Name: Utilizzando un metodo immunohistochemico integrale per studiare linnervazione del tratto bipolare in Suncus murinus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Scopri l'immunohistochimica integrale per visualizzare l'innervazione del tratto biliare in Suncus murinus. Questo metodo semplice e affidabile permette di analizzare la distribuzione nervosa in organi viscerali piccoli o irregolari.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori non hanno alcun riconoscimento.

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali di Tokyo Metropolitan University (IACUC). Gli animali sono stati alloggiati e trattati secondo la Guida per la cura e l&#39;uso degli animali da laboratorio e la Guida per la cura e l&#39;uso degli animali sperimentali del Consiglio canadese sulla cura degli animali. Abbiamo usato animali allevati e mantenuti presso il Laboratorio Morfologico Funzionale, Dipartimento di Scienze della Salute Frontiere, Tokyo Metropolitan University, Giappone. 1. Cura degli animali e alloggi <ol><li> Ottenere 7 S. murinus (3 femmine e 4 maschi che pesano 70-90 g) da una colonia di riproduzione chiusa. </li><li> Gabbia il S. murinus individualmente dopo lo svezzamento (20 d dopo la nascita) in gabbie di plastica dotate di una scatola di nido di legno contenente strisce di carta. Tenerli in un ambiente animale convenzionalmente condizionato: 23-27 ° C, nessun controllo dell&#39;umidità e 12:12 h luce: ciclo scuro. Fornitura commercPellicole di trota e acqua ad libitum. </li></ol> 2. Preparazione del tessuto <ol><li> Per preparare 4% (w / v) paraformaldeide (PFA), sciogliere 40 g di PFA in 1.000 ml di salinio fosfato-bufferizzato da 0,01 M (PBS, pH 7,4). In un armadio di fumo, mescolare usando un vortice fino a quando la soluzione è chiara. Conservare il 4% PFA O / N a 4 ° C. Attenzione: indossare adeguate apparecchiature protettive personali (PPE) durante la manipolazione del PFA. </li><li> Per perfezionare e fissare l&#39;animale, anestetizzarlo con l&#39;etere e poi darle un&#39;iniezione intraperitoneale di somnopentil (pentobarbital sodio, 0,6 ml / kg di peso corporeo). </li><li> Dopo che l&#39;animale è completamente narcotizzato, aprire la cavità addominale con un bisturi, creando un&#39;incisione addominale mediana di 3 cm di lunghezza. Mentre incide la vena cava inferiore per exsanguining, inserire un catetere retrogradamente nell&#39;aorta addominale al livello immediatamente superiore alla biforcazione di questa arteria nelle arterie ilieche comuni. </li><li> Iniettare somnopentil (pentobarbital cosìDium, 1,0 mL / kg di peso corporeo). Dopo la completa eutanasia, perfezionare con 0,01 M PBS (pH 7,4) e poi con 4% PFA in un armadio di fumo. </li><li> Dopo la perfusione, iniettare 2-3 mL di lattice in neoprene bianco (diluire il lattice di neoprene bianco 3: 2 con acqua distillata (DW)) per etichettare i vasi sanguigni. </li><li> Estrarre gli organi addominali, compresi il fegato, la cistifellea, il canale biliare comune, il duodeno e il pancreas in blocco, con i nervi e le patologie correlate. </li><li> Iniettare circa 0,1 ml di lattice blu in neoprene (aggiungere una goccia di inchiostro blu a 10 ml del lattice in neoprene bianco diluito) alla cistifellea per etichettare il sistema biliare. </li><li> Post-fix durante la notte con il 4% di PFA a 4 ° C per l&#39;immunostaining completo. Attenzione: il PFA è tossico. Evitare di gestire direttamente PFA. PFA dovrebbe essere utilizzato in un armadio di fumo. </li></ol> 3. Immunohistochemistry intero-mount Nota: Durante il protocollo, incluso durante il lavaggio, l&#39;incubazione degli anticorpi e la colorazione, thIl campione deve rimanere sul nocciolatore, scivolando delicatamente a RT oa 4 ° C. <ol><li> Giorno 1: trattamento enzimatico e inattivazione di potenziali perossidasi endogena <ol><li> Lavare il campione preparato con DW 4x per 1 h ciascuno a RT in un flaconcino di vetro adeguatamente dimensionato. Far scivolare il campione delicatamente sul nocciolatore per rimuovere il PFA. Evitare di danneggiare il campione quando si scambiano soluzioni. </li><li> Per preparare l&#39;acido ortoperiodico al 1% (v / v), sciogliere 1 g di acido orthoperiodic in 100 mL di DW. </li><li> Incubare il campione in 1% di acido orthoperiodic per 20 minuti a RT per evitare qualsiasi reazione perossidasi intrinseca. </li><li> Preparare il papaino 0,004% (w / v) sciogliendo 0,004 g di papava in 100 ml di tampone Tris-HCl 0,025 mol / l (pH 7,6). </li><li> Lavare il campione con DW per 10 minuti a RT. </li><li> Incubare il campione in papato di 0,004% preparato fresco per 2 ore a 37 ° C in un bagno a temperatura costante con un leggero dondolo. </li><li> Lavare il campione con DW per 50-60 minuti a RT. </li><li> Conservare il campione in 4% PFA a 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> 2 ° giorno: trattamento enzimatico <ol><li> Lavare il campione memorizzato con DW 4 volte per 1 h ciascuno a RT. </li><li> Incubare il campione in papato di 0,004% preparato fresco per 2 ore a 37 ° C in un bagno a temperatura costante con un leggero dondolo. </li><li> Lavare il campione con DW per 50-60 minuti a RT. Conservare il campione in 4% PFA a 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Giorno 3: trattamento congelante <ol><li> Lavare il campione memorizzato con DW 4x per 1 h ciascuno a RT, come sopra. </li><li> Preparare rispettivamente 2,5 g, 5 g e 10 g di saccarosio in 100 ml di PBS di 0,01 M (si raccomanda il 2,5% (w / v), il 5% (w / v) e il 10% PH 7,4). </li><li> Immergere il campione in 2,5% (w / v), 5% (w / v) e 10% (w / v) di saccarosio per 30 minuti ciascuno. </li><li> Fermare il campione a -20 ° C per 30-60 minuti e poi scollegarlo completamente a RT; Ripetere il ciclo 3x. </li><li> SuperioreRicaricare il 2% di Triton X-100 (v / v), aggiungere 2 mL di Triton X-100 a 100 mL di 0,01 M PBS (pH 7,4). </li><li> Conservare il campione in 2% di Triton X-100 a 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> 4 ° giorno: Incubazione primaria dell&#39;anticorpo <ol><li> Preparare la soluzione di diluizione dell&#39;anticorpo primario sciogliendo 0,2 g di albumina Bovine Serum (BSA), 0,3 ml di Triton X-100 e 0,1 g di sodio azide in 100 ml di PBS da 0,01 M (pH 7,4). Attenzione: l&#39;azido di sodio è acutamente tossico. Inalazione e tocco devono essere evitati. Indossare un adeguato DPI. