Dimostrazione di un microscopio Hyperlens-integrato e super-resolution Imaging
8 settembre 2017
L'uso di un hyperlens è stato considerato come una tecnica di imaging ad alta super-risoluzione romanzo a causa di suoi vantaggi nella formazione immagine in tempo reale e la sua attuazione semplice con ottiche convenzionali. Qui, presentiamo un protocollo che descrive la fabbricazione e applicazioni di un hyperlens sferica di imaging.
L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è dimostrare il processo di fabbricazione e l'imaging subdiffrazionale del dispositivo iperlente bidimensionale. Questa innovativa tecnica di imaging a super-risoluzione presenta i vantaggi dell'imaging in tempo reale e di un'implementazione semplice nell'ottica convenzionale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'imaging a super-risoluzione, come l'osservazione di cellule vive e di nanoparticelle dinamiche al di sotto del limite di frazionamento.
L'iperlente è una lente sferica speciale con struttura a più strati che presenta una dispersione iperbolica piatta, in grado di supportare l'amplificazione di informazioni ad alta frequenza e la risoluzione di ottiche simili nel campo lontano in tempo reale. Il vantaggio principale dell'iperlente sferica è che può amplificare informazioni bidimensionali a frequenze visibili. Un'iperlente sferica può inoltre essere facilmente integrata nella microscopia convenzionale senza sistemi aggiuntivi complessi.
La procedura sarà dimostrata da Dasol Lee e Inki Kim, studenti laureati del mio laboratorio. Per iniziare, applicare per centrifugazione il fotoresist positivo sul wafer di quarzo a 2.000 giri al minuto e cuocere per 60 secondi a 90 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare una macchina per il taglio per dividere il wafer rivestito con fotoresist in piccoli pezzi di dimensioni pari a 20 per 20 millimetri quadrati.
Soffiare i pezzi con una pistola ad azoto compresso per rimuovere eventuali particelle derivanti dal taglio. Successivamente, immergere la fettina tagliata in un bagno ad ultrasuoni di acqua deionizzata per cinque minuti a 45 gradi Celsius. Rimuovere lo strato di fotoresist usando un bagno ad ultrasuoni di acetone per cinque minuti a 45 gradi Celsius.
Successivamente, pulire il substrato immergendolo in un bagno ultrasonico di alcol isopropilico per cinque minuti a 45 gradi Celsius. Asciugare il substrato con una pistola ad azoto compresso. Per inciderne il motivo della maschera, caricare innanzitutto i substrati di quarzo puliti in un sistema di evaporazione a vuoto spinto con fascio elettronico.
Depositi lo strato di cromo con una velocità di deposizione di due angstrom al secondo. Premere il pulsante di sfiato per sfiatare la camera. Monti un campione sul portacampione a Focused Ion Beam o FIB utilizzando nastro conduttivo di rame.
Quindi, inserire il portacampioni FIB nella camera FIB. Chiudere la porta della camera e premere il pulsante di pompaggio per evacuare la camera. Selezionare "Beam On" nella scheda di controllo del fascio e impostare la corrente del fascio ionico e la tensione di accelerazione per la modalità FIB.
Accendere il sistema a fascio di ioni. Selezionare "Fascio acceso" nella scheda di controllo del fascio per attivare il fascio di elettroni e mettere a fuoco l'immagine con ingrandimento basso utilizzando il software. Successivamente, impostare la distanza di lavoro a quattro millimetri nella scheda di navigazione in modalità microscopio elettronico a scansione.
Impostare l'angolo di inclinazione del supporto a 52 gradi ed acquisire le immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) a diverse ingrandimenti prima della fabbricazione del modello della maschera con matrice di fori. Nella scheda relativa al patterning, selezionare la regione da strutturare ed eseguire una matrice di fori di 50 nanometri sullo strato di cromo. Al termine, spegnere i sistemi a fascio di elettroni e a fascio di ioni e lasciarli raffreddare.
Premere il pulsante di sfiato per sfiatare la camera con gas azoto. Successivamente, rimuovere il supporto dalla camera. Poi, immergere il substrato strutturato da uno a 10 minuti in etante di ossido tamponato.
Posizionare il substrato strutturato in acqua deionizzata per rimuovere l'incisione tampone. Successivamente, asciugare il campione con gas azoto compresso. Immergere il substrato strutturato nell'incisione per il cromo per rimuovere lo strato maschera di cromo.
Infine, inserire il substrato strutturato in acqua deionizzata per cinque minuti per pulirlo. Premere il pulsante di sfiato del sistema di evaporazione a fascio di elettroni e attendere fino al termine della fase di sfiato. Successivamente, caricare il substrato strutturato in un sistema di evaporazione a fascio di elettroni ad alto vuoto dopo la fase di sfiato.
Chiudere la porta della camera ed evacuare la camera premendo il pulsante della pompa. Depositare lo strato di argento con una velocità di crescita di un angstrom al secondo e depositare uno strato di argento spesso 15 nanometri. Dopo il deposito dello strato di argento, raffreddare il substrato per cinque minuti.
