Analisi dell'immunofluorescenza della formazione di granuli di stress dopo la sfida batterica delle cellule dei mammiferi

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare gli effetti di un'infezione batterica sulla capacità delle cellule ospiti di formare granuli di stress in risposta allo stress esogeno. Questo metodo è uno strumento prezioso nel campo della microbiologia cellulare per valutare se un determinato patogeno è in grado di alterare o sovvertire l'intero percorso dei granuli di stress. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i granuli di stress possono essere analizzati qualitativamente e quantitativamente in modo rigoroso e automatizzato utilizzando programmi gratuiti di analisi delle immagini.

Questo metodo fornisce informazioni sulle dinamiche della formazione e della composizione dei granuli di stress e su come questi parametri sono influenzati da un patogeno specifico. Grazie. Prima di iniziare la sfida, inoculare una colonia di batteri rossi S.flexneri M90T da una piastra di agar di soia triptica 1% Congo in un tubo conico da 15 millilitri, contenente otto millilitri di brodo di soia triptico.

Dopo aver serrato il coperchio, incubare la colonia per una notte agitando a 222 giri/min e 30 gradi Celsius. Il giorno successivo, sottocoltura di 150 microlitri di batteri in otto millilitri di brodo di soia triptico fresco per circa due ore a 37 gradi Celsius e 222 giri/min per avviare un'induzione tardiva in fase esponenziale dell'espressione genica della virulenza e per migliorare l'infettività batterica. Quando la densità ottica della sottocoltura è compresa tra 0,6 e 0,9, trasferire un millilitro di batteri in una provetta da 1,5 millilitri per la loro raccolta mediante centrifugazione.

E risospendere il pellet nel mezzo di infezione a una densità ottica di uno. Quindi, aspirare i surnatanti da ciascun pozzetto di una coltura di vetrino coprioggetti di cellule HeLa. E lavare accuratamente le cellule HeLa con 500 microlitri di terreno cellulare HeLa fresco a temperatura ambiente per pozzetto.

Sostituire il lavaggio con 500 microlitri di terreno di infezione per pozzetto e centrifugare la piastra a 24 pozzetti per far girare i batteri sulle cellule. Trasferire le cocolture batteriche stabilizzate in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius per 30 minuti per facilitare l'infezione della cellula ospite. Al termine dell'incubazione, rimuovere i batteri esogeni dalle cellule con tre risciacqui in un millilitro di terreno di coltura HeLa fresco a 37 gradi Celsius per lavaggio.

Quindi coprire le cellule infette con un millilitro di terreno di coltura fresco contenente gentamicina e rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Al termine dell'incubazione, sostituire il terreno con 500 microlitri del terreno di coltura appropriato, integrato con il fattore di stress di interesse, e rimettere le cellule nell'incubatore di coltura tissutale. Dopo un'ora, aspirare completamente il surnatante e fissare i campioni in 0,5 millilitri di paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente in PBS per 30 minuti.

Successivamente, gettare il fissativo nell'apposito contenitore per rifiuti e lavare i vetrini coprioggetti con un millilitro di soluzione fisiologica tamponata per due minuti agitando delicatamente. Al termine del lavaggio, aspirare completamente il TBS e permeabilizzare le cellule in ogni pozzetto con 500 microlitri di Triton X-100 allo 0,3% in TBS. Dopo 10 minuti, sostituire la soluzione permeabilizzante con un millilitro di TBS, agitare delicatamente la piastra e sostituire il TBS con un millilitro di soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente.

Per etichettare le cellule con un cocktail di anticorpi primari di interesse, posizionare 50 microlitri della miscela di anticorpi primari per vetrino coprioggetti su un pezzo di Parafilm di plastica saldamente fissato con nastro adesivo sul piano del banco. Quindi usa le pinzette per raccogliere il primo vetrino coprioggetti. E tampona il bordo del vetrino coprioggetti su un pezzo di carta velina per rimuovere il liquido in eccesso.

Posizionare con cautela il vetrino coprioggetti sulla goccia e incubare i vetrini coprioggetti nelle condizioni di etichettatura appropriate. Al termine dell'incubazione della marcatura degli anticorpi primari, trasferire ciascun vetrino coprioggetti in un singolo pozzetto di una nuova piastra da 24 pozzetti contenente un millilitro di TBS per pozzetto e lavare le cellule a temperatura ambiente su uno shaker per cinque minuti tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le cellule su ciascun vetrino coprioggetti con l'apposito cocktail di anticorpi secondari, come appena dimostrato.

E incubare i vetrini coprioggetti al buio per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione della marcatura degli anticorpi secondari, lavare le cellule in un millilitro di PBS tre volte in una nuova piastra da 24 pozzetti agitando delicatamente come appena dimostrato, ma al riparo dalla luce. Dopo l'ultimo lavaggio, immergere brevemente ogni vetrino coprioggetti in acqua deionizzata per rimuovere il sale, tamponare i bordi del vetrino su un fazzoletto e montare con cura i vetrini coprioggetti su cinque microlitri di terreno di montaggio a fluorescenza per vetrino da microscopio senza bolle.