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo primario (NFP) 1: 600 nel precedente tampone di diluizione (punto 3.4.1). Incubare il campione con l&#39;anticorpo NFP a 4 ° C per 3-6 giorni, mantenendo il campione delicatamente dondolando sul nutatore. I campioni più grandi richiedono tempi di incubazione aumentati. </li></ol></li><li> Incubazione secondaria anticorpale <ol><li> Lavare il campione in PBS 4x per 1 h ciascuno a RT per rimuovere l&#39;anticorpo primario non legato. </li&gt; <li> Preparare la soluzione di diluizione per l&#39;anticorpo secondario sciogliendo 0,2 g di BSA e 0,3 ml di Triton X-100 in 100 ml di PBS di pH 0,01 (pH 7,4). </li><li> Diluire l&#39;anticorpo secondario (perossidasi-coniugato, affinità-pecore anti-mouse IgG-HRP) 1: 600 nel tampone di diluizione (punto 3.5.2). Incubare il campione con l&#39;anticorpo secondario a 4 ° C per 3 d, e mantenere il campione dondolando delicatamente sul nocciolo. </li></ol></li><li> Colorazione <ol><li> Preparare la soluzione di colorazione DAB con l&#39;aggiunta di 0,002 g di 3,3&#39;-diaminobenzidin-tetraidloruro (DAB) a 100 ml di tampone Tris-HCl (pH 7,6) di 0,05 mol / l sotto un armadio di fumo mantenendo la soluzione al buio. </li><li> Lavare gli esemplari a RT in PBS 4x per 1 h ciascuno. </li><li> Aggiungere 10 μl di 30% di H 2 O 2 in soluzione di colorazione DAB preparata di fresco e incubare con la soluzione a 4 ° CO / N o per 3 giorni mentre dondolando delicatamente sul nutatore. </li><li> Arrestare la reazione con plaIl campione in PBS con azoto sodico al 0,04% quando viene raggiunta l&#39;intensità di colorazione ottimale. NOTA: Evitare l&#39;uso di sodio azide fino a questo passaggio, in quanto inibisce la perossidasi di rafano. </li></ol></li><li> Imaging del tessuto macchiato <ol><li> Trasferire con cura il campione su un piatto di vetro di Petri (5 cm di altezza, 10 cm di diametro) contenente PBS. Cattura immagini integrali utilizzando una fotocamera montata su uno stereomicroscopio. NOTA: Il tessuto macchiato interamente montato dovrebbe essere imaged mentre è immerso completamente in PBS su un piatto di vetro trasparente. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+the+hypoglossal+nerve+in+the+chick+embryo+as+observed+by+the+whole-mount+nerve+staining+method%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method.</a> Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).</li>
<li>Kuratani, S., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+development+of+the+avian+vagus+nerve+with+special+reference+to+the+morphological+innervation+of+heart+and+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung.</a> Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).</li>
<li>Kuratani, S., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+development+of+avian+trigeminal+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Peripheral development of avian trigeminal nerves.</a> Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+anatomy+of+innervation+of+the+gallbladder+in+humans+and+Suncus+murinus+with+special+reference+to+morphological+understanding+of+gallstone+formation+after+gastrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy.</a> World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+the+pancreas+in+the+house+musk+shrew%2C+Suncus+murinus%2C+with+special+reference+to+the+blood+supply+and+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A+Discov.+Mol.+Cell+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation.</a> Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15782096">Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures.</a> Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4087648/">Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy.</a> World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).</li>
<li>Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26179953">Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study.</a> Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+proteins+in+axonal+regeneration+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen.+Res%22%5BJournal%5D)">Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases.</a> Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).</li>
<li>Wyatt, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+the+sphincter+of+Oddi+to+the+stomach%2C+duodenum+and+gall-bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder.</a> J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).</li>
<li>Mawe, G. M., Kennedy, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenal+neurons+provide+nicotinic+fast+synaptic+input+to+sphincter+of+Oddi+neurons+in+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig.</a> Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).</li>
<li>Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+neuropeptidergic+properties+of+the+duodenal+neurons+projecting+to+the+gallbladder+in+the+golden+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster.</a> Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).</li>
<li>Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+nerve+cells+from+the+duodenum+to+the+sphincter+of+Oddi+and+gallbladder+of+the+Australian+possum%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum.</a> Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).</li>
<li>White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wholemount+immunohistochemistry+for+revealing+complex+brain+topography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography.</a> J. Vis. Exp. (62), e4042(2012).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Questo lavoro descrive la procedura sperimentale per la visualizzazione dell&#39;innervazione del tratto biliare extraepatico usando un anticorpo contro la proteina del neurofilamento. Questo protocollo è stato adattato dal protocollo descritto da Kuratani e Tanaka 1 , 2 , 3 . Per questo esperimento, pianificare la timeline per ciascuno degli esperimenti, in quanto l&#39;approccio di colorazione a t...

