Name: La combinazione di doppio Fluorescenza In Situ Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri come rilevare tre geni contemporaneamente in sezioni cerebrali di topo combinando doppia FISH con immunolabeling. Questo metodo consente di mappare l'espressione genica su tipi cellulari specifici senza richiedere anticorpi per tutti i target.

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Il lavoro nei laboratori degli autori è stato supportato dal Consiglio di Ricerca sulle Biotecnologie e Scienze Biologiche del Regno Unito (BB/J006602/1 e BB/L003236/1), dal Wellcome Trust (WT100269MA) e dal Consiglio Europeo della Ricerca (ERC, Programma "Idee" 293544). SJ è stato supportato da una borsa di studio a lungo termine EMBO. Gli autori ringraziano Stephen Grant per la sua assistenza tecnica.

Etica Dichiarazione: allevamento e la gestione del mouse sono in conformità alla normativa del Regno Unito del Ministero degli e le linee guida del Comitato Etico UCL, rispettando gli animali (procedure scientifiche) Act 1986 del Regno Unito e la sua modifica Regolamento 2012. NOTA: Tutte le soluzioni devono essere effettuate con dietilpirocarbonato (DEPC) - acqua trattata a distruggere ogni residuo RNasi. Per il trattamento DEPC, aggiungere DEPC (1 ml per litro), agitare energicamente fino a quando tutti i globuli DEPC sono scomparsi poi in autoclave a degradare il DEPC. 1. RNA Probe Synthesis <ol><li> ATTENZIONE: Quando si maneggia formammide, indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) e utilizzare una cappa di sicurezza. Preparare tampone di ibridazione: trattata con DEPC acqua deionizzata con il 50% (v / v) formammide deionizzata, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH 2 PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml tRNA di lievito, 1 × soluti di Denhardt, e 10% w / v destrano solfato. </li><li> Scegliere un clone di DNA che contiene la sequenza di cDNA del gene di interesse in un plasmide con i promotori RNA polimerasi. Per questo esempio, utilizzare un clone pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), con T7 e promotori polimerasi RNA Sp6 per Aspa (Figura supplementare 1). </li><li> Preparare DNA plasmide linearizzato come modello. <ol><li> Grow il clone DNA, estrarre il plasmide con una piccola scala kit di purificazione plasmide secondo il protocollo del produttore e sequenza con il T7 e SP6 primers universali. </li><li> Digest 1.020 mg DNA plasmide con un enzima di restrizione che taglia all&#39;estremità 5 &#39;del filamento senso del cDNA. Per questo esempio, utilizzare il 100 unità Sai I a digerire il plasmide pCMV-SPORT6- Aspa. Incubare per 1,5 ore a 37 ° C. </li><li> Eseguire una piccola aliquota su gel di agarosio per verificare che il plasmide è completamente linearizzata. </li></ol></li><li> purificare ilplasmide linearizzate con fenolo-cloroformio. <ol><li> Aggiungere 1/10 volume di 3 M acetato di sodio, un volume di 10 mM Tris HCl (pH 8,0) - fenolo equilibrato e un volume di cloroformio / alcool isoamilico (IAA) (24: 1). </li><li> Centrifugare a 16.000 xg per 1 min a RT (20 - 25 ° C, RT) ed estrarre fase acquosa superiore. </li><li> Aggiungere un volume di cloroformio / IAA, centrifugare a 16.000 xg per 1 min e estrarre fase acquosa superiore. </li><li> Ripetere il punto 1.4.3. </li><li> Aggiungere 2 volumi di etanolo e lasciare a -20 ° C per 1 ora o O / N. </li><li> Centrifugare a 16.000 xga 4 ° C per 10 min. Eliminare il surnatante. </li><li> Lavare il pellet con il 70% di etanolo freddo e risospendere in approssimativamente 1 mg cDNA per 2,5 microlitri di TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5). </li></ol></li><li> Sintetizzare le due sonde, uno marcato con digossigenina (DIG) e l&#39;altra con isotiocianato di fluoresceina (FITC). <ol><li> Selezionare la RNA polimerasi appropriata per rendere l&#39;anti-seSonda NSE (complementare al bersaglio mRNA). Per questo esempio, utilizzare T7 RNA polimerasi a fare sonda Aspa. </li><li> Preparare in vitro reazione di trascrizione: aggiungere 1 mg di DNA linearizzato, 4,0 ml 5 x buffer di trascrizione, 6.0 ml di 100 mM DTT, 2,0 ml di 10x DIG o FITC RNA etichettatura miscela contenente dNTP, 1 inibitore della RNasi ml, e 20 - 40 unità di RNA polimerasi; rendere il volume finale a 20 microlitri con acqua trattata con