Modificare il portacampione del sistema di evaporazione a fascio elettronico selezionando un altro crogiolo e depositare lo strato di ossido di titanio con una velocità di crescita di un angstrom al secondo. Successivamente, depositare uno strato di ossido di titanio spesso 15 nanometri. Al termine del deposito dello strato di ossido di titanio, raffreddare il substrato per cinque minuti.
Ripetere i passaggi di deposizione per decine di cicli al fine di depositare un multistrato di argento e ossido di titanio. Cambiare la tasca del sistema di evaporazione a fascio di elettroni e depositare lo strato di cromo a uno spessore di 50 nanometri. Al termine del deposito dello strato di cromo, spegnere il sistema di evaporazione a fascio di elettroni.
Premere il pulsante di sfiato e sfiatare la camera introducendo gas azoto. Dopo lo sfiato, aprire la porta della camera ed estrarre il supporto del montaggio dalla camera. Rimuovere il dispositivo iperlente realizzato.
Quindi, chiudere la porta della camera ed evacuare la camera premendo il pulsante della pompa. Montare l'iperlente depositato con cromo nel sistema di lavorazione FIB e realizzare una struttura di dimensioni nanometriche seguendo le istruzioni del produttore. Successivamente, posizionare un microscopio ottico tradizionale di tipo a trasmissione sul tavolo ottico.
Collegare una sorgente di luce bianca al percorso di illuminazione del microscopio utilizzando un adattatore. Posizionare un filtro ottico passabanda centrato a 410 nanometri. Selezionare un obiettivo ad immersione in olio ad alto ingrandimento e utilizzare una telecamera CCD di alta qualità per acquisire le immagini.
Posizionare una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo. Infine, posizionare un iperlente sullo stadio del campione e acquisire le immagini. Qui è mostrato un iperlente composto da strati multipli alternati di argento e ossido di titanio.
L'immagine della sezione trasversale mostra che il multistrato di film sottile di argento e ossido di titanio viene depositato con uno spessore uniforme sul substrato di quarzo emisferico. Una iperlente costituita da argento e ossido di titanio presenta ottime prestazioni alla lunghezza d'onda di 410 nanometri poiché la relazione di dispersione dei multistrati sovrapposti presenta una curva di dispersione iperbolica, come mostrato qui. Componenti d'onda con elevato vettore d'onda spaziale possono propagarsi lungo la direzione radiale dell'iperlente.
Le piccole caratteristiche con componenti ad alta frequenza, che non possono essere catturate dall'ottica convenzionale, possono propagarsi nel campo lontano attraverso l'iperlente, come calcolato mediante simulazione a elementi finiti. Dopo la fabbricazione, l'iperlente può essere integrato nel sistema microscopico convenzionale, come mostrato in questo semplice schema del sistema di imaging con iperlente. L'iperlente viene posizionato sull'obiettivo.
Per dimostrare il funzionamento dell'iperlente, un modello artificiale viene inciso sulla superficie interna dell'iperlente. I risultati mostrano le immagini acquisite attraverso l'iperlente. Le dimensioni degli intervalli variano da 160 nanometri a 180 nanometri in ciascun caso.
Le caratteristiche subdiffrazionali vengono risolte e il potere super-risolutivo dell'iperlente può essere confermato. Lo sviluppo dell'iperlente ha aperto la strada alla tecnica di imaging a super risoluzione per esplorare macchinari biomolecolari su scala nanometrica e nanoparticelle inorganiche. Dopo aver visto questo video, si potrà avere una buona comprensione di come realizzare un iperlente di alta qualità e allestire il proprio sistema di imaging a super risoluzione.
Ci si aspetta che la tecnica dell'iperlente sarà migliorata in termini di praticità adottando un metodo di fabbricazione scalabile e riproducibile. L'iperlente permetterà agli scienziati di osservare in tempo reale dinamiche biofisiche che avvengono a scala nanometrica e di operare come tecnologia di imaging super-risolutiva di nuova generazione in diverse applicazioni come biologia, scienze mediche, scienze dei materiali e nanotecnologie.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la fabbricazione e le applicazioni di imaging di una lente ipersferica, una nuova tecnica di imaging a super-risoluzione. La lente iperbolica offre vantaggi nell'imaging in tempo reale e può essere facilmente integrata con ottiche convenzionali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immagini a super-risoluzione
- Ingegneria ottica
- Tecniche di microscopia
Sfondo
- L'iperlente è una lente sferica con una struttura a strati multipli.
- Permette l'amplificazione di informazioni ad alta frequenza.
- Le capacità di imaging in tempo reale rappresentano un vantaggio significativo.
- È in grado di risolvere informazioni ottiche nel campo lontano.
Scopo dello studio
- Illustrare il processo di fabbricazione del dispositivo iperlente.
- Evidenziarne l'applicazione nell'imaging subdiffrazionale.