Il muschio della casa, Suncus murinus , appartiene all&#39;ordine Insectivora e alla famiglia Soricidae. Questo piccolo mammifero è distribuito in tutto il Sud-Est asiatico e abita case e aree erbose che si trovano vicino a abitazioni umane o penne di bestiame 4 . Questa specie presenta caratteristiche morfologiche generali più simili agli esseri umani rispetto ad altri animali da laboratorio, come il topo, il topo e il coniglio 5 . In precedenza, l&#39;immunostaining con un marker di neurone periferico per la proteina del neurofilamento di S. murinus (NFP) è stato usato per etichettare i nervi periferici nel pancreas 6 , maggiore papilla duodenale 7 , pylorus 8 , cistifellea 5 e tratto biliare extraepatico 9 . NFP è un complesso macromolecolare che fa parte del citoscheletro neuronale maturo. Proteina legata al neurofilamentoLe interazioni mediate tra NFP e zigosoma. La funzione enzimatica e la struttura delle proteine ​​di collegamento sono regolate da NFP 10 . Il complesso NFP è costituito da tre polipeptidi: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) e NF-H (200 kDa). NFP può essere trovato in assoni neuronali sia nel sistema nervoso centrale che nei periferici. È stato dimostrato che l&#39;anticorpo anti-umano del NFP ha etichettato assoni del sistema nervoso centrale e periferico. Le indagini anatomiche ed elettrofisiologiche hanno dimostrato che lo sfintere, la cistifellea e il tratto gastrointestinale prossimale sono collegati 11 , 12 , 13 , 14 . Tuttavia, le caratteristiche morfologiche delle loro connessioni neuronali non sono ancora state definite. Questo lavoro dimostra l&#39;utilizzo di un metodo di colorazione immunohistochemico a tutto campo per etichettare l&#39;innervazione del S. murinus bilCon un anticorpo NFP.

