Analisi dell'immunofluorescenza della formazione di granuli di stress dopo la sfida batterica delle cellule dei mammiferi
3 luglio 2017
Descriviamo un metodo per l'analisi qualitativa e quantitativa della formazione di granuli di stress nelle cellule dei mammiferi dopo che le cellule sono sfidate con batteri e una serie di sollecitazioni diverse. Questo protocollo può essere applicato per indagare la risposta del granulo di stress cellulare in una vasta gamma di interazioni ospedaliere-batteriche.
L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare gli effetti di un'infezione batterica sulla capacità delle cellule ospiti di formare granuli di stress in risposta a uno stress esogeno. Questo metodo rappresenta uno strumento prezioso nel campo della microbiologia cellulare per determinare se un determinato patogeno sia in grado o meno di alterare o eludere l'intero percorso dei granuli di stress. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di analizzare i granuli di stress in modo rigoroso e automatizzato, sia qualitativamente che quantitativamente, utilizzando programmi gratuiti di analisi delle immagini.
Questo metodo fornisce informazioni sulle dinamiche della formazione e composizione dei granuli di stress e su come questi parametri siano influenzati da un patogeno specifico. Grazie. Prima di iniziare la prova, inoculare una colonia rossa di batteri S.flexneri M90T da una piastra di agar al tripticaso con 1% di agar al rosso Congo appena striata in un tubo conico da 15 millilitri contenente otto millilitri di brodo tripticaso.
Dopo aver serrato il coperchio, incubare la colonia tutta la notte in agitazione a 222 giri al minuto e 30 gradi Celsius. Il giorno successivo, sottocolturare 150 microlitri dei batteri in otto millilitri di brodo triptico di soia fresco per circa due ore a 37 gradi Celsius e 222 giri al minuto per indurre una fase esponenziale tardiva di espressione dei geni di virulenza e per aumentare la suscettibilità infettiva dei batteri. Quando la densità ottica del sottocoltura è compresa tra 0,6 e 0,9, trasferire un millilitro dei batteri in una provetta da 1,5 millilitri per la loro raccolta mediante centrifugazione.
E risospendere il pellet nel mezzo di infezione a una densità ottica di uno. Successivamente, aspirare i soprannatanti da ogni pozzetto di una coltura di coprivetri con cellule HeLa. E lavare con attenzione le cellule HeLa con 500 microlitri di mezzo fresco per pozzetto, a temperatura ambiente, specifico per cellule HeLa.
Sostituire la soluzione di lavaggio con 500 microlitri di mezzo di infezione per pozzetto e centrifugare la piastra a 24 pozzetti per far sedimentare i batteri sulle cellule. Trasferire le colture cellulari batteriche sedimentate in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius per 30 minuti per favorire l'infezione delle cellule ospiti. Al termine dell'incubazione, rimuovere i batteri esogeni dalle cellule con tre risciacqui di un millilitro di mezzo di coltura HeLa fresco a 37 gradi Celsius per ogni lavaggio.
Quindi coprire le cellule infette con un millilitro di mezzo di coltura fresco contenente gentamicina e reinserire la piastra nell'incubatrice per colture cellulari. Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo con 500 microlitri del mezzo di coltura appropriato, integrato con l'agente di stress di interesse, e reinserire le cellule nell'incubatrice per colture di tessuti. Dopo un'ora, aspirare completamente il sopranatante e fissare i campioni in 0,5 millilitri di paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente in PBS per 30 minuti.
Successivamente, smaltire il fissativo nel contenitore per rifiuti appropriato e lavare le lamelle con un millilitro di soluzione salina tamponata al tris per due minuti con agitazione delicata. Al termine del lavaggio, aspirare completamente il TBS e permeabilizzare le cellule in ogni pozzetto con 500 microlitri di Triton X-100 al 0,3% in TBS. Dopo 10 minuti, sostituire la soluzione permeabilizzante con un millilitro di TBS, agitare delicatamente la piastra e quindi sostituire il TBS con un millilitro di soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente.
Per etichettare le cellule con un cocktail di anticorpi primari di interesse, depositare 50 microlitri della miscela di anticorpi primari per ogni coprislip su un pezzo di Parafilm in plastica fissato saldamente al piano del bancone. Successivamente, utilizzare pinzette per prendere il primo coprislip e tamponare il bordo del coprislip su un pezzo di carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso.