DEPC. </li><li> Incubare a 37 ° C per 1,5 ore. </li></ol></li><li> microlitri Run1 della reazione di trascrizione su un gel di agarosio 1,0% per verificare che la reazione ha lavorato. Il gel dovrebbe mostrare il modello lineare e una banda luminosa della sonda. </li><li> Portare al volume di 100 ml con tampone di ibridazione e di memorizzare 10 aliquote microlitri a -80 ° C. </li></ol> 2. Perfusione, Fissazione e tessuto Collection <ol><li> ATTENZIONE: Quando si maneggia paraformaldeide (PFA), sia solido eacquosa, indossare DPI e utilizzare una cappa di sicurezza. Preparare la soluzione di formaldeide sciogliendo 4% (w / v) di PFA in 1x tampone fosfato salino (PBS) utilizzando il calore (55 ° C). Filtrare la soluzione di formaldeide con carta da filtro. </li><li> Preparare la soluzione di saccarosio sciogliendo 20% (w / v) di saccarosio in acqua distillata e aggiungere 0,1% (v / v) DEPC. Lascia O / N a temperatura ambiente con un coperchio sciolto e poi in autoclave. </li><li> Terminally anaesthetize un topo mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbitone (50 mg / kg). Valutare la profondità dell&#39;anestesia per pizzico punta e l&#39;assenza di recesso riflesso indica anestesia profonda. </li><li> Una volta che il mouse è sotto anestesia profonda, fare un&#39;incisione sotto la gabbia toracica e tagliare la gabbia toracica su entrambi i lati, sollevarlo per esporre il cuore. </li><li> Inserire un ago da 25 G nel ventricolo sinistro del cuore. Fai una piccola incisione nell&#39;atrio destro del cuore. </li><li> Profumato l&#39;animale con 20 ml di PBS e quindi 40 ml di soluzione di formaldeide. Per P30 e anzianitopi, utilizzare un tasso di perfusione di 12 ml / min, ma per gli animali giovani utilizzano un tasso inferiore (7 - 10 ml / min). </li><li> Sezionare il cervello. <ol><li> Sever la testa del mouse con le forbici chirurgiche facendo una posteriore tagliata dalle orecchie. Effettuare una incisione mediana caudale nella pelle e lavorare rostralmente per rimuovere la pelle dal cranio. </li><li> Partendo dalla parte caudale, tagliare la parte superiore del cranio lungo la linea mediana e tra gli occhi con le forbici Iris. Rimuovere parietale e placche ossee frontali inclinando un lato di una piastra ossea ogni volta e facendo scattare via con pinzette. </li><li> inclinare leggermente il cervello verso l&#39;alto dalla parte anteriore con una pinzetta e tagliare i nervi ottici e di altri nervi cranici. Sollevare delicatamente il cervello fuori dal cranio. </li></ol></li><li> Mettere il cervello in una matrice cervello coronale del mouse. Tagliare il cervello in 3 circa 4 pezzi mm con una lama di rasoio piuma. </li><li> Trasferire le fettine in soluzione al 4% PFA e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Trasferimento del cervellofette di DEPC-trattati del 20% soluzione di saccarosio e incubare O / N a 4 ° C </li><li> Mettere ogni fetta cervello in un cryomould secca, circondare con la temperatura di taglio ottimale (OCT) di medie e congelare in ghiaccio secco. Conservare a -80 ° C. </li></ol> 3. criosezionamento <ol><li> Tagliare 15 sezioni micron di tessuto congelato in un criostato e raccogliere le sezioni su vetrini da microscopio. Se necessario, bagnare le sezioni con DEPC trattati con PBS e appiattire con un pennello fine. </li><li> Lasciare le diapositive asciugare per circa 1 ora a garantire che il tessuto aderisce alla slitta. </li></ol> 4. ibridazione <ol><li> Preparare 65 ° C tampone di lavaggio: 150 mM NaCl, 15 mM Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1x salina di sodio citrato), 50% (v / v) formammide e 0,1% (v / v) Tween- 20. </li><li> Preparare MABT buffer: 100 mM di acido maleico, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Tween-20, pH 7,5. </li><li> Diluire le due sonde (DIG-etichettati e FITC-Labelled) 1 / 1.000 in tampone di ibridazione pre-riscaldato a 65 ° C e mescolare bene. </li><li> Applicare circa 300 ml di miscela di ibridazione su ogni diapositiva, coverslipwith (C 200 o) coprioggetto da forno e incubare O / N a 65 ° C in una camera umidificata. </li><li> Trasferire i vetrini in una vaschetta Coplin contenente tampone di lavaggio pre-riscaldato. Lavare i vetrini per 30 minuti due volte a 65 ° C con tampone di lavaggio. </li><li> Lavare i vetrini per 10 minuti tre volte con MABT a