Protocolli per Indagare la distribuzione Host-tessuti, trasmissione-mode, e Effetto sul Fitness ospite di un Densovirus in cotone bollworm

L'obiettivo generale di questo protocollo è studiare l'effetto di un densovirus, HaDV2, sul suo ospite, Cotton Bollworm. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione tra virus e ospiti, come l'effetto di un virus che ora si trova sul percorso sui loro ospiti. Il vantaggio principale di questa tecnica che le larve utilizzano per costruire ceppi virali positivi e negativi deriva dagli stessi par-ne-co-ospiti, garantendo lo stesso background genetico.

Per iniziare l'esperimento, otto accoppiamenti a coppia singola di falene appena chiuse utilizzando una gabbia di plastica per coppia ricoperta di garza di cotone per garantire una buona ventilazione e fungere da substrato per la posizione dell'ovulo. Per aumentare la probabilità di ottenere una colonia libera da virus, utilizzare almeno 30 coppie di accoppiamenti a coppia singola. Nutri le falene adulte con un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione vitaminica al 10% di zucchero e al 2% di soluzione e reintegra la soluzione ogni giorno.

Il post-accoppiamento di oggi, quando le femmine adulte depongono le uova sulla garza di cotone, iniziano a cambiare la garza ogni giorno. Raccogli e conserva le uova contenenti garze nella stessa stanza di crescita delle falene adulte fino a quando le uova non si schiudono. Trasferire immediatamente le larve appena nate in nuove piastre a 24 pozzetti con un individuo per pozzetto.

Cinque giorni dopo la prima data di deposizione delle uova, raccogli le falene madri e conservale in azoto liquido. Verificare la presenza di HaDV2 dei genitori utilizzando la PCR con primer specifici e mantenere gli individui privi di HaDV2 come ceppo non infetto privo di HaDV2. Raccogli le falene adulte singolarmente e conservale immediatamente in azoto liquido.

Macinare completamente le singole falene raccolte in azoto liquido utilizzando un mortaio e un pestello sterilizzati. Trasferisci circa 10 microgrammi di detriti in una provetta pulita da 1,5 millilitri. Quindi trasferire i detriti rimanenti in un nuovo tubo e conservarli immediatamente a 80 gradi Celsius.

Estrarre il DNA dai 10 microgrammi di detriti seguendo i protocolli forniti dal produttore. Una volta isolato il DNA della falena, verificare la presenza di HaDV2 utilizzando il protocollo. In base ai risultati, dividere i detriti rimanenti in due gruppi: HaDV2 positivo e HaDV2 negativo.

Aggiungere un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, a ciascun individuo per sciogliere completamente i detriti larvali rimanenti. Pre-raffreddare la centrifuga a quattro gradi Celsius, quindi centrifugare l'omogeneizzato. Sul ghiaccio, filtrare il surnatante liquido con il filtro a membrana da 0,22 micron.

Raccogli 200 microlitri per provetta dei liquidi filtrati e conservali immediatamente a 80 gradi Celsius. Per determinare l'efficienza dell'infezione orale con l'HaDV2 infetto, filtrare liquidi di diversa concentrazione diluendo il fluido contenente HaDV2. In una cappa aspirante distribuire uniformemente 200 microlitri di HaDV2 contenente liquidi filtrati per ogni concentrazione sulla superficie della dieta artificiale solida.

Successivamente, inizia a trasferire 100 larve appena nate nella dieta artificiale HaDV2 contenente una capsula di Petri. Battere delicatamente la garza di cotone, comprese le larve appena schiuse, per trasferire le larve dalla garza a un foglio di carta bianca. Batti delicatamente la carta in modo che le larve girino la seta e si sollevino dalla carta.

Usa una pinza sterilizzata per toccare la seta e sposta le larve in una capsula di Petri. Dopo 48 ore, trasferire una singola larva per pozzetto con la dieta artificiale su piastre a 24 pozzetti. Riscaldare le larve inoculate con HaDV2, utilizzando le stesse concentrazioni allo stadio adulto.

Verificare lo stato di infezione da HaDV2 degli adulti utilizzando il protocollo. Gli adulti inoculati con un numero di copie da 10 all'ottavo per microlitro di HaDV2 hanno prodotto un'infezione del 100% e sono conservati come ceppo HaDV2 positivo. Per evitare contaminazioni, sterilizzare tre volte le pinze e le forbici in etanolo al 75% e poi scaldarle nella fiamma di una lampada ad alcool.

Utilizzando una bilancia analitica, pesare le provette vuote che devono essere utilizzate per conservare i tessuti. Successivamente, posizionare le larve e le falene adulte del ceppo infetto sul ghiaccio per circa cinque minuti. Fissare le larve congelate sul cistosepimento utilizzando due spilli per insetti inseriti nelle membrane intersegmentali vicino alla testa e all'ultimo segmento dell'addome.