- Affrontare domande fondamentali nell'imaging a super-risoluzione.
Metodi Utilizzati
- Realizzazione di un dispositivo iperlente bidimensionale.
- Integrazione con sistemi microscopici convenzionali.
- Acquisizione di immagini in tempo reale di cellule vive e nanoparticelle dinamiche.
- Utilizzo della dispersione iperbolica per l'ingrandimento.
Risultati principali
- L'iperlente sferica ingrandisce efficacemente informazioni bidimensionali.
- Funziona a frequenze visibili.
- Capacità dimostrata di imaging al di sotto del limite di diffrazione.
- Integrazione riuscita con sistemi ottici esistenti.
Conclusioni
- L'iperlente sferica è uno strumento promettente per l'immagine a super risoluzione.
- Semplifica il processo di imaging mediante ottiche convenzionali.
- Applicazioni potenziali nell'imaging biologico e nella nanotecnologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
L'imaging a super-risoluzione supera il limite di diffrazione presente nella microscopia convenzionale, permettendo la visualizzazione di strutture subcellulari e processi dinamici con risoluzione nanometrica. La tecnica della iperlente sferica consente un'acquisizione in tempo reale in campo lontano, con un'integrazione semplice nei sistemi ottici esistenti, riducendo la complessità tecnica dei flussi di lavoro di scoperta. Questa capacità supporta la validazione degli bersagli e la riduzione del rischio meccanicistica, consentendo l'osservazione diretta delle interazioni molecolari e del comportamento delle nanoparticelle in ambienti cellulari vivi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche risolvendo caratteristiche subcellulari al di sotto del limite di diffrazione.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale dei bersagli mediante la visualizzazione diretta della dinamica molecolare in cellule vive.
- Valore predittivo: Aumenta l'affidabilità degli studi sull'interazione con il bersaglio fornendo immagini in tempo reale e senza marcatori del traffico dei nanoparticellati.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening ad alto contenuto abilitando l'imaging nanometrico quantitativo.
- Riproducibilità: Fornisce letture standardizzate e in tempo reale in diverse condizioni sperimentali grazie a un'ingrandimento costante in campo lontano.
- Integrazione della piattaforma: Facilita la valutazione scalabile di composti mediante compatibilità con microscopia convenzionale e obiettivi a immersione in olio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Consente l'immagine di cellule vive e nanoparticelle dinamiche, supportando la scoperta traslazionale di biomarcatori nella nanomedicina.
- Continuità preclinica: Collega la scoperta alla validazione preclinica risolvendo i meccanismi subcellulari in modelli rilevanti per le malattie.
- Decisioni basate sul rischio: Guida le scelte di sviluppo visualizzando la distribuzione delle nanoparticelle e i meccanismi di internalizzazione cellulare.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo dell'iperlente si inserisce nel percorso della scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'identificazione del composto promettente e ai successivi studi preclinici, consentendo l'analisi con risoluzione nanometrica a ogni stadio.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la risoluzione di strutture subcellulari e complessi molecolari.
- Screening: Fornisce output quantitativi pronti per saggi per lo screening di composti mediante imaging in tempo reale con risoluzione subdiffrazione.
- Analisi: Genera misurazioni spaziali e temporali della dinamica delle nanoparticelle e delle interazioni molecolari per analisi comparativa.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici attraverso l'imaging di cellule vive e del comportamento delle nanoparticelle in modelli rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma di imaging riutilizzabile in diversi progetti grazie all'integrazione semplice con microscopi standard.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica consentendo l'osservazione diretta di processi biologici a livello nanometrico.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso protocolli di fabbricazione e acquisizione delle immagini costanti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale riducendo i rischi biologici in fasi avanzate grazie a una validazione precoce a livello nanometrico.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio visualizzando l'interazione con la proteina bersaglio e l'efficacia delle nanoparticelle in condizioni simili all'ambiente in vivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella deposizione di film sottili, nell'evaporazione con fascio di elettroni e nella fresatura con fascio ionico focalizzato.
- Necessita dell'accesso a sistemi di deposizione ad alto vuoto, strumentazione FIB e microscopia ottica con obiettivi ad immersione in olio.
- Impone una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i parametri di fabbricazione e le condizioni di acquisizione delle immagini, al fine di garantire la riproducibilità.
- Richiede considerazioni di adattamento per diversi campioni biologici e tipi di nanoparticelle, a causa delle dipendenze dal substrato e dalla lunghezza d'onda.
- È limitato dalla necessità di un controllo preciso dello spessore dei multistrati e dal funzionamento specifico per lunghezza d'onda (ad esempio, 410 nm), come dimostrato nel protocollo.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Substrate Preparation
8:51
Conclusion
7:11
Results: Fabrication Results and Capability of Super-resolution Imaging of the Hyperlens
2:18
Etching the Mask Pattern, Wet-etching Process, and Removal of the Mask Layer
4:29
Multilayer Deposition, Nano-sized Object Inscription, and Imaging