temperatura ambiente. </li></ol> 5. Visualizzazione del FITC Probe <ol><li> Preparare tampone di bloccaggio ISH: MABT con il 2% di bloccaggio del reagente e il 10% di siero di pecora inattivato al calore. </li><li> Opzionale: utilizzare una penna idrofobico per disegnare cerchi intorno sezioni di tessuto sul vetrino per ridurre il volume di soluzioni anticorpi necessari. </li><li> Incubare i vetrini per 1 ora a RT con ISH tampone di bloccaggio in una camera umidificata. </li><li> Incubare la vetrini O / N a 4 ° C con perossidasi di rafano (POD) - coniugatod anticorpo anti-FITC diluito 1/500 (v / v) in tampone bloccante ISH. </li><li> Porre i vetrini in una vaschetta Coplin contenente PBS con 0,1% (v / v) Tween-20 (PBST). Lavare 3 volte per 10 min in PBST e sostituirlo con PBST fresco ogni volta. </li><li> Immediatamente prima dell&#39;uso, preparare il tiramide fluorescente diluendo 100 volte nel diluente di amplificazione. Per questo esempio, utilizzare FITC-tiramide. </li><li> Aggiungere questo per le diapositive e lasciare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Porre i vetrini in una vaschetta Coplin e lavare 3 volte in PBST per 10 min. </li></ol> 6. Visualizzazione della DIG Probe <ol><li> Preparare 0.1 M Tris- HCl pH 8,2. </li><li> Incubare i vetrini con tampone ISH di blocco per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare la vetrini O / N a 4 ° C con una fosfatasi alcalina (AP) coniugata anticorpo anti-DIG diluito 1 / 1.500 (v / v) in tampone bloccante ISH. </li><li> Lavare con MABT per 10 minuti tre volte. </li><li> Lavare due volte con 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 per 5 minuti a RT. </li><li>Immediatamente prima dell&#39;uso, preparare la soluzione Red veloce sciogliendo le tavolette in 0.1 M Tris pH 8,2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron. </li><li> Incubare i campioni a 37 ° C con una soluzione Fast Red in una camera umidificata. Poiché il tempo per lo sviluppo ottimale varia, controlla le diapositive regolarmente con un microscopio a fluorescenza per monitorare la formazione di precipitato. Per questo esempio, arrestare la reazione dopo 2 - 3 ore. </li><li> Lavare con PBST per 10 minuti tre volte. </li></ol> 7. immunoistochimica <ol><li> Preparare IHC tampone bloccante: 10% (v / v) di siero (di una specie diversa per ospitare anticorpo primario) in PBST. </li><li> Incubare i vetrini con IHC tampone bloccante per 1 ora a RT in una camera umidificata. </li><li> Preparare l&#39;anticorpo primario: diluire l&#39;anticorpo primario ad una diluizione appropriata in PBST con 5% di siero (di una specie diversa per ospitare anticorpo primario). Per questo esempio, utilizzare un anticorpo di coniglio anti-Olig2 a 1/400 (v / v) di diluizione. </li><li>Incubare la soluzione di anticorpo primario a 4 ° CO / N. </li><li> Lavare con PBST per 10 minuti tre volte. </li><li> Preparare anticorpo secondario: diluire un anticorpo secondario fluoroforo coniugato ad una diluizione appropriata in PBST con il 5% (v / v) di siero (di una specie diversa per ospitare anticorpo primario) e 0,1% (v / v) Hoechst 33258. Per questo esempio , utilizzare un asino anti-coniglio Alexa647 anticorpo secondario a 1 / 1.000 (v / v) di diluizione. </li><li> Incubare la soluzione di anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare con PBST per 10 minuti tre volte. </li></ol> 8. Montaggio <ol><li> Parzialmente asciugare le diapositive a temperatura ambiente, e montare con un mezzo di montaggio a fluorescenza. Lasciare le diapositive asciugare e poi l&#39;immagine in un microscopio confocale sotto 10X, 20X e 63X obiettivi utilizzando 4 canali diversi con le seguenti lunghezze d&#39;onda di eccitazione: 570 nm per Fast Red, 488 nm per FITC, 647 nm per Olig2 immunolabelling e 350 nm per la Hoechst . </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo prevede una procedura passo-passo per un doppio RNA ibridazione in situ seguito da immunocolorazione. Abbiamo usato questo protocollo per confermare che Aspa è espresso in oligodendrociti maturi in diverse aree del cervello. Questa procedura multi-step ha molti potenziali insidie ​​che possono influenzare la sensibilità e dovrebbero essere evitati. In primo luogo, tutte le soluzioni e buffer di memorizzazione per la reazione di trascrizione devono essere-R...