Quindi sigillare il vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie. E conservare i vetrini in modo appropriato fino all'imaging. Per visualizzare le cellule mediante microscopia confocale a fluorescenza, iniziare selezionando l'obiettivo appropriato e i canali fluorescenti appropriati per l'acquisizione dell'immagine.

Quindi acquisisci pile di immagini delle cellule, utilizzando l'apposito software di imaging. Quando tutte le immagini sono state acquisite, utilizzare il software di analisi delle immagini appropriato per comprimere le pile di immagini e salvare le pile come file TIFF. Quindi, caricare un controllo e un'immagine TIFF sperimentale sulla piattaforma di analisi delle immagini e selezionare Tabella di ricerca per aprire i parametri del canale nella finestra Sequenza.

Fare clic sulle caselle di controllo della scheda Tutti i canali per disattivare tutti i canali. Quindi fare clic sul canale zero e fare clic sulla barra del colore del canale zero per selezionare il colore preferito, aumentando l'intensità del canale secondo necessità per visualizzare tutte le strutture. Dopo aver selezionato e regolato ciascuno dei canali di colore appropriati per l'analisi sperimentale, selezionare la scheda Canvas e regolare la scheda Zoom per visualizzare circa 10 celle per campo di visualizzazione.

Utilizzando lo strumento poligono, fai clic sulla cella di interesse ed estendi la linea attorno alla cella per delineare il confine della cella. Per assegnare un nome a questa regione di interesse, nella finestra della regione di interesse, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cella di interesse e fare doppio clic sul nome della regione di interesse per modificarla. Dopo aver selezionato e nominato tutte le celle di interesse nello stesso modo, aprire l'applicazione Spot Detector all'interno della scheda di rilevamento e tracciamento.

Aprire la scheda Pre-elaborazione e selezionare il canale da analizzare. Nella scheda Rilevatore, selezionare Rileva punti luminosi su sfondo scuro e selezionare la scala e la sensibilità appropriate. Nella scheda Regione di interesse, selezionare la regione di interesse suggerita dalla sequenza.

Nella scheda Filtro selezionare NoFiltering. Nella scheda Output, selezionare l'output appropriato. Selezionate Rimuovi punti precedenti renderizzati come regioni di interesse e fate clic su nessun file selezionato per selezionare la cartella in cui salvare il file.

Quindi, nella scheda Visualizza, selezionare le opzioni di interesse appropriate e fare clic su Avvia rilevamento. All'interno del software di analisi delle immagini, il rilevatore di punti può essere utilizzato per identificare i granuli di stress all'interno di ciascuna delle regioni di interesse designate. È quindi possibile generare un'immagine binaria per visualizzare tutti i granuli di stress identificati.

L'analisi dei granuli di stress deve essere attentamente adattata a ciascun mercato dei granuli di stress analizzato. Ad esempio, la modifica del requisito di dimensione della regione di interesse rilevata o la modifica della sensibilità dei parametri di rilevamento portano a risultati variabili. A scale di dimensioni dei pixel più elevate, i granuli di stress più piccoli non verranno conteggiati e il numero di granuli di stress diminuirà.

Mentre l'aumento della sensibilità si traduce in un aumento del numero di granuli di stress. Ad esempio, in questo esperimento, una scala di due con una sensibilità di 100 ha dato il miglior risultato dal marcatore di granuli di stress G3BP1. Mentre una scala di due con una sensibilità di 55 ha dato il miglior risultato per il marcatore di granuli di stress EIF3B.

L'area superficiale può quindi essere calcolata dalla dimensione dei granuli di stress. I grafici di distribuzione della frequenza sono utili per evidenziare i cambiamenti nelle dimensioni dei granuli di stress tra diverse popolazioni cellulari. Inoltre, l'intensità della fluorescenza può fornire informazioni sulla qualità dei granuli di stress analizzati.

Una volta padroneggiata, la sfida dell'intera cellula può essere eseguita in circa sei-sette ore e l'analisi può essere completata in altre due o tre ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di elaborare sempre il campione di controllo e quello sperimentale nello stesso momento e nelle stesse condizioni per ridurre al minimo la variabilità all'interno dei dati. Seguendo questa procedura, l'analisi può anche essere estesa a un volume tridimensionale per ottenere ulteriori informazioni sulla localizzazione dei granuli di stress.

Questa procedura semi-automatizzata consente un'analisi rigorosa e imparziale dei granuli di stress in cellule non infette e infette. Può rivelare sovversioni precedentemente sconosciute della via dei granuli di stress. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come infettare le cellule con i batteri, come indurre la formazione di granuli di stress e come utilizzare un approccio semi-automatizzato per analizzare i granuli di stress in modo qualitativo e quantitativo.

E non dimenticare che con Shigella flexneri e agenti che inducono granuli di stress come il clotrimazolo possono essere pericolosi e che sono necessarie precauzioni come indossare guanti, lavorare in un laboratorio BL2 e scartare correttamente tutti i reagenti.