Posizionare con attenzione il coprivetrino sulla goccia e incubare i coprivetrini nelle appropriate condizioni di marcatura. Al termine dell'incubazione con l'anticorpo primario, trasferire ciascun coprivetrino in un pozzetto separato di una nuova piastra a 24 pozzetti contenente un millilitro di TBS per pozzetto, e lavare le cellule a temperatura ambiente su un agitatore per piastre per cinque minuti, per tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, marcare le cellule su ciascun coprivetrino con la miscela appropriata di anticorpi secondari, come appena illustrato.
E incubare le coprioggetti al buio per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione con l'anticorpo secondario, lavare le cellule con un millilitro di PBS per tre volte in una nuova piastra a 24 pozzetti con agitazione delicata come appena dimostrato, ma protette dalla luce. Dopo l'ultimo lavaggio, immergere brevemente ciascun coprioggetto in acqua deionizzata per rimuovere il sale, asciugare leggermente i bordi del coprioggetto su un fazzoletto di carta e montare con attenzione i coprioggetti su cinque microlitri di mezzo di montaggio fluorescente per ogni vetrino da microscopio, evitando bolle d'aria.
Quindi sigillare il vetrino con lo smalto per unghie e conservare i preparati in modo appropriato fino all'acquisizione delle immagini. Per acquisire le immagini delle cellule mediante microscopia confocale a fluorescenza, iniziare selezionando l'obiettivo appropriato e i canali fluorescenti corretti per l'acquisizione delle immagini.
Quindi acquisire pile di immagini delle cellule utilizzando il software di acquisizione appropriato. Una volta acquisite tutte le immagini, utilizzare il software di analisi dell'immagine appropriato per comprimere le pile di immagini e salvare le pile come file TIFF. Successivamente, caricare un'immagine TIFF di controllo e una sperimentale sulla piattaforma di analisi dell'immagine e selezionare Tabella di corrispondenza per aprire i parametri del canale nella finestra Sequenza.
Fare clic su tutte le caselle di controllo delle schede dei canali per disattivare tutti i canali. Quindi fare clic sul canale zero e sulla barra del colore del canale zero per selezionare il colore desiderato, aumentando l'intensità del canale secondo necessità per visualizzare tutte le strutture. Dopo aver selezionato e regolato ciascuno dei canali cromatici appropriati per l'analisi sperimentale, selezionare la scheda canvas e regolare la scheda dello zoom per visualizzare circa 10 cellule per campo visivo.
Utilizzando lo strumento poligono, fare clic sulla cellula di interesse ed estendere la linea attorno alla cellula per delimitarne il contorno. Per assegnare un nome a questa regione di interesse, nella finestra della regione di interesse, fare clic con il tasto destro sulla cellula di interesse e fare doppio clic sul nome della regione di interesse per modificarlo. Dopo aver selezionato e denominato tutte le cellule di interesse nello stesso modo, aprire l'applicazione Spot Detector nella scheda di rilevamento e tracciamento.
Aprire la scheda Pre Processing e selezionare il canale da analizzare. Nella scheda Detector, selezionare Rileva punti luminosi su sfondo scuro e scegliere la scala e la sensibilità appropriate. Nella scheda Region of Interest, selezionare la regione di interesse suggerita dalla sequenza.
Nella scheda Filtraggio, selezionare NessunFiltraggio. Nella scheda Output, selezionare l'output appropriato. Selezionare Rimuovi punti precedenti renderizzati come regioni di interesse e fare clic su nessun file selezionato per scegliere la cartella in cui salvare il file.
Quindi, nella scheda Display, selezionare le opzioni appropriate di interesse e fare clic su Start Detection. All'interno del software di analisi delle immagini, il rilevatore di punti può essere utilizzato per identificare i granuli di stress all'interno di ciascuna delle regioni di interesse designate. Successivamente, può essere generata un'immagine binaria per visualizzare tutti i granuli di stress identificati.