cellule gliali, che sono le cellule più abbondanti nel sistema nervoso centrale (CNS), comprendono oligodendrociti (cellule mielinizzanti di CNS), oligodendrociti precursori (PO, noto anche come &quot;cellule NG2&quot;), astrociti e microglia. Vi è un crescente interesse per le funzioni delle cellule gliali e dei loro ruoli potenziali nelle malattie neurologiche 1. Ad esempio, malattia di Canavan (CD) è una malattia neurodegenerativa ereditaria di partenza nella prima infanzia con leucodistrofia spongiforme e una progressiva perdita di neuroni, che porta alla morte di solito prima dei 10 anni di età 2,3. Le mutazioni nel gene Aspartoacyclase (ASPA), che portano a ridurre drasticamente l&#39;attività ASPA 4 nel CD sono stati identificati. ASPA è un enzima che catalizza la deacetilazione di N-acetilaspartato (NAA), una molecola altamente concentrata nel cervello, acetato di generazione e aspartato 5-7. Molti pazienti CD mostrano livelli più elevati di NAA causa della mancanza di ASPA actività. Alcuni studi ipotizzano che l&#39;acetato NAA-derivato potrebbe essere una delle principali fonti di acidi grassi / lipidi nel cervello durante lo sviluppo e CD può derivare da una diminuzione sintesi della mielina durante lo sviluppo causata dal fallimento di NAA essere ripartiti 3,5,6. ASPA si trova soprattutto nel rene, fegato e materia bianca del cervello, e dato il ruolo importante ASPA in CD, l&#39;espressione cellulare di questo enzima nel cervello è stato studiato da molti laboratori. Osservando ASPA attività enzimatica nel cervello, studi precedenti hanno trovato che l&#39;aumento dell&#39;attività ASPA durante lo sviluppo cerebrale parallelo l&#39;andamento temporale della myelination 8-10. A livello cellulare, saggi di attività enzimatica e ibridazione in situ (ISH) e immunoistochimica (IHC) analisi suggeriscono che ASPA è espresso principalmente in oligodendrociti nel cervello, ma non nei neuroni o astrociti 11-16. Alcuni studi hanno trovato che ASPA potrebbe ancheessere espresso in microglia nel sistema nervoso centrale 12,14. i dati finora su espressione ASPA OPS sono limitati. Secondo un recente studio in cui trascrittomi di diversi tipi di cellule nel topo corteccia cerebrale compresi i neuroni, astrociti, PO, oligodendrociti di nuova formazione, oligodendrociti mielinizzanti, microglia, cellule endoteliali e periciti sono stati analizzati da RNA sequenziamento 17, ASPA è espresso esclusivamente in oligodendrociti , in particolare nel mielinizzanti oligodendrociti (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Nonostante questi studi sulla ASPA modello di espressione nel cervello, una serie di incertezze rimangono. Diverse tecniche possono essere utilizzati per studiare gli schemi di espressione genica. IHC è un metodo comunemente utilizzato per rilevare il prodotto funzionale (cioè, proteine) dell&#39;espressione genica in sezioni di tessuto. Nonostante la sua grande utilità, questa tecnica ha limitazioni sua applicazione e specificità sono soggetti to la disponibilità e specificità dell&#39;anticorpo necessaria. In confronto, ISH ha il vantaggio di essere in grado di rivelare l&#39;espressione di un gene a livello di mRNA. Tuttavia, può essere tecnicamente difficile utilizzare più sonde contemporaneamente per localizzare una espressione genica di specifici tipi di cellule. In questo articolo, si descrive un protocollo che combina doppia RNA fluorescente in situ con fluorescenza ibridazione immunolabelling di una proteina. Abbiamo utilizzato questo insieme di tecniche per esaminare il pattern di espressione di Aspa in cervello di topo. Questo metodo permette la preciso studio dell&#39;espressione genica mediante microscopia confocale.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Formamide deionizzata</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>per tampone bloccante ISH</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico anidro</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico diidrato</td><td>Sigma</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Lievito tRNA</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x Soluzione di Denhardt</td><td>Life Technologies</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Destrano solfato</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Aspa cDNA clone</td><td>Fonte Bioscience</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo equilibrato</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isoamilico</td><td>Aldrich</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR International</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimerasi</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di trascrizione</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG Miscela NTP</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasina</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Fisher scientifico</td><td>005479470</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>Dietilpirocarbonato</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>Ago calibro 25</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Cole-Parmer Instrument Co., Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per iride</td><td>Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>No.2 pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Coronal Brain Matrix</td><td>World Precision Instruments</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Personna Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Tissue tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Criostato/microtomo</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus vetrini</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>per 65 gradi; C tampone di lavaggio</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloccante</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Siero di pecora inattivato termicamente</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Penna idrofobica</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&alpha;-FITC Anticorpo coniugato POD</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&trade; Plus Sistema di fluoresceina</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1.500</td></tr><tr><td>&alfa;-DIG AP-coniugato</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Compresse rosse veloci</td><td>Roche</td><td>11496549001.22</td><td></td></tr> <tr><td>&; Filtro M</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Olig2 Formica di coniglio</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 647-coniugato &alpha;-coniglio anticorpo</td><td>Life technologies</td><td>A-31573</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 confocale microscopio</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la combinazione di doppio fluorescenza<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione con immunolabelling per il rilevamento della manifestazione di tre geni nel cervello di topo sezioni

