "Estrai Strutture Virali" nel sottomenu di VirusMapper e impostare il percorso del file per le particelle estratte.

Indicare il numero di canali di fluorescenza acquisiti. Impostare il canale di riferimento sul canale di fluorescenza in cui le particelle presentano un aspetto più uniforme. Se tali particelle non presentano un massimo centrale, applicare una sfocatura gaussiana pre-rilevamento per indurre l'aspetto di un massimo centrale.

Successivamente, stimare il diametro in pixel delle particelle più grandi. Impostare il raggio della regione di interesse (ROI) leggermente superiore alla metà di tale valore. Stimare il numero di ROI necessarie per ogni fotogramma.

Utilizzare inizialmente non più di cento aree di interesse (ROI). Impostare il sovrapposizione massima delle ROI in base alla separazione delle particelle. Anteprima delle ROI per quel fotogramma.

Regolare il raggio, il numero di ROI e il sovrapposizione massima in modo che ogni particella nel fotogramma sia racchiusa in una singola ROI. Assicurarsi che le ROI siano larghe almeno alcuni pixel in più rispetto alle particelle più grandi. Quindi, fare clic su OK per eseguire la segmentazione.

Chiudere l'immagine del campione nel gestore delle aree di interesse (ROI) dopo l'estrazione. Non rinominare i set di particelle estratte. Selezionare "Genera semi" e aprire la cartella contenente i dati delle particelle estratte.

Impostare il canale di riferimento e selezionare tutti i canali per i quali deve essere generato un seme. Se necessario per corrispondere a modelli precedenti, ruotare i semi di novanta gradi. Nei canali in cui le particelle non presentano un massimo centrale, aumentare il valore del filtro gaussiano di pre-allineamento come fatto in precedenza.

Se i canali non sono allineati correttamente, attivare la correzione dello spostamento per i canali non di riferimento. Cercare nella sequenza di particelle una struttura che appaia in modo costante. Identificare un particella rappresentativa e inserire il numero di fotogramma corrispondente nel campo "Frames to use".

Esaminare i semi risultanti. La selezione dei semi è una fase critica di questa procedura. Analizzare attentamente i dati grezzi per identificare una o più strutture da modellare.

La qualità del modello dipende fortemente dalla scelta di semi che riflettano accuratamente queste strutture. Regolare il canale di riferimento, il raggio della sfocatura gaussiana e la correzione dello spostamento secondo necessità per ottimizzare l'identificazione di ulteriori fotogrammi con semi simili. Continuare ad aggiungere fotogrammi e ad aggiustare i parametri di generazione finché la struttura media rappresenta nel modo migliore possibile una struttura osservata nei dati.

Inserire il nome della cartella e il prefisso del file per i semi. Fare clic su OK per salvare le immagini dei semi per una successiva modellizzazione. Selezionare Genera modelli in base ai semi e aprire la cartella delle particelle estratte.

Caricare le medie dei semi per ogni canale. Se si esegue la scoperta della struttura basata su riferimento, selezionare un canale di riferimento per l'allineamento. Una struttura di particelle nota in un canale può essere utilizzata come riferimento per allineare un secondo canale sconosciuto.

Questo consente una mappatura imparziale della struttura sconosciuta. Tieni presente che lo spostamento cromatico tra i canali deve essere corretto in anticipo. Se l'analisi cerca piccole differenze o caratteristiche sottili nel modello, seleziona Intensità dell'immagine quadrata durante l'allineamento del modello.

Impostare la similarità minima tra il sessanta e l'ottanta percento e il numero di iterazioni a uno. Selezionare i modelli e le particelle da visualizzare durante il calcolo e generare i modelli di anteprima. Esaminare i modelli di anteprima.

Aumentare la similarità minima per includere solo particelle con la morfologia desiderata. Ottimizzare altri parametri di calcolo del modello secondo necessità e selezionare ulteriori elementi durante il processo di generazione del modello da visualizzare, se desiderato. Una volta che i modelli di anteprima risultano soddisfacenti, aumentare il numero di iterazioni a dieci.

Impostare il nome della cartella e il prefisso del file. Fare clic su OK per salvare gli stack dell'evoluzione del modello contenenti tutte le iterazioni del modello finale. Un virus Vaccinia ricombinante con due proteine marcate con proteine fluorescenti verde e rossa è stato acquisito mediante microscopia a illuminazione strutturata e modellato con il plug-in VirusMapper.

I semi sono stati generati separatamente per le orientazioni frontale e sagittale, ciascuno ottenuto come media di cinque particelle rappresentative. A seconda dell'orientamento del virus, è possibile distinguere uno o due corpi laterali. Pertanto, possono essere generati modelli distinti per le due orientazioni.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la qualità dei modelli dipende in larga misura dalla qualità dei dati grezzi acquisiti. Sebbene l'analisi di singole particelle possa aumentare la precisione, non può compensare immagini di scarsa qualità. Dopo aver seguito questa procedura, ulteriori quantificazioni o modellizzazioni possono essere effettuate su questi modelli.

Questo può aiutare a rispondere ad ulteriori domande specifiche, ad esempio sui cambiamenti a scala nanometrica nella struttura virale durante l'infezione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il software di analisi di singole particelle VirusMapper per generare modelli di architettura molecolare a partire da immagini a super-risoluzione.