Studi del Virus di riossidazione A in un modello murino di infezione

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è valutare la patogenesi, le risposte umorali e l'efficacia della protezione indotta dai virus dell'influenza A wild-type o dai vaccini antinfluenzali utilizzando un modello murino di infezione. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande sulla biologia dei virus dell'influenza A come la patogenesi virale, le risposte immunitarie e l'efficacia dei vaccini antinfluenzali, nonché l'antivirus. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il topo ha un sistema immunitario simile a quello umano e sono disponibili più ceppi che possono essere sfruttati per valutare le basi genetiche delle infezioni da virus dell'influenza A.

Poiché questo metodo può fornire informazioni sull'efficacia dei nuovi vaccini antinfluenzali, può essere applicato anche a sistemi più vecchi come la valutazione di potenziali trattamenti antivirali, tra cui l'esame di anticorpi o farmaci. Dopo aver allevato e marcato topi C57B6 di età compresa tra sei e otto settimane in condizioni prive di agenti patogeni e aver preparato diluizioni del virus dell'influenza A o IAV in condizioni asettiche. Usa una bilancia per pesare i topi e registrare il peso.

Una volta che un topo è stato anestetizzato e la profondità dell'anestesia è stata verificata secondo il protocollo di testo, posizionare il topo in decubito dorsale. Inserire un puntale per pipetta contenente 30 microlitri di inoculo virale nella narice ed espellere lentamente ma costantemente la soluzione. Per valutare la morbilità e la mortalità, infettare da tre a quattro gruppi di topi femmine con 10 dosi complete di PR8 wild type come descritto nel protocollo di testo.

Monitorare e pesare i topi nei successivi 14 giorni, all'incirca alla stessa ora per ridurre al minimo le variazioni di peso dovute all'ingestione di cibo. Dopo l'eutanasia degli animali sopravvissuti all'infezione virale e il calcolo della dose letale virale del 50% di topo o MLD50 secondo il protocollo di testo. Infettare topi femmina di sei-otto settimane con dosi virali da 10 a 10 alla quarta unità fluorescente o FFU di tipo selvaggio PR8.

Il secondo e il quarto giorno, raccogliere i polmoni del topo e la mucosa nasale per la valutazione. Dopo l'eutanasia degli animali, mettere un animale in decubito dorsale e utilizzare etanolo al 70% per disinfettare il pelo sopra il torace. Usa le forbici per tagliare la pelle dalla base dell'addome allo sterno.

Quindi, con le forbici, fai dei tagli di un centimetro dalla base dell'incisione alle parti laterali del topo. Rimuovere la pelle da tutta la parte superiore del topo fino alla base dell'addome dove è stata praticata la prima incisione. Quindi usa le forbici per tagliare la testa e metterla in una capsula di Petri sterile asciutta.

Usa le forbici per tagliare le giunzioni tra la mascella e la mandibola e scartare la mandibola. Poi, con le forbici, fate due tagli alle estremità degli archi zigomatici e rimuoveteli. Usa una pinza da dissezione per rimuovere gli occhi.

Successivamente, con la pinza di dissezione, afferrare il cranio e utilizzare un bisturi per tagliare il cranio lungo la sutura sagittale. Solleva le due metà del cranio con il cervello per vedere la mucosa nasale. Usando il bisturi, tagliate la parte del cranio con il cervello e scartatela.

Posizionare il resto del cranio con la mucosa nasale in un tubo sterile. Conservare la provetta in ghiaccio se i campioni vengono elaborati lo stesso giorno o congelarla rapidamente su ghiaccio secco se i campioni verranno elaborati in un secondo momento. Per evitare la contaminazione dei campioni, utilizzare un disinfettante a base di biossido di cloro, per pulire e disinfettare gli strumenti di dissezione tra ogni tessuto recuperato e tra ogni dissezione animale.

Quindi, per raccogliere i polmoni, posizionare l'animale in decubito dorsale e utilizzare le forbici per tagliare la plura. Partendo dalla base della gabbia toracica, usa le forbici per tagliare le costole di un centimetro su entrambi i lati dello sterno fino alla parte superiore delle costole. Fai una sezione trasversale con le forbici tra le due incisioni nella parte superiore della gabbia toracica e rimuovi il posto del torace.

Tenere i polmoni con la pinza, fare un taglio alla fine della trachea appena prima dei polmoni e mettere i polmoni in un tubo sterile. Mettere i polmoni o la mucosa nasale in un omogeneizzatore sterile e aggiungere un millilitro di terreno di coltura per l'infezione da freddo. Omogeneizzare il campione muovendo il pestello su e giù per circa un minuto a temperatura ambiente fino a quando i polmoni non sono completamente distrutti.