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Rilevazione di espressione genica in diversi tipi di cellule cerebrali ad esempio, i neuroni, astrociti, oligodendrociti, precursori degli oligodendrociti e microglia, può essere ostacolato dalla mancanza di specifici anticorpi primari o secondari per immunocolorazione. Qui si descrive un protocollo per rilevare l&#39;espressione di tre diversi geni nella stessa sezione del cervello utilizzando doppia ibridazione in situ fluorescente con due sonde gene-specifici seguiti da immunocolorazione con un anticorpo di alta specificità diretto contro la proteina codificata da un terzo gene. Il gene Aspartoacyclase (ASPA), mutazioni che possono portare a una malattia della sostanza bianca umana rara - malattia di Canavan - è pensato per essere espresso in oligodendrociti e microglia ma non in astrociti e neuroni. Tuttavia, deve ancora essere stabilito il pattern di espressione precisa ASPA nel cervello. Questo protocollo ha permesso di stabilire che ASPA è espresso in un sottogruppo di oligodendrociti maturi unnd può essere generalmente applicata a una vasta gamma di studi pattern di espressione genica.

Questo articolo descrive un metodo per un ISH doppia fluorescenza seguita da immunolabelling in sezioni cervello di topo. Una breve descrizione di questo protocollo è mostrato in Figura 1. Il primo passo è stato quello di sintetizzare sonde specifiche per Aspa e Mbp (proteina basica della mielina). Per controllare che le sonde erano sintetizzati, una piccola aliquota di ciascuna reazione è stata eseguita su gel di agarosio. Il modello lineare debole e u...