L'analisi dei granuli da stress deve essere attentamente adattata a ciascun mercato di granuli da stress analizzato. Ad esempio, modificare il requisito dimensionale della regione di interesse rilevata o la sensibilità dei parametri di rilevamento porta a risultati variabili. A scale dimensionali maggiori in termini di pixel, i granuli da stress più piccoli non verranno conteggiati e il numero di granuli da stress diminuirà.
Mentre l'aumento della sensibilità comporta un incremento del numero di granuli di stress. Ad esempio, in questo esperimento, una scala di due con una sensibilità di 100 ha fornito il risultato migliore per il marcatore di granuli di stress G3BP1. Mentre una scala di due con una sensibilità di 55 ha fornito il risultato migliore per il marcatore di granuli di stress EIF3B.
L'area superficiale può quindi essere calcolata a partire dalle dimensioni dei granuli di stress. I grafici della distribuzione di frequenza sono utili per evidenziare gli spostamenti nelle dimensioni dei granuli di stress tra diverse popolazioni cellulari. Inoltre, l'intensità della fluorescenza può fornire informazioni sulla qualità dei granuli di stress analizzati.
Una volta acquisita padronanza, la prova su cellule intere può essere eseguita in circa sei o sette ore, e l'analisi può essere completata in altre due o tre ore. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di processare sempre i campioni di controllo e sperimentali contemporaneamente e nelle stesse condizioni, per minimizzare la variabilità all'interno dei dati. Seguendo questa procedura, l'analisi può inoltre essere estesa a un volume tridimensionale per ottenere ulteriori informazioni sulla localizzazione dei granuli di stress.
Questa procedura semi-automatica consente un'analisi rigorosa e priva di bias dei granuli di stress in cellule non infette e infette. Può rivelare alterazioni precedentemente sconosciute del percorso dei granuli di stress. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come infettare le cellule con batteri, come indurre la formazione dei granuli di stress e come utilizzare un approccio semi-automatico per analizzare i granuli di stress in modo qualitativo e quantitativo.
E non dimenticare che Shigella flexneri e agenti induttori di granuli di stress come il clotrimazolo possono essere pericolosi, e che sono necessarie precauzioni come indossare guanti, lavorare in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BL2) e smaltire correttamente tutti i reagenti.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per analizzare la formazione di granuli di stress in cellule di mammifero in risposta a sfide batteriche e a diversi stress. Il protocollo è applicabile per studiare le risposte cellulari nelle interazioni ospite-batterio.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia cellulare
- Meccanismi di risposta allo stress
- Interazioni ospite-patogeno
Sfondo
- I granuli di stress sono aggregati citoplasmatici formati in risposta allo stress.
- Comprendere la loro formazione è fondamentale per ottenere informazioni sulle risposte cellulari allo stress.
- Le infezioni batteriche possono influenzare il percorso dei granuli di stress.
- Questo studio fornisce un metodo per analizzare quantitativamente questi effetti.
Scopo dello studio
- Valutare l'impatto delle infezioni batteriche sulla formazione dei granuli di stress.
- Determinare se i patogeni possano alterare la risposta dei granuli di stress.
- Fornire un metodo rigoroso per analizzare la dinamica dei granuli di stress.
Metodi Utilizzati
- Inoculazione di batteri S.flexneri M90T in un mezzo di coltura.
- Analisi qualitativa e quantitativa dei granuli di stress.
- Utilizzo di programmi gratuiti di analisi delle immagini per l'analisi dei dati.
- Valutazione della dinamica dei granuli di stress in risposta a sfide batteriche.
Risultati principali
- Il metodo consente l'analisi automatizzata della formazione dei granuli di stress.
- Offre informazioni su come specifici patogeni influenzano la dinamica dei granuli di stress.
- Dimostra l'utilità del protocollo nella ricerca di microbiologia cellulare.
- Fornisce un quadro di riferimento per futuri studi sulle interazioni ospite-patogeno.
Conclusioni
- Il protocollo è efficace per lo studio delle risposte ai granuli di stress nelle cellule mammifere.
- Migliora la comprensione della risposta cellulare alle infezioni batteriche.
