La combinazione di doppio Fluorescenza In Situ Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di rilevare simultaneamente l'espressione di tre diversi geni in sezioni cerebrali, utilizzando l'ibridazione in situ a doppia fluorescenza seguita da immunocolorazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, ad esempio quale tipo di cellula esprime il mio gene di interesse? Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è necessario un buon anticorpo per il gene di interesse per essere in grado di localizzare la sua espressione in un tipo di cellula specifico.

Per riassumere questa procedura, il primo giorno, sezioni di tessuto fissate vengono tagliate e ibridate con due sonde di RNA marcate in modo diverso durante la notte. Il secondo giorno, le sezioni vengono incubate per una notte con un anticorpo mirato alla sonda marcata FITC. Questo anticorpo è coniugato con perossidasi di rafano, che catalizza l'aggiunta di una tiramide fluorescente il terzo giorno.

Quindi, viene utilizzato un anticorpo coniugato con fosfatasi alcalina per colpire la sonda marcata con DIG. Il quarto giorno, questo enzima catalizza la formazione di precipitato fluorescente quando incubato con la soluzione Fast Red. Quindi le sezioni vengono incubate durante la notte con un anticorpo primario mirato a una proteina di interesse.

Infine, il quinto giorno, questa proteina viene visualizzata con un anticorpo secondario coniugato con fluoroforo. Per iniziare questa procedura, scegli un clone di DNA che contenga la sequenza di cDNA del gene di interesse in un plasmide con promotori della RNA polimerasi. Successivamente, coltiva il clone di DNA, estrai il plasmide con un kit di purificazione del plasmide su piccola scala e sequenzialo con un primer universale T7 e SP6.

Digerire da 10 a 20 microgrammi di DNA plasmidico con un enzima di restrizione che taglia le cinque estremità primarie del filamento di senso del cDNA. Incubarlo per 1,5 ore a 37 gradi Celsius. Quindi eseguire una piccola aliquota su un gel di agarosio per verificare che il plasmide sia completamente linearizzato.

Per purificare il plasmide linearizzato, aggiungere 1/10 del volume di tre molari di acetato di sodio, un volume di 10 millimolari di Tris-HCl fenolo equilabrato e un volume di alcol isoamilico cloroformio. Centrifugare a 16.000 Gs per un minuto a temperatura ambiente ed estrarre la fase acquosa superiore. Quindi aggiungere un volume di cloroformio IAA.

Centrifugare a 16.000 g per un minuto ed estrarre la fase acquosa superiore. Ripetere nuovamente questo passaggio. Quindi, aggiungi due volumi di etanolo e mantienilo a meno 20 gradi Celsius per un'ora o durante la notte.

Successivamente, centrifugare a 16.000 g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il surnatante e lavare il pellet con etanolo freddo al 70%. Quindi risospenderlo in TE a una concentrazione di un microgrammo di cDNA per 2,5 microlitri.

Per sintetizzare le due sonde, selezionare prima l'RNA polimerasi appropriata. Quindi, preparare la reazione di trascrizione in vitro e portare il volume finale fino a 20 microlitri con acqua trattata con DEPC. Incubare a 37 gradi Celsius per 1,5 ore.

Successivamente, eseguire un microlitro della reazione di trascrizione su un gel di agarosio all'1% per verificare se la reazione ha funzionato. Il gel dovrebbe mostrare il modello lineare e una banda luminosa della sonda. In questa procedura, tagliare sezioni spesse 15 micrometri di tessuto congelato in un criostato.

Raccogliere le sezioni sui vetrini del microscopio e lasciare asciugare i vetrini per un'ora per garantire che i tessuti aderiscano ai vetrini. Il fattore più importante per il buon funzionamento di questa procedura è la qualità delle sezioni. Ciò dipende in parte dall'avere un tessuto ben perfuso e fissato, e in parte dalla tecnica di sezionamento per ottenere sezioni piatte prive di contaminazione da RNasi.

Quindi, diluire le due sonde in un tampone di ibridazione preriscaldato a 65 gradi Celsius e mescolare bene. Applicare 300 microlitri di miscela di ibridazione su ogni vetrino e coprire con un vetrino coprioggetti cotto al forno. Successivamente, incubare i vetrini per una notte a 65 gradi Celsius in una camera umidificata.

Il giorno successivo, trasferire i vetrini in un barattolo Coplin contenente un tampone di lavaggio preriscaldato e lavare i vetrini per 30 minuti, due volte, a 65 gradi Celsius. Successivamente, lavare i vetrini per 10 minuti tre volte con la soluzione di lavaggio MABT a temperatura ambiente. In questo passaggio, usa una penna idrofobica per disegnare cerchi attorno alle sezioni di tessuto.

Quindi incubare i vetrini per un'ora a temperatura ambiente con il tampone bloccante ISH in una camera umidificata. Successivamente, incubare i vetrini per una notte a 4 gradi Celsius con un anticorpo coniugato anti-fitc perossidato al rafano. Quindi, posizionare i vetrini in un barattolo di coplin contenente PBST.

Lavateli in PBST tre volte per 10 minuti ogni volta e sostitueteli ogni volta con PBST fresco. Successivamente, aggiungere tiromide fluorescente ai vetrini e lasciarli per 10 minuti a temperatura ambiente. Metti i vetrini in un barattolo di coplin e lavali in PBST per 10 minuti tre volte.

Successivamente, incubare i vetrini con il tampone bloccante ISH per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, incubare i vetrini per una notte a quattro gradi Celsius con un anticorpo anti-dig coniugato con fosfatasi alcalina. Dopodiché, lavateli con MABT tre volte per 10 minuti ogni volta.

Successivamente, lavare i vetrini due volte con tris HCL 0,1 molare a pH 8,2 per cinque minuti a temperatura ambiente. Filtrare la soluzione rossa veloce e incubare i vetrini a 37 gradi Celsius con la soluzione rossa veloce in una camera umidificata. Poiché il tempo per uno sviluppo ottimale varia, controllare regolarmente i vetrini con un microscopio a fluorescenza per monitorare la formazione di precipitato.

Quindi, lavateli tre volte con PBST per 10 minuti ogni volta. Per eseguire l'immunoistochimica, incubare i vetrini con tampone bloccante IHC per un'ora a temperatura ambiente in una camera umidificata. Successivamente, incubare i vetrini nella soluzione di anticorpi primari a quattro gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, lavare i vetrini con PBST per 10 minuti tre volte. Incubarli nella soluzione di anticorpi secondari a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, lavateli con PBST tre volte per 10 minuti ogni volta.

Successivamente, asciugare parzialmente i vetrini a temperatura ambiente e montarli con un mezzo di montaggio a fluorescenza. Lasciare asciugare i vetrini prima di visualizzarli in un microscopio confocale. Qui sono mostrate le immagini rappresentative di ISH per Aspa e Mbp, seguite dall'immuno-colorazione per OLIG2 combinata con la colorazione a gancio.

L'aspa era espresso in alcune cellule OLIG2-positive per MBP nella corteccia e nel corpo calloso. Alcune cellule Mbp-positive OLIG2-positive non esprimono Aspa. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordarsi di mantenere le fette e tutte le soluzioni prive di contaminazione da RNasi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare i modelli di espressione genica mediante inibizione di N-citrino e immunoistochimica. Questa tecnica può essere adattata a una varietà di tessuti di diverse origini e stadi di sviluppo.