<table><tbody><tr><td>acido ortoperiodico</td><td>Wako</td><td>162-00732</td><td></td></tr><tr><td>papaina</td><td>Wako</td><td>164-00172</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Wako</td><td>010-15131</td><td></td></tr><tr><td>sodio azide</td><td>Nacalai Tesque</td><td>312-33</td><td></td></tr><tr><td>proteina del neurofilamento (NFP) anticorpo</td><td>Dako</td><td>M0762, lotto 089, clone: 2F11</td><td></td></tr><tr><td>perossidasi-coniugato anti-topo IgG-HRP MBL purificato per affinità</td><td></td> Codice <td>330</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-diaminobenzidina tetracloridrato (DAB)</td><td>Wako</td><td>349-00903</td><td></td></tr><tr><td>imidazolo</td><td>Sigma</td><td>I-0125</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando un metodo immunohistochemico integrale per studiare l&#39;innervazione del tratto bipolare in<em&gt; suncus murinus</em

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Questo lavoro descrive dettagliatamente il metodo di colorazione immunohistochemica a tutto campo, utilizzando l&#39;anticorpo proteico neurofilamento per etichettare l&#39;innervazione del tratto biliare in Suncus murinus ( S. murinus &#160; ). In primo luogo, il campione è stato disciolto da S. murinus e fissato in 4% di paraformaldeide (PFA). In secondo luogo, sono stati eseguiti un trattamento enzimatico e una potenziale inattivazione endogena della perossidasi. Il campione è stato poi esposto all&#39;anticorpo primario, anticorpo anti-neurofilamento proteico, per 3-6 giorni. Fu quindi incubato con l&#39;anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano. La reazione a colori è stata rivelata reagendo il campione con un substrato 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB). Questo metodo può essere applicato per analizzare l&#39;innervazione di tutti gli organi viscerali. Inoltre, questo protocollo può anche essere adattato per testare altri anticorpi neuronali, ma l&#39;ottimizzazione degli antibodiDovrebbe essere fatto prima. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Kuratani e Tanaka 1 , 2 , 3 .

Le figure da 1 a 4 mostrano risultati tipici per le fibre nervose NFP-positive nel tratto biliare extraepatico di S. murinus . L&#39;anticorpo contro NFP riproduce etichettato l&#39;innervazione nell&#39;intera immagine del tratto biliare extraepatico ( Figura 1 ), della cistifellea ( Figura 2 ), del canale biliare superiore ( Figura 3 ) e dell&#39;area del...

Un approccio immunoistochimico a tutto tondo, per visualizzare l&#39;espressione di proteine ​​del neurofilamento nel tratto biliare extraepatico in Suncus murinus. È qui presentato. Questo protocollo può essere utilizzato per analizzare l&#39;innervazione di tutti gli organi viscerali di S. murinus o di altre specie.