- La ricerca futura potrà basarsi su questo metodo per esplorare diversi patogeni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
La valutazione delle alterazioni indotte da patogeni nella formazione dei granuli di stress dell'ospite fornisce un'analisi meccanicistica su come i batteri eludano le risposte cellulari allo stress, un aspetto fondamentale nella validazione di bersagli antimicrobici. L'imaging quantitativo della dinamica dei granuli di stress consente un confronto oggettivo tra condizioni infette e condizioni di controllo, sostenendo decisioni basate sui dati in merito a proseguire o meno nella fase iniziale della scoperta. Questo approccio contribuisce alla fiducia predittiva collegando le risposte fenotipiche allo stress ai meccanismi di virulenza del patogeno.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica se un patogeno possa alterare il percorso dei granuli di stress, fornendo informazioni per la selezione di bersagli in strategie anti-virulenza.
- Valore operativo: Consente una quantificazione standardizzata e automatizzata della formazione dei granuli di stress mediante strumenti open source per l'analisi delle immagini.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica rivelando come i patogeni modulino le risposte allo stress dell'ospite che potrebbero influenzare la segnalazione a valle.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi cellulari validati per lo screening di composti che modulano la formazione di granuli di stress nel contesto di un'infezione.
- Valore operativo: Utilizza parametri di rilevamento di spot (scala e sensibilità) per generare letture quantitative e riproducibili del numero e delle dimensioni dei granuli di stress.
- Prontezza del saggio: Permette un confronto ad alta affidabilità della dinamica dei granuli di stress tra diverse condizioni sperimentali, utilizzando metriche di intensità di fluorescenza e distribuzione di frequenza.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega i fenotipi dei granuli di stress in vitro alla loro potenziale rilevanza in vivo nelle interazioni ospite-patogeno.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Fornisce dati fenotipici per selezionare i composti in grado di ripristinare o modulare la formazione dei granuli di stress alterata dai patogeni.
- De-risking Meccanicistico: Si concentra sulla composizione e localizzazione dei granuli di stress come biomarcatori dell'integrità del percorso in condizioni di sfida infettiva.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in cui la formazione dei granuli di stress funge da lettura fenotipica della modulazione del percorso da parte di patogeni o di candidati terapeutici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo al possibile interferenza degli effettori batterici nell'assemblaggio o nel disassemblaggio dei granuli da stress.
- Screening: Fornisce output quantitativi (numero di granuli da stress, distribuzione dimensionale, intensità di fluorescenza) per la conferma dei risultati positivi e per studi sul rapporto struttura-attività.
- Analisi: Genera immagini binarie e grafici di distribuzione di frequenza che permettono il confronto statistico tra popolazioni di granuli da stress in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la dinamica dei granuli da stress a risposte cellulari più ampie allo stress, rilevanti nei modelli di malattia infettiva.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato e semi-automatico applicabile a diversi patogeni e agenti di stress nell'ambito dello screening antimicrobico mirato all'ospite.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce un livello predittivo di affidabilità nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità riguardo al modo in cui i patogeni influenzano le vie delle granule di stress dell'ospite.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso condizioni standardizzate di fissazione, permeabilizzazione, bloccaggio e acquisizione delle immagini per campioni di controllo e sperimentali.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo il rilevamento precoce di composti che modulano le vie prima degli investimenti costosi nella fase preclinica.
- Impatto sul portafoglio: Orienta la priorizzazione dei risultati positivi in base al rischio, identificando quelli che dimostrano il ripristino della formazione delle granule di stress nelle cellule infette.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura batterica, nell'infezione delle cellule mammifere e nell'etichettatura mediante immunofluorescenza.
- È dipendente dalla microscopia confocale a fluorescenza e da piattaforme open-source per l'analisi delle immagini (ad esempio, ICY) dotate di capacità di rilevamento di punti.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei parametri di acquisizione delle immagini (ingrandimento, impostazioni dei canali) e delle soglie di analisi (scala, sensibilità) per ciascun marcatore dei granuli da stress.
- Comporta la necessità di adattamenti quando si applica il metodo a diversi tipi cellulari, patogeni o induttori di stress diversi da Shigella flexneri e clotrimazolo.
- Presenta limitazioni pratiche, come la necessità di ottimizzare i parametri di rilevamento (scala, sensibilità) per ogni marcatore, poiché scale più elevate potrebbero non rilevare granuli più piccoli e un aumento della sensibilità potrebbe incrementare i falsi positivi.