Localizzare l'espressione genica in specifici tipi di cellule può essere difficile a causa della mancanza di anticorpi specifici. Qui descriviamo un protocollo per la tripla rilevazione simultanea dell'espressione genica combinando l'ibridazione in situ a doppia fluorescenza con l'immunocolorazione.

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è rilevare simultaneamente l'espressione di tre geni diversi in sezioni cerebrali, utilizzando ibridazione in situ a doppia fluorescenza seguita da immunomarcatura. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, come ad esempio: quale tipo cellulare esprime il mio gene di interesse? Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è necessario disporre di un buon anticorpo specifico per il gene di interesse al fine di localizzarne l'espressione in un particolare tipo cellulare.Per riassumere questa procedura, il primo giorno vengono tagliate sezioni di tessuto fissato e ibridate con due sonde RNA marcate in modo diverso per tutta la notte. Il secondo giorno, le sezioni vengono incubate per tutta la notte con un anticorpo diretto contro la sonda marcata con FITC. Questo anticorpo è coniugato con la perossidasi di rafano, che catalizza l'aggiunta di una tiaramide fluorescente il terzo giorno.Successivamente, viene utilizzato un anticorpo coniugato con fosfatasi alcalina per riconoscere la sonda etichettata con DIG. Al quarto giorno, questo enzima catalizza la formazione di un precipitato fluorescente quando è incubato con la soluzione Fast Red. Successivamente, i campioni sono incubati tutta la notte con un anticorpo primario diretto contro una proteina di interesse.Infine, al quinto giorno, questa proteina viene visualizzata mediante un anticorpo secondario coniugato a un fluorocromo. Per iniziare questa procedura, selezionare un clone di DNA che contenga la sequenza di cDNA del gene di interesse in un plasmide dotato di promotori per la RNA polimerasi. Successivamente, coltivare il clone di DNA, estrarre il plasmide utilizzando un kit di purificazione di piccole quantità di plasmide e sequenziarlo con primer universali T7 e SP6.Digerire da 10 a 20 microgrammi di DNA plasmidico con un enzima di restrizione che taglia all'estremità cinque prime del filamento senso del cDNA. Incubare per 1,5 ore a 37 gradi Celsius. Quindi eseguire un'aliquote su un gel di agarosio per verificare che il plasmide sia completamente linearizzato.Per purificare il plasmide linearizzato, aggiungere 1/10 del volume di acetato di sodio tre molar, un volume di fenolo equilibrato con Tris-HCl 10 millimolare e un volume di cloroformo alcol isoamilico. Centrifugare a 16.000 G per un minuto a temperatura ambiente ed estrarre la fase acquosa superiore. Quindi aggiungere un volume di cloroformo IAA.Centrifugare a 16.000 G per un minuto ed estrarre la fase acquosa superiore. Ripetere questo passaggio un'altra volta. Successivamente, aggiungere due volumi di etanolo e mantenere a meno 20 gradi Celsius per un'ora o durante la notte.Successivamente, centrifugare a 16.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il soprannuato e lavare il pellet con etanolo freddo al 70%. Quindi, risospendere il pellet in TE a una concentrazione di un microgrammo di cDNA ogni 2,5 microlitri.Per sintetizzare le due sonde, selezionare innanzitutto la RNA polimerasi appropriata. Successivamente, preparare la reazione di trascrizione in vitro ed aggiungere acqua trattata con DEPC fino ad ottenere un volume finale di 20 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per 1,5 ore.Successivamente, eseguire un microlitro della reazione di trascrizione su un gel di agarosio all'1% per verificare se la reazione ha avuto successo. Il gel dovrebbe mostrare il template lineare e una banda intensa della sonda. In questa procedura, tagliare sezioni di tessuto congelato di 15 micrometri di spessore in un criostato.Posizionare