Utilizzando un metodo immunohistochemico integrale per studiare l&#39;innervazione del tratto bipolare in<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è utilizzare la colorazione istochimica immunologica su preparati interi per la visualizzazione della distribuzione dei nervi all'interno del dotto biliare di Suncus murinus. Questo metodo può essere impiegato per analizzare la distribuzione nervosa degli organi viscerali di numerose specie, in particolare organi irregolari o di piccole dimensioni che risultano difficili da valutare mediante metodi standard. I principali vantaggi di questa tecnica sono la semplicità dell'operazione.Non richiede procedure complesse ed ha un alto tasso di successo. A dimostrare la procedura insieme a me saranno Yidan Dai, studentessa laureata, e Shuang-Qin Yi, ricercatrice, entrambe del mio laboratorio. Iniziare lavando l'animale con soluzione salina tampone fosfato (PBS) e perfusioni di paraformaldeide al 4% in una cappa aspirante.Quindi iniettare due o tre millilitri di lattice di neoprene bianco attraverso il catetere di perfusione nell'aorta addominale per etichettare i vasi sanguigni. Una volta che tutti i tessuti di interesse sono stati etichettati, estrarre gli organi addominali e i nervi e vasi ad essi associati. Successivamente, iniettare circa 0,1 millilitri di lattice di neoprene blu nella colecisti per etichettare il sistema biliare e fissare ulteriormente i tessuti in paraformaldeide al 4% per una notte a quattro gradi Celsius per l'immunomarcatura su preparati interi.Il mattino seguente, trasferire il campione in un vial di vetro per quattro lavaggi di un'ora a temperatura ambiente in acqua distillata su un nutatore. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare i tessuti in acido ortoperiodico al 1% appena preparato per 20 minuti a temperatura ambiente per prevenire eventuali reazioni di perossidasi intrinseche. Successivamente, lavare il campione in acqua distillata per 10 minuti a temperatura ambiente, seguito da incubazione in papillon al 0,004% appena preparato per due ore in un bagno termostatato a 37 gradi Celsius con movimento delicato.Alla fine dell'incubazione, lavare il campione con acqua distillata per 50-60 minuti. Successivamente, conservare i tessuti in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, lavare il campione in acqua distillata come appena illustrato, seguito da un'ulteriore incubazione di due ore in papillon appena preparato.Lavare il campione per altri 50-60 minuti in acqua distillata, seguito da fissazione notturna in paraformaldeide al 4%. La terza mattina, lavare i tessuti quattro volte in acqua distillata, seguiti da immersione in tre incubazioni consecutive di saccarosio con tempi crescenti di 30 minuti. Successivamente, congelare il campione a meno 20 gradi Celsius per 30-60 minuti, seguito da scongelamento completo a temperatura ambiente.Dopo il terzo ciclo di congelamento-scongelamento, trasferire il campione in Triton X-100 al 2% per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina successiva, trasferire il campione in un contenitore con l'anticorpo primario di interesse e lasciarlo agitare dolcemente sul nutator a quattro gradi Celsius per un periodo compreso tra tre e sei giorni, in base alle dimensioni del campione. Al termine del periodo di marcatura appropriato, rimuovere l'anticorpo primario non legato mediante quattro lavaggi di un'ora ciascuno in PBS a temperatura ambiente e quindi marcare il campione con l'anticorpo secondario appropriato per tre giorni, agitando dolcemente a quattro gradi Celsius.Al termine del periodo di marcatura con l'anticorpo secondario, lavare il campione quattro volte in PBS. Successivamente, incubare i tessuti in 10 microlitri di perossido di idrogeno al 30% in 100 millilitri di soluzione di colorazione DAB 0,002% appena preparata a quattro gradi Celsius per 16-72 ore con agitazione delicata. Quando è stata raggiunta l'intensità di colorazione ottimale, trasferire il campione in azoturo di sodio 0,04% in PBS per arrestare la reazione di colorazione.Quindi immergere con attenzione il campione in una piastra di Petri da 10 centimetri contenente PBS fresco e acquisire immagini in montaggio integrale dei tessuti utilizzando una telecamera montata su un microscopio stereoscopico. Oltre alla visualizzazione dell'innervazione del dotto biliare extraepatico, l'etichettatura con anticorpo contro le fibre nervose positive per neurofilamento permette anche l'identificazione inequivocabile del decorso e della densità di distribuzione del nervo vago lungo l'esofago e fino allo stomaco. L'etichettatura dei vasi sanguigni della colecisti con lattice di neoprene bianco rivela una fibrosi nervosa sottile in alto contrasto rispetto ai tessuti circostanti, con una densità di innervazione maggiore osservata nel collo della colecisti rispetto al fondo.Nel dotto biliare superiore, vengono evidenziati due tipi di fasci nervosi: i fasci fini, che formano una rete irregolare e densa di nervi e si estendono aderendo alla superficie e all'interno del tratto biliare, e i fasci neurali più spessi, distribuiti in modo parallelo alla superficie del tratto biliare. L'evidenziazione del dotto biliare comune con lattice neoprenico blu e dei vasi con lattice neoprenico bianco permette di visualizzare le sottili fibre nervose all'estremità del dotto biliare comune e nella zona della papilla duodenale. Prima di eseguire questa procedura, è necessario pianificare attentamente la tempistica di ciascun esperimento, poiché l'intero processo richiede da due a tre settimane per essere completato.Per evitare di danneggiare il campione durante il cambio delle soluzioni, versare sempre le soluzioni anziché rimuovere il campione con pinzette. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di applicare questa tecnica all'etichettatura di una serie di nervi all'interno di diversi organi viscerali.