Mettere il campione omogeneizzato in una provetta sterile. Centrifugare i campioni a 300 x G per cinque-10 minuti a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante in una nuova provetta sterile e gettare il pellet.

Conservare il surnatante a quattro gradi Celsius se la titolazione virale viene eseguita lo stesso giorno. Il giorno prima della titolazione, seminare piastre a 96 pozzetti con cellule epiteliali MDCK in un terreno di coltura tissutale in modo che raggiungano circa l'80-90% di confluenza. Incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica durante la notte.

Per preparare da una a 10 diluizioni dei campioni omogeneizzati di mucosa polmonare o nasale, aggiungere 90 microlitri di terreno di infezione a ciascuno dei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 10 microlitri di surnatante da uno dei campioni omogeneizzati ai pozzetti A1, A2 e A3, per valutare il titolo virale di ciascun campione e triplicare. Quindi, aggiungere 10 microlitri di un altro surnatante dei campioni omogeneizzati ai pozzetti, A4, A5 e A6. Dopo aver aggiunto il surnatante del campione alla riga A, utilizzare una pipetta multicanale per miscelare pipettando su e giù.

Trasferire 10 microlitri dalla fila A alla riga B e mescolare bene. Cambiare le punte tra una diluizione e l'altra e ripetere il trasferimento dalla fila B alla fila C e continuare in modo simile fino a raggiungere l'ultima fila, H.Utilizzando un adattatore multicanale per aspiratore a vuoto, rimuovere il terreno di coltura tissutale dalle cellule MDCK nelle piastre a 96 pozzetti e utilizzare 100 microlitri per pozzetto di 1x PBS per lavare le cellule due volte. Iniziando con le diluizioni più elevate e passando alle diluizioni più basse, trasferire 50 microlitri per pozzetto del surnatante diluito in serie dei campioni omogeneizzati alla piastra a 96 pozzetti delle celle MDCK, trasferendo le diluizioni più elevate dalla fila H alla fila A delle cellule.

Mettere la piastra a 96 pozzetti su una piattaforma a dondolo per un'ora a temperatura ambiente per consentire l'assorbimento virale. Quindi, utilizzando un adattatore multicanale per aspiratore a vuoto, rimuovere l'inoculo e aggiungere 100 microlitri per pozzetto di terreno post-infezione. Incubare le cellule infette per otto ore in un incubatore a 33 gradi Celsius o 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Procedere con il fixing, la colorazione, l'imaging e il calcolo del titolo virale come descritto nel protocollo di testo. In questo esperimento, i topi sono stati infettati con diverse dosi di PR8 wild type. Il peso corporeo e la sopravvivenza di cinque topi per gruppo sono stati misurati fino a 14 giorni dopo l'infezione.

I topi immunizzati con FFU più alto di PR8 wild type, hanno perso peso più rapidamente e gravemente e tutti sono morti di conseguenza. La MLD50 di PR8 wild type in questo esperimento, calcolata con il metodo reed and muench, era 1,5 x 10 alla seconda FFU. Per analizzare le risposte umorali indotte contro l'infezione endovenosa, 14 giorni dopo l'immunizzazione, i topi sono stati dissanguati per analizzare la presenza di anticorpi contro le proteine virali totali e la presenza di anticorpi neutralizzanti che hanno come bersaglio la proteina HA virale, utilizzando un'inibizione dell'emoagglutinazione o HAI e un test di micro neutralizzazione virale o VN.

Come si vede qui, i risultati del test indicano che i sieri per i topi immunizzati con una dose più elevata di PR8 live attenuated Influenza Virus o LAIV avevano titoli anticorpali più elevati contro le proteine PR8 totali rispetto ai sieri di topi immunizzati con una dose più bassa. Utilizzando i test HAI e VN, i sieri di topi con la maggiore quantità di PR8 LAIV avevano un titolo più alto di anticorpi neutralizzanti, mentre il siero di un topo immunizzato con la dose più bassa aveva il titolo più basso di anticorpi neutralizzanti contro PR8. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come infettare i topi con i virus dell'influenza A, come valutare la loro patogenesi, le risposte umorali e immunitarie e la bioreplicazione nel tratto respiratorio superiore e inferiore.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del virus dell'influenza A per esplorare la patogenicità, l'immunogenicità e l'efficacia di protezione dei vaccini con anticorpi vivi, utilizzando un modello murino di infezione.