Utilizzando un metodo immunohistochemico integrale per studiare l'innervazione del tratto bipolare in Suncus murinus
15 giugno 2017
Un approccio immunoistochimico a tutto tondo, per visualizzare l'espressione di proteine del neurofilamento nel tratto biliare extraepatico in Suncus murinus. È qui presentato. Questo protocollo può essere utilizzato per analizzare l'innervazione di tutti gli organi viscerali di S. murinus o di altre specie.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare la colorazione immunoistochimica a montaggio intero per la visualizzazione della distribuzione nervosa all'interno delle vie biliari di Suncus murinus. Questo metodo può essere utilizzato per analizzare la distribuzione nervosa degli organi viscerali di molte specie, in particolare organi irregolari o piccoli che sono difficili da valutare con i metodi standard. I principali vantaggi di questa tecnica sono che l'operazione è semplice.
Non richiede procedure complicate e ha un alto tasso di successo. A dimostrare la procedura con me saranno Yidan Dai, uno studente laureato, e Shuang-Qin Yi, un ricercatore, entrambi del mio laboratorio. Inizia sciacquando l'animale con perfusioni individuali di PBS e paraformaldeide al 4% in una cappa aspirante.
Quindi iniettare due o tre millilitri di lattice di neoprene bianco attraverso il catetere di perfusione nell'aorta addominale per etichettare i vasi sanguigni. E quando tutti i tessuti di interesse sono stati etichettati, estrai gli organi addominali e i relativi nervi e vasi. Quindi iniettare circa 0,1 millilitri di lattice di neoprene blu nella cistifellea per marcare il sistema biliare e post-fissare i tessuti in paraformaldeide al 4% durante la notte a quattro gradi Celsius per l'immunocolorazione a montaggio intero.
La mattina successiva, trasferire il campione in una fiala di vetro per quattro lavaggi di un'ora a temperatura ambiente in acqua distillata su un nutator. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare i tessuti in acido ortoperiodico all'1% appena preparato per 20 minuti a temperatura ambiente per prevenire qualsiasi reazione intrinseca di perossidasi. Successivamente, lavare il campione in acqua distillata per 10 minuti a temperatura ambiente, seguito dall'incubazione in papillon allo 0,004% appena preparato per due ore in bagnomaria a temperatura costante a 37 gradi Celsius con un leggero dondolio.
Al termine dell'incubazione, lavare l'esemplare con acqua distillata per 50-60 minuti. Quindi conservare i tessuti in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, lavare il campione in acqua distillata come appena dimostrato, seguito da un'altra incubazione di due ore in papillon appena preparato.
Lavare il campione per altri 50-60 minuti in acqua distillata, seguito da una fissazione notturna in paraformaldeide al 4%. La terza mattina, lavare i tessuti quattro volte in acqua distillata, seguita dall'immersione in tre incubazioni sequenziali di saccarosio ascendente di 30 minuti. Quindi congelare il campione a meno 20 gradi Celsius per 30-60 minuti, seguito dallo scongelamento completo a temperatura ambiente.
Dopo il terzo ciclo di congelamento-scongelamento, trasferire il campione in Triton X-100 al 2% per un'incubazione notturna di quattro gradi Celsius. La mattina successiva, trasferire il campione in un contenitore dell'anticorpo primario di interesse per un leggero dondolio sul nutatore a quattro gradi Celsius per tre-sei giorni in base alle dimensioni del campione. Dopo l'appropriato periodo di etichettatura, rimuovere l'anticorpo primario non legato con quattro lavaggi di un'ora in PBS a temperatura ambiente ed etichettare il campione con l'anticorpo secondario appropriato per tre giorni con un leggero oscillazione a quattro gradi Celsius.