using-whole-mount-immunohistochemical-method-to-study-innervation

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Le cellule interstiziali di Cajal (ICC) sono le cellule pacemaker del tratto gastrointestinale (GI). Essi formano reti complesse tra le cellule muscolari lisce e fibre neuronali post-gangliari per regolare contrattilità gastrointestinale. Qui vi presentiamo metodi di immunofluorescenza trasversale e con tutto il supporto di visualizzazione murini reti ICC.

Visualizzazione delle cellule interstiziali di Cajal (ICC) di rete in topi

Normale adulto tessuto vascolarizzato mammiferi che manca l'angiogenesi fisiologica e che non è stata esposta a un intervento chirurgico viene utilizzato per studiare: (i) l'avvio e lo sviluppo di angiogenesi in seguito alla somministrazione intraperitoneale di agenti di test, e (ii) la modifica di angiogenesi dopo somministrazione sistemica di selezionati agenti di test.

Rat mesentere angiogenesi Assay

Questo video dimostra una tecnica di localizzazione in immunofluorescenza (IVIL) in vivo per studiare la biodistribuzione di anticorpi mirati al tumore in un modello murino di cancro al seno. Dopo l'iniezione endovenosa di un anticorpo specifico per il tumore nel topo, il tumore viene isolato chirurgicamente e la localizzazione dell'anticorpo all'interno del tessuto tumorale viene confermata tramite immunocolorazione ex vivo.

Un metodo di localizzazione in immunofluorescenza in vivo per studiare la biodistribuzione degli anticorpi

Questo video dimostra l'immunocolorazione del tratto gastrointestinale murino embrionale per visualizzare e analizzare la distribuzione della popolazione neuronale utilizzando l'immunofluorescenza e la microscopia confocale.

Colorazione immunofluorescente di popolazioni neuronali nel tratto gastrointestinale murino embrionale

La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell'angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l'angiogenesi in...

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Il sistema nervoso enterico (ENS) è una rete di neuroni e glia situata nella parete intestinale che controlla i riflessi intestinali. Questo protocollo descrive i metodi per registrare l'attività dei neuroni enterici e della glia in preparazioni vive di ENS utilizzando l'imaging Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervoso enterico

Il sistema nervoso enterico è formato da cellule della cresta neurale che proliferano, migrano e colonizzano l'intestino. Le cellule della cresta neurale si differenziano in neuroni con marcatori specifici per il loro fenotipo di neurotrasmettitore. Questo protocollo descrive una tecnica per la dissezione, il fissaggio e l'immunocolorazione del tratto gastrointestinale embrionale murino per visualizzare l'espressione dei neurotrasmettitori del sistema nervoso enterico.

Immunostaining Per visualizzare Murine enterico nervoso Sistemi Di Sviluppo

L'esame ecocardiografico è frequente nei topi. Sono stati sviluppati dispositivi costosi ultrasuono ad alta definizione per questo scopo. Questo protocollo descrive una procedura ecocardiografica conveniente combinata con analisi morfometriche istologico per determinare la morfologia cardiaca.

Esame ecocardiografico ed istologico della morfologia cardiaca nel topo

Vi presentiamo un metodo piuttosto semplice e sensibile per la quantificazione accurata della densità del condotto biliare nel fegato del topo. Questo metodo può aiutare a determinare gli effetti dei modificatori genetici e ambientali e l'efficacia delle potenziali terapie nei modelli murini delle malattie biliari.

Determinazione della densità del dotto biliare nel fegato del topo

Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l'imaging intravitale dell'intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all'interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

Scopri l'immunohistochimica integrale per visualizzare l'innervazione del tratto biliare in Suncus murinus. Questo metodo semplice e affidabile permette di analizzare la distribuzione nervosa in organi viscerali piccoli o irregolari.

Utilizzando un metodo immunohistochemico integrale per studiare l'innervazione del tratto bipolare in

Esplora altri video