i campioni sui vetrini del microscopio e lasciare asciugare i vetrini per un'ora per garantire l'adesione dei tessuti. Il fattore più importante per il buon esito di questa procedura è la qualità dei campioni, che dipende in parte da un tessuto ben perfuso e fissato e in parte dalla tecnica di sezionamento, necessaria per ottenere sezioni piane e prive di contaminazione da RNasi.Quindi, diluire le due sonde in tampone di ibridazione preriscaldato a 65 gradi Celsius e mescolare accuratamente. Applicare 300 microlitri di miscela di ibridazione su ogni vetrino e coprire con un'immersione preriscaldata in forno. Successivamente, incubare i vetrini tutta la notte a 65 gradi Celsius in una camera umidificata.Il giorno successivo, trasferire i vetrini in un barattolo Coplin contenente tampone di lavaggio preriscaldato e lavare i vetrini per 30 minuti, due volte, a 65 gradi Celsius. Successivamente, lavare i vetrini per 10 minuti, tre volte, con soluzione di lavaggio MABT a temperatura ambiente. In questo passaggio, utilizzare una penna idrofoba per tracciare cerchi intorno alle sezioni di tessuto.Quindi, incubare i vetrini per un'ora a temperatura ambiente con il buffer bloccante ISH in una camera umidificata. Successivamente, incubare i vetrini tutta la notte a 4 gradi Celsius con un anticorpo anti-FITC coniugato con perossidasi di rafano. Poi, posizionare i vetrini in un barattolo Coplin contenente PBST.Lavarli in PBST tre volte per 10 minuti ciascuna, sostituendo ogni volta con PBST fresco. Successivamente, aggiungere il tiromide fluorescente sui vetrini e lasciarli per 10 minuti a temperatura ambiente. Porre i vetrini in un barattolo Coplin e lavarli in PBST per 10 minuti, ripetendo l'operazione tre volte.Successivamente, incubare i vetrini con il buffer di bloccaggio ISH per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, incubare i vetrini tutta la notte a quattro gradi Celsius con un anticorpo anti-dig coniugato con fosfatasi alcalina. Successivamente, lavarli tre volte con MABT per 10 minuti ogni volta.Successivamente, lavare i vetrini due volte con tris HCl 0,1 M a pH 8,2 per cinque minuti a temperatura ambiente. Filtrare la soluzione di fast red e incubare i vetrini a 37 gradi Celsius con la soluzione di fast red in una camera umidificata. Poiché il tempo ottimale di sviluppo può variare, controllare regolarmente i vetrini al microscopio fluorescente per monitorare la formazione del precipitato.Quindi, lavarli tre volte con PBST per 10 minuti ogni volta. Per eseguire l'immunohistochimica, incubare i vetrini con il buffer di bloccaggio per IHC per un'ora a temperatura ambiente in una camera umidificata. Successivamente, incubare i vetrini nella soluzione di anticorpo primario a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, lavare i vetrini con PBST per 10 minuti, tre volte. Incubarli nella soluzione di anticorpo secondario a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, lavarli con PBST tre volte, per 10 minuti ciascuna.Successivamente, asciugare parzialmente i vetrini a temperatura ambiente e montarli con un mezzo di montaggio fluorescente. Lasciare i vetrini asciugare prima di acquisirli al microscopio confocale. Qui sono mostrate le immagini rappresentative di ISH per Aspa e Mbp, seguite da immunomarcatura per OLIG2 combinata con la marcatura con l'uncino.Aspa è stato espresso in alcune cellule MBP-positive OLIG2-positive nella corteccia e nel corpo calloso. Alcune cellule Mbp-positive OLIG2-positive non esprimono Aspa. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere libere da contaminazioni da RNasi le sezioni e tutte le soluzioni.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare i modelli di espressione genica mediante N-citrine inhibization e immunohistochemia. Questa tecnica può essere adattata per una varietà di tessuti di diverse origini e stadi di sviluppo.