Al termine del periodo di marcatura degli anticorpi secondari, lavare il campione quattro volte in PBS. Quindi incubare i tessuti in 10 microlitri di perossido di idrogeno al 30% in 100 millilitri di soluzione colorante allo 0,002% DAB appena preparata a quattro gradi Celsius per 16-72 ore con un leggero dondolio. Quando è stata raggiunta l'intensità di colorazione ottimale, trasferire il campione in azoturo di sodio allo 0,04% in PBS per arrestare la reazione di colorazione.
Quindi immergere con cura il campione in una capsula di Petri da 10 centimetri contenente PBS fresco e acquisire immagini a montaggio intero dei tessuti utilizzando una fotocamera montata su uno stereomicroscopio. Oltre alla visualizzazione dell'innervazione delle vie biliari extraepatiche, la marcatura con anticorpi contro le fibre nervose positive ai neurofilamenti consente anche l'identificazione univoca della densità di corsa e distribuzione del nervo vago lungo l'esofago e nello stomaco. L'etichettatura dei vasi sanguigni della cistifellea con lattice di neoprene bianco rivela una sottile fibrosi nervosa in forte contrasto con i tessuti circostanti con una maggiore densità di innervazione osservata nel collo della cistifellea rispetto al fondo oculare.
Nel dotto biliare superiore sono marcati due tipi di fasci nervosi, i fasci nervosi sottili che formano una rete irregolare e densa di nervi e corrono adesivamente risiedendo sopra e nelle vie biliari e i fasci neurali più spessi che sono distribuiti parallelamente alla superficie delle vie biliari. La marcatura del dotto biliare comune con lattice di neoprene blu e dei vasi con lattice di neoprene bianco consente la visualizzazione delle sottili fibre nervose all'estremità del dotto biliare comune e dell'area della papilla duodenale. Prima di tentare questa procedura, fai attenzione a riprodurre la sequenza temporale per ciascuno degli esperimenti poiché l'intero processo richiede da due a tre settimane per essere completato.
Per evitare di danneggiare il campione quando si cambiano le soluzioni, versare sempre le soluzioni invece di rimuovere il campione con una pinza. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di applicare questa tecnica all'etichettatura di una serie di nervi all'interno di vari organi viscerali.
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Panoramica
Questo articolo presenta un approccio immunohistochimico su preparato intero per visualizzare l'espressione della proteina neurofilamento nel dotto biliare extraepatico di Suncus murinus. Il metodo consente l'analisi della distribuzione dei nervi negli organi viscerali, in particolare quelli di piccole dimensioni o di forma irregolare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunoeistochimica
- Analisi degli organi viscerali
Sfondo
- L'immunohistochimica su preparato intero è una tecnica utilizzata per visualizzare la distribuzione dei nervi.
- Suncus murinus funge da organismo modello per lo studio dell'innervazione degli organi viscerali.
- Questo metodo presenta vantaggi per organi piccoli o irregolari, difficili da valutare con tecniche standard.
- Il protocollo è semplice e ha un'elevata percentuale di successo.
Scopo dello studio
- Visualizzare la distribuzione dei nervi all'interno del tratto biliare di Suncus murinus.
- Fornire un metodo affidabile per l'analisi dell'innervazione in diversi organi viscerali.
- Illustrare la procedura a scopo educativo.
Metodi Utilizzati
- Perfusione dell'animale con PBS e paraformaldeide al 4%.
- Colorazione immunohistochimica su preparato intero.
- Visualizzazione dell'espressione della proteina neurofilamento.
- Dimostrazione da parte di studenti universitari e borsisti di ricerca.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita della distribuzione dei nervi nel tratto biliare.
- Dimostrazione dell'efficacia del metodo per organi piccoli e irregolari.
- Alto tasso di successo della tecnica di immunohistochemica su preparati interi.
Conclusioni
- Il metodo di immunohistochimica su preparato intero è efficace per analizzare la distribuzione dei nervi.
- Questa tecnica può essere applicata a diverse specie oltre a Suncus murinus.
