Utilizzando un metodo immunohistochemico integrale per studiare l'innervazione del tratto bipolare in Suncus murinus

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare la colorazione immunoistochimica a montaggio intero per la visualizzazione della distribuzione nervosa all'interno delle vie biliari di Suncus murinus. Questo metodo può essere utilizzato per analizzare la distribuzione nervosa degli organi viscerali di molte specie, in particolare organi irregolari o piccoli che sono difficili da valutare con i metodi standard. I principali vantaggi di questa tecnica sono che l'operazione è semplice.

Non richiede procedure complicate e ha un alto tasso di successo. A dimostrare la procedura con me saranno Yidan Dai, uno studente laureato, e Shuang-Qin Yi, un ricercatore, entrambi del mio laboratorio. Inizia sciacquando l'animale con perfusioni individuali di PBS e paraformaldeide al 4% in una cappa aspirante.

Quindi iniettare due o tre millilitri di lattice di neoprene bianco attraverso il catetere di perfusione nell'aorta addominale per etichettare i vasi sanguigni. E quando tutti i tessuti di interesse sono stati etichettati, estrai gli organi addominali e i relativi nervi e vasi. Quindi iniettare circa 0,1 millilitri di lattice di neoprene blu nella cistifellea per marcare il sistema biliare e post-fissare i tessuti in paraformaldeide al 4% durante la notte a quattro gradi Celsius per l'immunocolorazione a montaggio intero.

La mattina successiva, trasferire il campione in una fiala di vetro per quattro lavaggi di un'ora a temperatura ambiente in acqua distillata su un nutator. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare i tessuti in acido ortoperiodico all'1% appena preparato per 20 minuti a temperatura ambiente per prevenire qualsiasi reazione intrinseca di perossidasi. Successivamente, lavare il campione in acqua distillata per 10 minuti a temperatura ambiente, seguito dall'incubazione in papillon allo 0,004% appena preparato per due ore in bagnomaria a temperatura costante a 37 gradi Celsius con un leggero dondolio.

Al termine dell'incubazione, lavare l'esemplare con acqua distillata per 50-60 minuti. Quindi conservare i tessuti in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, lavare il campione in acqua distillata come appena dimostrato, seguito da un'altra incubazione di due ore in papillon appena preparato.

Lavare il campione per altri 50-60 minuti in acqua distillata, seguito da una fissazione notturna in paraformaldeide al 4%. La terza mattina, lavare i tessuti quattro volte in acqua distillata, seguita dall'immersione in tre incubazioni sequenziali di saccarosio ascendente di 30 minuti. Quindi congelare il campione a meno 20 gradi Celsius per 30-60 minuti, seguito dallo scongelamento completo a temperatura ambiente.

Dopo il terzo ciclo di congelamento-scongelamento, trasferire il campione in Triton X-100 al 2% per un'incubazione notturna di quattro gradi Celsius. La mattina successiva, trasferire il campione in un contenitore dell'anticorpo primario di interesse per un leggero dondolio sul nutatore a quattro gradi Celsius per tre-sei giorni in base alle dimensioni del campione. Dopo l'appropriato periodo di etichettatura, rimuovere l'anticorpo primario non legato con quattro lavaggi di un'ora in PBS a temperatura ambiente ed etichettare il campione con l'anticorpo secondario appropriato per tre giorni con un leggero oscillazione a quattro gradi Celsius.

Al termine del periodo di marcatura degli anticorpi secondari, lavare il campione quattro volte in PBS. Quindi incubare i tessuti in 10 microlitri di perossido di idrogeno al 30% in 100 millilitri di soluzione colorante allo 0,002% DAB appena preparata a quattro gradi Celsius per 16-72 ore con un leggero dondolio. Quando è stata raggiunta l'intensità di colorazione ottimale, trasferire il campione in azoturo di sodio allo 0,04% in PBS per arrestare la reazione di colorazione.

Quindi immergere con cura il campione in una capsula di Petri da 10 centimetri contenente PBS fresco e acquisire immagini a montaggio intero dei tessuti utilizzando una fotocamera montata su uno stereomicroscopio. Oltre alla visualizzazione dell'innervazione delle vie biliari extraepatiche, la marcatura con anticorpi contro le fibre nervose positive ai neurofilamenti consente anche l'identificazione univoca della densità di corsa e distribuzione del nervo vago lungo l'esofago e nello stomaco. L'etichettatura dei vasi sanguigni della cistifellea con lattice di neoprene bianco rivela una sottile fibrosi nervosa in forte contrasto con i tessuti circostanti con una maggiore densità di innervazione osservata nel collo della cistifellea rispetto al fondo oculare.

Nel dotto biliare superiore sono marcati due tipi di fasci nervosi, i fasci nervosi sottili che formano una rete irregolare e densa di nervi e corrono adesivamente risiedendo sopra e nelle vie biliari e i fasci neurali più spessi che sono distribuiti parallelamente alla superficie delle vie biliari. La marcatura del dotto biliare comune con lattice di neoprene blu e dei vasi con lattice di neoprene bianco consente la visualizzazione delle sottili fibre nervose all'estremità del dotto biliare comune e dell'area della papilla duodenale. Prima di tentare questa procedura, fai attenzione a riprodurre la sequenza temporale per ciascuno degli esperimenti poiché l'intero processo richiede da due a tre settimane per essere completato.

Per evitare di danneggiare il campione quando si cambiano le soluzioni, versare sempre le soluzioni invece di rimuovere il campione con una pinza. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di applicare questa tecnica all'etichettatura di una serie di nervi all'interno di vari organi viscerali.