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Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

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La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinazione di ibridazione a doppia fluorescenza  in situ con immunomarcatura per il rilevamento dell'espressione di tre geni in sezioni cerebrali di topo. J. Vis. Exp. (2016). Questo video dimostra l'uso dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per visualizzare l'espressione di due bersagli di RNA in sezioni cerebrali di topo. Il protocollo prevede il rilevamento sequenziale dell'RNA utilizzando sonde marcate con isotiocianato di fluoresceina e digossigenina,...

 Esecuzione dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per rilevare l'espressione genica nelle sezioni cerebrali di topo

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Immunocolorazione dei neuroni in fette di cervello di topo dopo ibridazione in situ a fluorescenza

Questo protocollo di livello introduttivo descrive i reagenti, le attrezzature e le tecniche necessarie per completare la colorazione immunoistochimica del cervello dei roditori, utilizzando come esempio marcatori per microglia ed elementi neuronali.

Primer per immunoistochimica su Cryosectioned Rat tessuto cerebrale: Esempio colorazione per Microglia e neuroni

Descriviamo una procedura multi-target cromogenico tutto il montaggio di ibridazione in situ (MC-WISH) in embrioni di Drosophila intatte che permettono il rilevamento simultaneo e specifico di tre diversi modelli di distribuzione mRNA da contrastanti precipitati di colore.

Multi-bersaglio Cromogenico Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione per il confronto Gene domini di espressione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro passo-passo per la costaintura immunofluorescente di IBA1 e TMEM119, oltre all'analisi della densità microgliale, della distribuzione e della morfologia, nonché dell'infiltrazione delle cellule mieloidi periferiche nel tessuto cerebrale del topo.

Immunofluorescenza Colorazione utilizzando IBA1 e TMEM119 per densità microgliale, morfologia e infiltrazione delle cellule mieloidi periferiche nel cervello del mouse

Questo protocollo descrive un metodo per combinare l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) e l'immunoistochimica a fluorescenza (IHC) in sezioni cerebrali di topo sia fresche congelate che fisse, con l'obiettivo di ottenere FISH multimarca e segnale IHC di fluorescenza. IHC ha preso di mira le proteine citoplasmatiche e attaccate alla membrana.

Combinazione dell'ibridazione in situ a fluorescenza multiplex con immunoistochimica fluorescente su sezioni cerebrali di topo fresche, congelate o fisse

La capacità di marcare in modo permanente le cellule staminali e la loro progenie con un fluoroforo utilizzando una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza.

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

L'ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione (EASI-FISH) è una tecnica robusta che combina la microscopia ad espansione con l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) per rilevare l'espressione di più geni nei tessuti spessi. Questo protocollo delinea i recenti progressi nel metodo e il suo adattamento per l'etichettatura del sistema nervoso centrale della Drosophila intatta.

Rilevamento multiplex dell'espressione genica nel cervello intatto di Drosophila mediante ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione

Scopri come rilevare tre geni contemporaneamente in sezioni cerebrali di topo combinando doppia FISH con immunolabeling. Questo metodo consente di mappare l'espressione genica su tipi cellulari specifici senza richiedere anticorpi per tutti i target.

La combinazione di doppio Fluorescenza In Situ Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni (Video) | JoVE Journal

La combinazione di doppio Fluorescenza

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