Quindi, nell'addome posteriore, tagliare la zampa anteriore delle larve in modo che l'emolinfa fuoriesca. Utilizzare una pipetta per pipettare circa 10 microlitri di emolinfa larvale entro circa 10 secondi per prevenire l'imbrunimento e la coagulazione dell'emolinfa. Con un paio di forbici praticare un'incisione nella cuticola che va dall'ultima membrana intersegmentale alla testa.

Usando due pinze, sezionare l'intestino anteriore, l'intestino medio, l'intestino posteriore, il corpo grasso e i tubuli malpighiani. Per prevenire la contaminazione dei tessuti rimanenti con l'emolinfa durante la dissezione, lavare i tessuti sezionati in tampone PBS. Mescola campioni di tessuto di tre individui insieme come un unico replicante.

Trasferire immediatamente ogni tessuto nelle provette in azoto liquido. In una capsula di Petri pulita contenente tampone PBS, sezionare i tessuti di femmine e maschi adulti e trasferire immediatamente ciascun tessuto nelle provette in azoto liquido. Pesare le provette e i tessuti di cui sopra separatamente e calcolare la massa dei tessuti.

Estrarre il DNA da questi tessuti ed eseguire la kPCR per quantificare il titolo virale di ciascun tessuto. Metti almeno 100 pupe o falene adulte appena emerse derivate dal ceppo non infetto in una gabbia di rete metallica da 5 litri ricoperta di garza di cotone. Dopo due giorni, le femmine adulte accoppiate inizieranno a deporre le uova sulla garza di cotone.

Raccogli e mantieni la garza di cotone contenente le uova. Procedere con l'inoculazione delle larve neonate trasferendo le larve neonate del ceppo non infetto alla dieta artificiale contenente HaDV2 per stabilire il ceppo infetto. Allo stesso modo, trasferire le larve neonate alla dieta artificiale ricoperta di liquido filtrato privo di HaDV2 per stabilire i gruppi di controllo, il ceppo non infetto.

Includere almeno 240 larve in ogni trattamento. Dopo 48 ore, trasferire una singola larva per pozzetto su piastre a 24 pozzetti. Numera in sequenza ogni larva in ogni pozzetto e registra quotidianamente lo stadio di stadio e lo stato di sopravvivenza.

Circa cinque giorni dopo, quando la dieta artificiale si deteriora, trasferisci contemporaneamente questi individui in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente una dieta artificiale fresca. Pesare le larve dal settimo all'undicesimo giorno utilizzando una bilancia analitica. Dopo la pesatura, rimettere singolarmente le larve nella piastra a 24 pozzetti.

Dopo la muta al quinto stadio, circa dieci giorni dopo la schiusa, trasferire le larve in tubi di vetro. Trasferisci gli individui nel tubo di vetro alla stessa ora ogni giorno. Le larve del quinto stadio possono anche essere identificate dalla larghezza della capsula della testa.

Quindi, codifica ogni larva con il suo numero di riferimento originale sul tubo di vetro usando vernice o pennarelli. Registra lo stato larvale ogni giorno. Registra le pupe e la data di eclosione per ogni individuo nel tubo di vetro e registra la massa delle pupe di tre giorni.

Dopo l'eclosione, mettere una femmina e un maschio in un'unica gabbia con il 10% di saccarosio e il 2% di soluzione vitaminica. Reintegrare la soluzione di saccarosio ogni giorno. Registra la data di morte per ogni falena.

Quando le uova vengono deposte, cambiare la garza di cotone ogni giorno. Conta subito il numero di uova. Infine, conta la prole appena nata mentre si schiudono.

I tri-al sono stati eseguiti per garantire la qualità dei campioni utilizzati nell'esperimento. Le progenie dei genitori maschi e femmine che abbiamo libero da HaDV2 sono state allevate come ceppo non infetto. Abbiamo amplificato con successo il gene dell'actina nei genitori e nelle progenie utilizzando lo stesso modello di DNA, suggerendo che i modelli di DNA erano di buona qualità.

Le otto progenie selezionate casualmente erano anche prive di HaDV2, HaNPV e Wolbachia. Una curva standard che definisce la relazione tra il log della qualità del materiale di partenza e i valori di CT ottenuti mostra una forte correlazione lineare tra i valori di CT e il log del numero iniziale di copie geniche di HaDV2. Il numero di copie di HaDV2 è stato calcolato per microgrammo di ciascun tessuto e la percentuale del titolo totale di HaDV2 per il tessuto specifico ha rivelato che HaDV2 era distribuito principalmente nel corpo adiposo.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di maneggiare le larve delicate durante i primi cinque giorni dopo la schiusa durante la procedura di en-tiro.