- Il protocollo è semplice e accessibile per i ricercatori.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo immunohistochimico su preparati interi consente la visualizzazione della distribuzione dei nervi negli organi viscerali, supportando la validazione degli obiettivi nella ricerca di neurogastroenterologia e del sistema nervoso autonomo. Fornendo una mappatura ad alta risoluzione dei pattern di innervazione in organi piccoli o irregolari, facilita la riduzione del rischio meccanicistica di bersagli terapeutici coinvolti nella funzione delle vie biliari. L'approccio offre un'elevata affidabilità predittiva per programmi di scoperta precoce incentrati sulla modulazione neurale della fisiologia degli organi viscerali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative alla funzione del nervo vago e dei nervi viscerali nella regolazione del tratto biliare.
- Valore operativo: Fornisce un metodo affidabile per la validazione funzionale delle target mediante la visualizzazione diretta della distribuzione delle fibre nervose positive per neurofilamenti.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio chiarificando il coinvolgimento dei percorsi neurali nell'omeostasi del tratto biliare e nei modelli di malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo mappe di innervazione di base nel tratto biliare.
- Output quantitativo: Consente la misurazione della densità delle fibre nervose e dei modelli di distribuzione, favorendo la standardizzazione e la riproducibilità del saggio.
- Riutilizzo della piattaforma: Adattabile ad altri anticorpi neuronali, permettendo un’applicazione scalabile in diversi sistemi di organi viscerali dopo un’ottimizzazione iniziale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Supporta la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie consentendo un'analisi dell'innervazione coerente, dalla fase di scoperta alla validazione preclinica.
- De-risking Meccanicistico: Facilita decisioni di avanzamento ponderate sui rischi chiarificando il contributo del sistema nervoso alla funzione del tratto biliare nei modelli preclinici.
- Allineamento dei Biomarcatori: Permette di correlare i cambiamenti strutturali dell'innervazione con letture funzionali nello sviluppo di biomarcatori traslazionali.
Integrazione della Pipeline e del Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dal test iniziale dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto guida e alla validazione preclinica, in particolare per approcci neuro-modulatori nei disturbi biliari e degli organi viscerali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la visualizzazione della distribuzione dei nervi nel tratto biliare e negli organi associati come esofago e stomaco.
- Screening: Migliora la prontezza dei saggi attraverso la preparazione standardizzata dei tessuti e l'immunomarcatura con elevato tasso di successo, consentendo una valutazione affidabile degli effetti dei composti sulle strutture neurali.
- Analisi: Genera dati neuroanatomici quantitativi sulla densità e distribuzione dei fasci nervosi, facilitando l'analisi comparativa tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla continuità preclinica permettendo una valutazione costante dell'innervazione attraverso diversi sistemi modello.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma istologica riutilizzabile per lo studio dell'innervazione degli organi viscerali, adattabile a diverse specie e marcatori neuronali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nel controllo neurale degli organi viscerali.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso un protocollo semplice con elevata percentuale di successo, minimizzando la variabilità tecnica.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento/cessazione fornendo dati chiari sull'anatomia neurale, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei programmi terapeutici neuro-viscerali.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei target aggiustata rispetto al rischio, basata su modelli di innervazione validati in sistemi rilevanti per la malattia.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze in immunohistochimica, dissezione dei tessuti e microscopia confocale o stereoscopica per l'acquisizione di immagini in montaggio intero.
- È subordinato all'accesso ad anticorpi primari e secondari, reagenti per l'inattivazione enzimatica e substrato DAB per la rivelazione colorimetrica.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda le condizioni di fissazione, permeabilizzazione (ad esempio, Triton X-100) e incubazione con gli anticorpi, da applicare uniformemente tra diversi laboratori.
- Richiede valutazioni di adattamento quando applicato a diversi organi viscerali o specie, in particolare per quanto riguarda l'ottimizzazione degli anticorpi e i tempi di permeabilizzazione.
- È limitato dal tempo necessario per ogni esperimento, che va da due a tre settimane, richiedendo una pianificazione accurata negli studi longitudinali.
